Souris Direct Trauma / Graver Modèle d'ossification hétérotopique

Résumé

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Résumé

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

Introduction

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel que défini dans les directives fournies dans le Guide pour l'utilisation et l'entretien des animaux de laboratoire: huitième édition de l'Institute for Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) et ont été approuvé par le soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université du Michigan (PRO0001553).

1. Souris Interventions chirurgicales

REMARQUE: Utilisez 8-10 semaine vieille souris C57BL / 6. Autres âges, des origines et souches de souris peuvent également être utilisés pour tester des conditions différentes ou génétique. Pour la partie de ténotomie de la procédure, de maintenir des conditions stériles en utilisant un masque, bonnet de cheveux, et blouse stérile, des gants et des instruments. Sites chirurgicaux doivent être préparés avec stérilement povidone-iode et drapage stérile. Éviter l'hypothermie en utilisant un coussin chauffant vétérinaire et le réchauffement des solutions de réanimation à 37 ° C avant d'administration.

1. Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d'isoflurane inhalé. Utilisez un cône de nez de quitter le dos et membres postérieurs facilement accessible. Réglez la vitesse d'administration de l'isoflurane pour maintenir le taux respiratoire appropriée et la coloration des muqueuses et de veiller à l'anesthésie en vérifiant le tonus musculaire, pincement de l'orteil, et réflexe cornéen. Appliquer une pommade ophtalmique fade aux yeux de la souris pour éviter les blessures de l'oeil sec lors de la procédure. Maintenir la température corporelle adéquate en utilisant un coussin chauffant vétérinaire ou circulateur d'eau chaude sous le champ chirurgical.
2. Administrer la buprénorphine, 0,1 mg / kg, voie sous-cutanée immédiatement avant l'intervention chirurgicale pour l'analgésie.
3. Raser de près le site chirurgical sur la patte arrière gauche l'aide de tondeuses du talon au genou.
4. Étroitement raser le dos de la souris, en commençant sur la colonne vertébrale et l'extension de la zone rasée à la gauche de la ligne médiane dorsale, nettoyer une zone d'au moins 2 cm x 3 cm pour accueillir la brûlure.
5. Préparer le site chirurgical, y compris la patte postérieure du genou en utilisant 3 alternance gommages povidone-iode.
6. Effectuer une incision longitudinale le long de la face médiale du tendon d'Achille gauche. Elargir l'incision de sorte que le tendon d'Achille peut être visualisé facilement; environ 0,5 cm.
7. Effectuer une ténotomie d'Achille avec dissection du tendon au milieu avec des ciseaux pointus de tissus. Insérer une lame de ciseaux de tissu dans le plan du tissu au-dessous du tendon et disséquer le long du plan jusqu'à ce que la lame est au point médian du tendon. Fermez les lames de ciseaux pour sectionner le tendon fortement.
   REMARQUE: Veiller à l'inclusion de tous les tendons postérieurs y compris Gastrocnemius, soléaire et tendons plantaire.
8. Hémostase en appliquant une pression avec de la gaze stérile (il devrait y avoir un saignement minime) et fermer l'incision de la peau avec un point 5-0 de vicryl.
9. Effectuez la dorsale partielle brûlure d'épaisseur avec un bloc d'aluminium pesant 35 g avec approximatives DE MESUREts 2 cm x 2 cm x 3 cm chauffé à 60 ° C dans un bain d'eau appliquée sur la face dorsale rasée de la souris pendant 17 sec.
   Remarque: obtenir la profondeur de gravure approprié en plaçant le bloc au-dessus de la souris anesthésiée, veiller à ce que toute la zone de surface du bloc est au contact de la souris, cependant éviter d'appliquer une pression supplémentaire sur le bloc, à savoir, permettre à la gravité pour être la seule force de maintien le bloc en place. Une poignée en matière plastique mince fixée à un côté du bloc est commode pour la manipulation, la stabilisation et la récupération à partir du bain d'eau chaude. Cela va créer un organisme surface totale d'environ 30% à brûler dans une ancienne 8-10 semaine souris C57BL / 6. Cette brûlure de contact a été choisi sur les autres méthodes (flamme ou brûlure brûlures) en raison de l'uniformité de la profondeur de la brûlure sur la plaie et la reproductibilité entre les animaux.
10. Sécher le site de la brûlure avec de la gaze et appliquer un pansement Tegaderm.
11. Administrer des fluides de réanimation réchauffés: solution 1 ml de Ringer lactateinjection intraperitoneale et injection sous-cutanée de 0,5 ml. Cette administration unique de la réanimation est adéquate pour la récupération de la blessure de brûlure et ténotomie.
    REMARQUE: Ne pas revenir souris anesthésiées dans des cages de logement avec d'autres souris, maison individuellement dans des cages propres sous surveillance jusqu'à ce que les souris sont complètement rétablis. Récupération type se produit dans 1-6 hr. les sites de gravure guérissent généralement dans les 2-4 semaines et sont rarement compliqués par infection de la plaie si elles sont conservées dans des environnements de logement propres.
12. Administrer buprénorphine 0,1 mg / kg injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours suivants la procédure. Surveillez la croissance HO avec des scans de μCT série à des intervalles appropriés. La croissance osseuse ectopique est la première évident environ 3 semaines post-op par μCT.
    NOTE: La majorité du développement HO est terminée par neuf semaines post-op. Nous avons pas observé de différence de volume HO ou l'emplacement avec répétée μCT scans bi-hebdomadaire pendant 15 semaines comparativement à un seul point final μCT numériser à 15 semaines.A la fin des expériences, toutes les souris euthanasie avec CO ₂ inhalation selon les directives institutionnelles et vérifier mort à la dislocation cervicale après 10 min.

2. μCT acquisition et d'analyse

1. Fixez la souris anesthésiés sur la vitre du scanner dans la position couchée. Collez les membres postérieurs en toute sécurité vers le lit pour éviter de respirer un artefact de mouvement. Inclure l'air, l'eau, et d'hydroxyapatite contenant fantôme sous la souris pour l'étalonnage de l'image.
2. Ouvrez le logiciel d'analyse d'os et de définir une région d'intérêt (ROI) qui englobe les deux membres postérieurs de l'articulation de la hanche proximale à l'extrémité de la patte arrière distale. Obtenir une image en utilisant les paramètres suivants:. 80 kV, 500 pA et 1300 msec exposition, 48 um taille de voxel ^14,15
3. Calibrer l'image pour unités Hounsfield (HU) en dessinant un retour sur investissement dans chacune des trois chambres de fantômes et de la saisie de la densité moyenne dans les champs appropriés dansle logiciel.
4. Utilisation de la "grabber" outil dans le logiciel, réorienter l'image de sorte que le tibia de la patte arrière gauche est parallèle le long de l'axe Z pour permettre à la vue anatomique la plus claire pour la délimitation des structures osseuses corticales orthotopiques et HO.
5. Commençant au niveau du genou, faites défiler distale à travers les tranches d'image jusqu'à HO est rencontré. Utilisation de l'outil manuel de spline, faire un retour sur investissement autour de l'os ectopique sur chaque 5 ^ème tranche continue distale à travers la patte ou jusqu'à ce que HO a été dépassé. Utilisez l'outil de extrapoler à étendre et à assembler les ROI ensemble dans un ROI qui contient toutes les HO.
6. Faire un ROI 3D et choisissez le menu d'analyse. Calculer le volume osseux par le réglage des valeurs seuils inférieure et supérieure qui montrent le mieux la fenêtre osseuse. Utilisez les mêmes valeurs seuils fixés pour toutes les analyses.

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Résultats

Dans la présente étude, le protocole est décrit par le modèle de souris précédemment publié des traumatismes / brûler induite HO. ^14-17 Cela implique la création d'une blessure musculo-squelettique localisée concurrente avec une ténotomie Achille et agression inflammatoire mondial avec une épaisseur partielle brûlures. Il en résulte la formation fiable de l'os au niveau du site réactif de ténotomie qui peut être suivie à l'imagerie en série. À ce jour, toutes les souris (plus d...

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Discussion

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada