المباشرة ماوس الصدمة / حرق نموذج منتبذ التعظم

Summary

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Abstract

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

Introduction

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

Protocol

بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا صارم مع ممارسة الحيوان جيدة كما هو محدد في المبادئ التوجيهية الواردة في دليل لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية: الطبعة الثامنة من معهد مختبر أبحاث الحيوان (ILAR، 2011)، وكانت التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ميشيغان (PRO0001553).

1. ماوس العمليات الجراحية

ملاحظة: استخدام 8-10 أسبوع C57BL القديمة / 6 الفئران. ويمكن أيضا أن الأعمار الأخرى، والخلفيات، وسلالات من الفئران يمكن استخدامها لاختبار ظروف مختلفة أو وراثية الماكياج. للجزء بضع الوتر الإجراء، والحفاظ على ظروف معقمة باستخدام قناع الوجه، غطاء محرك السيارة الشعر، وثوب معقمة، والقفازات، والصكوك. مواقع الجراحية وينبغي إعداد sterilely مع بوفيدون اليود واللف العقيمة. تجنب انخفاض حرارة الجسم عن طريق استخدام وسادة التدفئة البيطرية وارتفاع درجة حرارة حلول الإنعاش إلى 37 درجة مئوية قبل administraنشوئها.

1. تخدير الماوس باستخدام 2.5٪ الأيزوفلورين استنشاقه. استخدام مخروط الأنف لمغادرة ظهر وهند-أطرافه يمكن الوصول إليها بسهولة. ضبط معدل الإدارة الأيزوفلورين للحفاظ على معدل التنفس المناسب والتلون من الأغشية المخاطية وضمان التخدير عن طريق فحص العضلات، قرصة أخمص قدميه، ومنعكس القرنية. تطبيق مرهم للعين للعيون لطيف الماوس، لمنع الإصابة جفاف العين أثناء العملية. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الكافية استخدام وسادة التدفئة البيطرية أو دائري ماء دافئ تحت الجراحي الميداني.
2. إدارة البوبرينورفين، 0.1 ملغم / كغم، تحت الجلد مباشرة قبل عملية جراحية لتسكين الألم.
3. حلق بشكل وثيق موقع الجراحية على مخلب هند اليسار باستخدام كليبرز من كعب إلى الركبة.
4. عن كثب حلق ظهر من الفأرة، بدأت على العمود الفقري وتمتد منطقة حلق إلى الجهة اليسرى من خط الوسط الظهرية، وتطهير مساحة لا تقل عن 2 سم × 3 سم لاستيعاب حروق.
5. إعداد موقع الجراحية، بما في ذلك مخلب هند إلى الركبة باستخدام 3 بالتناوب بوفيدون اليود الدعك.
6. إجراء شق طولي على طول الجانب الأنسي في وتر العرقوب نقاط. تمديد شق ذلك على وتر أخيل يمكن تصور بسهولة. حوالي 0.5 سم.
7. إجراء بضع الوتر أخيل مع تشريح حاد في وتر في منتصف مع مقص حاد الأنسجة. إدراج شفرة واحدة من مقص الأنسجة في الطائرة الأنسجة تحت وتر وتشريح على طول الطائرة حتى النصل في منتصف وتر. إغلاق شفرات مقص لقطع وتر بشكل حاد.
   ملاحظة: تأكد من إدراج كل الأوتار الخلفية بما في ذلك الساق، النعلية، والأوتار الأخمصية.
8. تحقيق الإرقاء عن طريق الضغط مع شاش معقم (يجب أن يكون هناك الحد الأدنى من النزيف) وإغلاق شق الجلد مع غرزة 5-0 VICRYL.
9. أداء ظهري حرق سمك جزئي مع كتلة الألومنيوم وزنها 35 غ مع measuremen التقريبيةTS 2 سم × 2 سم × 3 سم تسخينها إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي تطبيقها على ظهر حليق من الفأرة لمدة 17 ثانية.
   ملاحظة: تحقيق عمق الحرق المناسب من قبل يستريح كتلة على رأس الماوس تخدير، وضمان أن مساحة كاملة من كتلة على اتصال مع الماوس، ولكن تجنب تطبيق أي ضغط إضافي للكتلة، أي تسمح خطورة لتكون القوة الوحيدة عقد الكتلة في المكان. مقبض من البلاستيك رقيقة تعلق على جانب واحد من كتلة مريحة للتلاعب، وتحقيق الاستقرار، واسترجاع من حمام الماء الساخن. هذا سيخلق حرق مساحة سطح الجسم الكلي حوالي 30٪ في 8-10 أسبوع من العمر C57BL / 6 الماوس. وقد تم اختيار هذا الحرق الاتصال عبر وسائل أخرى (لهب تحرق أو حرق) نتيجة لتوحيد عمق الحرق على الجرح والتكاثر بين الحيوانات.
10. تجفيف موقع الحرق بشاش وتطبيق الملابس tegaderm.
11. إدارة سوائل الانعاش درجة حرارة: أفرز اللبن قارع الأجراس في حل 1 ملالحقن داخل الصفاق و 0.5 مل الحقن تحت الجلد. هذه الإدارة لمرة واحدة الإنعاش كافية للتعافي من إصابة الحروق وبضع الوتر.
    ملاحظة: لا عودة الفئران تخدير لأقفاص السكن مع الفئران الأخرى، منزل على حدة في أقفاص نظيفة تحت المراقبة حتى تعافى تماما الفئران. يحدث الانتعاش نموذجية ضمن 1-6 ساعة. مواقع الحروق تشفى عادة خلال 2-4 أسابيع ونادرا ما تتعقد بسبب عدوى الجرح إذا كان يحتفظ بها في بيئات السكن نظيفة.
12. إدارة البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ من الحقن تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد العملية. مراقبة نمو HO مع بالاشعة μCT التسلسلية على فترات مناسبة. نمو العظام خارج الرحم هو أول حوالي 3 أسابيع واضحا بعد العملية التي μCT.
    ملاحظة: غالبية تطوير HO كاملة بنسبة 9 أسابيع بعد العملية. لم نلحظ تغييرا في حجم HO أو الموقع مع تكرار μCT بمسح مرتين أسبوعيا لمدة 15 أسبوعا مقارنة مع نهاية نقطة واحدة μCT مسح في 15 أسبوعا.في نهاية التجارب، الموت ببطء كل الفئران مع CO ₂ الاستنشاق وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والتحقق من الموت مع خلع عنق الرحم بعد 10 دقيقة.

2. μCT اقتناء وتحليل

1. تأمين الماوس تخدير على السرير الماسح الضوئي في وضعية الانبطاح. الشريط أطرافه الخلفية بشكل آمن إلى السرير لمنع التنفس الحركة قطعة أثرية. تشمل الهواء والماء وتحتوي على هيدروكسيباتيت الوهمية تحت الماوس لصورة المعايرة.
2. فتح برنامج تحليل العظام وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي يضم كلا من الأطراف الخلفية من مفصل الورك بشكل قريب إلى غيض من مخلب الخلفيتين بشكل أقصى. الحصول على صورة باستخدام المعلمات التالية: 80 كيلو فولت، 500 أمبير والتعرض 1300 مللي ثانية، 48 ميكرون حجم فوكسل ^14،15
3. معايرة الصورة لوحدات هاونسفيلد (HU) عن طريق رسم ROI في كل دائرة من الدوائر الوهمية الثلاثة وإدخال متوسط ​​الكثافة في الحقول المناسبة فيالبرنامج.
4. باستخدام أداة "المختطف" في البرنامج، وإعادة توجيه الصورة بحيث الساق من أطرافه هند الأيسر هو مواز على طول محور Z للسماح أوضح رأي التشريحية لترسيم الهياكل العظمية القشرية مثلي وHO.
5. ابتداء من الركبة، انتقل بشكل أقصى من خلال شرائح الصورة حتى مصادفة HO. باستخدام أداة شريحة اليدوية، وجعل العائد على الاستثمار في جميع أنحاء العظم خارج الرحم على كل شريحة ^ال 5 المستمرة بشكل أقصى من خلال مخلب أو حتى يتم تجاوز HO. استخدام أداة استقراء لتوسيع وغرزة رويس معا في ROI واحد يحتوي على جميع HO.
6. جعل ROI 3D واختيار القائمة التحليل. حساب حجم العظام من خلال تحديد قيم العتبة الدنيا والعليا التي تظهر أفضل نافذة العظام. استخدام نفس القيم الحدية ثابتة لجميع بالاشعة.

النتائج

في هذه الدراسة، يوصف بروتوكول لنموذج الفأر التي تم نشرها مسبقا من الصدمة / حرق الناجم HO ^14-17 وهذا ينطوي على إنشاء المتزامنة الإصابة العضلية الموضعية مع بضع الوتر أخيل وإهانة التهابات العالمية مع سمك الجزئي حرق الاصابة. وهذا يؤدي إلى تشكيل موثوق العظام التفاعلي ف...

Discussion

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada