İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Özet

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Özet

Gebelik yeniden üretici dokularda ve maternal-fetal arayüzünde lökositlerin (Desidua basalis ve Desidua parietalis) infiltrasyonu ile karakterize edilir. Bu arayüz maternal ve fetal dokular arasındaki temas anatomik sitedir; bu nedenle, gebelik sırasında eylem bir immünolojik sitedir. Maternal-fetal arayüzünde infiltre lökositler teslimat merkezi implantasyon rol, gebelik bakımı ve zamanlama oynarlar. Bu nedenle, bu lökositlerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep mekanizmalarına fikir verecektir. Birçok protokol Desidua basalis ve Desidua parietalis gelen lökositlerin infiltre izole etmek için de tarif edilmiştir; bununla birlikte inkübasyon, reaktifler, enzimler ve belirli bir süre içinde düzenli olmaması zor bu sonuçları karşılaştırma yapar. Burada tarif edilen yumuşak mekanik ve enzimatik diss kullanımını birleştiren yeni bir yaklaşımdırociation teknikleri maternal fetal ara yüzeyde insan dokularından izole edilen lökosit hücre dışı ve hücre içi işaretlerinin canlılığı ve bütünlüğünü korumak için. Kenara immünofenotiplendirme, hücre kültürü ve hücre sıralama gelen, bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok sayıda ve çeşitlidir. Bu protokol, izole edilmiş DNA, lökosit nitro lökosit işlev (yani, fagositoz, sitotoksisite, T-hücresi çoğalması ve plastiklik, vs.) metilasyonu, hedef genlerin ekspresyonunu, ve reaktif oksijen türlerinin üretimini belirlemek için kullanılabilir maternal-fetal arayüzünde. Ayrıca, açıklanan protokolünü kullanarak, bu laboratuar maternal-fetal arayüzünde yeni ve nadir lökosit tanımlamak mümkün olmuştur.

Giriş

Gebelik üç ayrı aşamadan immünolojik ile karakterize edilir: 1) implantasyon ve pro-enflamatuar yanıt ile ilişkili erken plasenta (yani, implantasyon, bir 'açık yara' benzeyen); 2) ikinci trimester ve bağışıklık homeostazı maternal-fetal arayüzünde ağırlıklı anti-inflamatuar devlet yoluyla elde edilir gebeliğin üçüncü trimesterde en; ve 3) doğum, bir pro-inflamatuar durum ^1-7. Bağışıklık hücreleri maternal-fetal arayüzünde inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar nerede onların bereket ve gebelik süresince ^6-9 yerelleştirme değişim.

İnsanlarda, maternal-fetal arayüz anne (desidua) ve fetal (koryon veya trofoblast) dokular arasındaki doğrudan temas bir alanı temsil eder. 1) desidua hatları uterin kavite plasenta kapsamında değil parietalis ve yan yana olan: Bu arayüz içerirkoryon laeve için; ve 2) interstisyel trofoblastlar ¹⁰ (Şekil 1) tarafından işgal plasenta bazal plaka bulunan desidua basalis. temas bu alanların samimiyet maternal bağışıklık sistemi ^11-13 fetal antijenik maruz kalma koşulları yaratır. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, lökositlerin normal stromal tipi hücreler ve bez hücrelerinde ^8,14,16 ilave olarak desidual hücrelerde ^8,9,14,15% 30-40 kadar içermektedir. maternal-fetal arayüzünde lökositlerin rolü trofoblast invazyonu ¹⁷ sınırlandırılmasına spiral arterlerin ^18,19 yenileme, anne hoşgörü ^12,20 bakım ve emek ^21-26 başlatılmasını dahil çoklu süreçleri kapsar. Uyarlanabilir ve örneğin, T hücreleri, makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, dendritik hücreler ve NK hücreleri, desidual dokularda tespit edilmiştir bağışıklık sistemi, doğuştan gelen uzuvlar, ve bunların her ikisinin de Lökositleroranlar ve aktivasyon durumu gebelik ^{6-10,12,14,24,27-30} boyunca mekansal ve zamansal olarak değişir gösterilmiştir. Lökosit nüfus ve / veya işlev tedirginlikler spontan abortus ³¹ preeklampsi ^32, intrauterin gelişme geriliği ^32,33 ve preterm eylem ^7,24 ile ilişkilidir. Bu nedenle, insan maternal-fetal arayüzünde fenotipik özellikleri ve lökositlerin işlevselliği çalışma gebelik bozukluklarında disregüle immünolojik yolların açıklanmasını kolaylaştıracaktır.

Birden parametrelerin eş zamanlı olarak ^34-36 kantitatif analiz sağlar akım sitometri olan fenotip ve lökositlerin işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılan en güçlü araçlardan biri, teknoloji. Akış sitometrisi ile lökosit analiz etmek için, tek hücreli bir süspansiyon içinde lökositlerin izolasyonu gereklidir. Bu nedenle, bir yöntem, leu infiltre ayırmakmaternal-fetal arayüzden kocytes kendi fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini incelemek için gereklidir.

Çeşitli yöntemler, insan maternal-fetal arayüz ^{10,14,25,27,37-39} gelen lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bazı mekanik ayrıştırılmasına yönelik çabalara ^10,25,27,38 geçerli olsa da, diğerleri doku ayrılma için enzimatik sindirimi ^37,40 kullanın. Mekanik parçalanma daha düşük bir verim ve düşük canlılığı ⁴¹ ve canlılık ve hücre yüzeyi işaretleme tutma ⁴² etkileyebilir enzimatik dissosiasyonunu için, burada tarif edilen yöntem, hücre canlılığını tehlikeye atmadan izole lökositlerin verimini artırmak için enzimatik ön-muamele ile hafif mekanik bir ayrışma birleştirir. Yöntemlerin de benzer bir kombinasyonu maternal fetal arabirim ³⁹ ile desidual dokulardan lökositlerin izolasyonu ile etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol mekanizmalarını içermektedirkarşıt neşter, tıraş bıçakları, veya cerrahi makas ^10,28 geleneksel kıyma haline gelme işleminde göre zaman ve emek tasarrufu sağlarken tutarlılığını artırır otomatik doku dissociator ile nical parçalanma. Doku Ayrılma için seçilen enzim Accutase oldu. Yaygın olarak kullanılan kollajenaz ⁴³ aksine ⁴⁴ dispase ve tripsin ⁴⁵ Accutase (hücre dekolmanı çözeltisi) genel proteolitik ve verimli henüz nazik ayrılma ^46,47 katkıda kolajenolitik faaliyetleri hem birleştirir. Ayrıştırmadan sonra, lökosit yoğunluk gradyan santrifüjü ile desidual hücrelerin toplam popülasyonundan zenginleştirilmiştir. Çeşitli yoğunluk gradyan Ortam daha önce Percoll (koloidal silis taneciklerinin bir süspansiyon), ⁴⁸ ve Ficoll (yüksek sentetik bir molekül ağırlığına sahip olan, sukrozun bir polimer) ⁴⁹ En yaygın olanı, kullanılmıştır. sakaroz polimerin tarafından tecrit üstün verim onceki olmuşturusly ⁵⁰ gösterilmektedir, ve burada daha fazla tarif protokolü bu yoğunluk gradyan ortam mononükleer lökositlerin yeterince yüksek saflığa ürettiğini kanıtlamaktadır.

Bu nedenle, burada tarif edilen bir protokol, insan desidual dokularından lökosit izole etmek için bir yoğunluk gradyan ortam (1.077 + 0.001 gr / ml) ile otomatik bir doku aynştıncı, bir hücre ayırma çözeltisi ile enzimatik sindirme ve lökosit ayırma mekanik doku parçalanmalanna birleştirir. Bu protokol, hücre canlılığı ile birlikte hücre yüzey antijenlerini korumak için kanıtlanmıştır. İzole lökosit akış sitometrisi ve in vitro fonksiyonel çalışmalar ile immünofenotıpleme birden fazla uygulama için de kullanılabilir.

Protokol

Bu protokol, akış sitometrisi ile, immünofenotipik hazırlık Desidua basalis ve Desidua parietalis lökosit izolasyonu için uygundur. Bundan başka, izole edilen hücreler hücre sıralama, hücre kültürü, RNA izolasyonu ve sitoloji için kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen numuneler ile çalışmaya başlamadan önce, insan etik onay Yerel Araştırma Etik Kurulu ve Kurumsal Gözden Kurulları alınmalıdır. toplanması ve araştırma amaçlı insan örneklerinin kullanılması Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi (NICHD) Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Kurumsal İnceleme Kurulları, Sağlık (NIH) National Institutes of, Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı (DHHS tarafından kabul edildi , Bethesda, MD, ABD) ve Wayne State Üniversitesi (Detroit, MI, USA). Yazılı bilgilendirilmiş onam önce doku örneklerinin toplanması için tüm hamile kadınların elde edilmiştir.
NOT: Hayvan kanı, hücreleri, ya da tehlike ile çalışırkenBu protokolde belirtildiği gibi lı ajanlar, doğru biyogüvenlik ve laboratuvar güvenliği eylemleri takip edilmesi esastır.

İnsan Desidual Dokuların 1. Diseksiyon

NOT: Bazal plaka tabanı altında ve plasenta bağlı olduğu ve anne yüzeyi temsil eder. chorioamniotic membranlar amniyon ve koryon bulunmaktadır. bazal plaka desidua basalis içerir ve koryon desidua parietalis (Şekil 1) içerir.

1. Desidua Basalis
   1. Plasenta (Şekil 1A ve 1B) bir kotiledondan taban levhasının bir parça teşrih.
   2. Yukarı bakacak şekilde plasental villus ile steril bir kesme tahtası üzerine yerleştirin. plasental villus gösteren tarafı genellikle görünüşte kıllı doku ile kanlı kırmızı. bazal plaka pürüzsüz ve kırmızı renkli solgun.
   3. Vill çıkarmak için keskin, ince nokta makas ve forseps kullanınlı doku ve kan damarları. Süreç (Şekil 1C) sırasında (serbest - - ^{2 +} ve Mg Ca ²⁺⁾ 1x PBS batırılmış doku tutun. Bu parçaların 2-3 toplayın ve kan (Şekil 1D) kaldırmak için 1x PBS ile iyice durulayın.
2. Desidua Parietalis
   1. Chorioamniotic membran bir parça teşrih (yaklaşık 10 cm, 10 cm, Şekil 1E x). Koryon yukarı bakacak şekilde gemide yerleştirin. koryon tarafı kanlı pıhtıları içerir ve genellikle sarımsı renkte ışık.
   2. Mümkün (Şekil 1E) olarak kan pıhtılaşması gibi birçok kaldırmak için ince nokta forseps kullanın. 1x PBS berrak bitene kadar membran aşırı kan temizlemek için steril 1x PBS membran durulayın.
   3. Yavaşça zardan desidual katman kazımak için tek kullanımlık steril hücre kazıyıcı kullanın. Mem steril 1x PBS Uygulabrane bu süreci (Şekil 1F) tamamlarken. Desidual dokuları toplamak ve steril 1 x PBS (Şekil 1G), bir 50 ml plastik tüp içine yerleştirin.

2. Mekanik Ayrıştırma ve Enzimatik Sindirim

1. Bir 50 ml'lik plastik bir tüp içinde, steril 1 x PBS ile (Aşama 1.1.3 den) Desidua basalis kesilerek doku ya da (Kademe 1.2.3 den) Desidua parietalis yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet doku toplanır.
2. Dikkatlice pelet bozmadan doku pelet üzerinde bulunan süpernatant aspire.
   NOT: kırmızı kan hücreleri içerdiğinden bu noktada, pelet çok gevşek. Pelet hacmi veya 3 mi ise, hücre ayırma çözeltisi, 6 ml, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış pelet yeniden askıya. Pelet hacmi 3 ml büyükse, daha fazla hücre dekolmanı çözüm eklemek (th yaklaşık 2 kat eklemekdoku örneklerinin e hacmi).
3. Bir Cı tüpüne homojenize dokular (Desidua basalis + hücre dekolmanı çözelti veya Desidua parietalis + hücre sıyrılma çözeltisi) aktarın.
4. Otomatik dissociator C tüpü yerleştirin ve ilgili programı çalıştırın.
   NOT: desidua bazalisin program çalıştırmak başına 668 toplam mermi ile 17 saniye boyunca çalışır. desidua parietalis program çalıştırmak başına 235 toplam mermi ile 37 saniye boyunca çalışır. Bu programlar desidua bazalisin ya da iyi verim ve hücre canlılığı ile desidua parietalis gelen lökosit izole etmek için özelleştirilmiş edilmiştir.
5. Örneğin Accutase gibi ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma çözeltisi ile dokuları sindirmek, dokuların mekanik parçalanmalanna sonra; Hafifçe çalkalama ile 37 ° C'de 45 dakika boyunca (proteolitik ve kolajenolitik enzimleri içeren bir kokteyl).

Lökosit 3. İzolasyonu

1. İnkübasyondan sonra, Dige 1x 10 ml PBS ilavestion Karışım bir 50 ml plastik tüp içine, bir 100 mikron hücre süzgecinden geçirilir. Sindirim karışımı yapışkanlığının bağlı olarak, bir tek bir karışım için çok sayıda hücre gericileri kullanmak gerekebilir.
2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de 1 x PBS ile tüp ve santrifüj doldurun. Dikkatli bir şekilde, hücre peletleri üzerinde 1x PBS çıkarın ve buz gibi soğuk FACS tampon maddesi, 5 ml pelet yeniden askıya.
   NOT: 6.1 adıma gidin, birlikte polimorfonükleer ve mononükleer lökosit incelemek için; mononükleer lökosit incelemek için, 3.3 Adım ile devam edin.
3. 15 ml plastik tüp 20 ila% 5 ml yoğunluk gradyan ortamı (1.077 + 0.001 gr / ml) ilave edin ve yavaş yavaş yoğunluk gradyan medyanın üstüne hücre süspansiyonu kaplar. Örnek katman iken, hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan ortamı karıştırmak için önemlidir.
4. Frensiz 4 ˚C 30 dakika boyunca 500 xg'de bir salıncak-out rotorlu santrifüj. Bu hücreleri ve l karışmasını önlemek için fren kapatmak için çok önemlidirdegrade Osing. Lökositler yoğunluk gradyan medya ve FACS tampon arasındaki arayüz bulunacaktır.
5. Bir pipet kullanarak çok dikkatli FACS tampon ve hücre artıkları içeren üst katmanı kaldırın. arayüzde bandı desidual mononükleer hücreleri ve polimorfonükleer lökositlerin bir kısmını içerir.
6. Yeni bir 15 ml'lik plastik tüp tamamen Ara yüzeydeki hücreleri aktarın. FACS tampon, en az 3 kat daha fazla hacim.
7. Hücreleri topaklaşmasına 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de bir santrifüj ile hücreler topaklaşmasına.
   NOT: Adım 6, bkz immünofenotıpleme gerçekleştirmek için adım 5. bkz hücre sıralama gerçekleştirmek için adım 4'e bakın, hücre kültürü gerçekleştirmek için.

4. Uygulamalar - Hücre kültürü

1. USI canlı hücreleri sayın RPMI kültür ortamı 1640 1 ml Adım 3.7 hücreleri yeniden askıyaOtomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözüm% 0.4 ng.
2. 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonunu yapmak için RPMI kültür ortamı miktarı kadar ekleyin. Hücreler artık kültür için hazırız.

5. Uygulamalar - Birincil Hücre Kültürü için Makrofagların izolasyonu

1. Manyetik CD14 mikro boncuklar (10 ⁷ hücre başına 20 ul boncuklar) ile Aşama 3,7 hücreleri etiketlemek, CD14 + hücreler izole edilmesi için, 15 ° C'de 4 dakika, ve manyetik bir alan uygulanması ile diğer hücre tiplerinden ayrı CD14 + hücrelerinin inkübe edilir. MACS tamponu ve manyetik alanın ayrılması ile 2 kez yıkamadan sonra, MACS tamponu ile manyetik muhafaza CD14 + hücreler elüte.
2. Santrifüj sonrasında yeniden askıya hücreleri kaplama (Şekil 2) için hazır olan RPMI 1640 kültür ortamında, hücre peletleri.

6. Uygulamalar - İmmünofenotipleme

1. Immunophenot hücreleri kullanmak içinyping, 1 x PBS içinde 1 ml Aşama 3.7 hücreleri yeniden askıya. Otomatik hücre sayıcı veya hemasitometre ve tripan mavisi çözeltisi% 0.4 kullanılarak canlı hücreleri saymak.
2. Bir fixable canlılığı boya (Şekil 3) ile hücrelerin etiketleyin. FACS tamponu ile hücreler iki kez yıkayın ve leke tampon hücreleri yeniden askıya. 4 ° C'de 15 dakika boyunca bir FcR engelleyicisi ile inkübe edin.
3. Florokromların konjüge hücre dışı antikor ekleyin. Örneğin, bu protokolde, anti-CD3 kullanımı, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 ve anti-CD56 antikorları (Tablo 1). Karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
4. 1x PBS ile 2 kez yıkamadan sonra, hücreler, bir akış sitometrisi kullanılarak boya tamponu 500 ul analiz edilecektir. Desidual dokularda bulunan lökosit alt popülasyonları analiz etmek için kullanılan yolluk stratejisinin bir temsili Şekil 4'de gösterilmektedir.

Sonuçlar

. maternal fetal ara yüzeyde insan dokularıyla (Desidua basalis ve Desidua parietalis) disseksiyon Şekil 1 'de gösterilen bu prosedür, Desidua basalis (- D Şekil 1 A) içeren taban plaka, diseksiyon içerir. Desidua basalis taban plakasına (Şekil 1C) plasental villi (fetal yan) çıkarılması ile elde edilir. Desidua parietalis yavaşça koryonik membran (Şekil 1E - F) kazınarak toplanır. 2 manyetik hüc...

Tartışmalar

İnsan maternal-fetal arayüzünde lökositler infiltre fonksiyonel ve fenotipik özelliklerinin karakterizasyonu gebelik bozukluklarına sebep bağışıklık mekanizmalarının anlaşılması için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik ^{10,14,25,28,37,42,43} boyunca insan maternal-fetal arayüzünden lökositleri izole etmek için tarif edilmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri farklı olan, her zaman izole edilmiş hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzim veya enzim kombinas...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 ml safe-lock conical tubes	Any vendor
50 ml conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 ml round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30 μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15 ml safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml)
Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator