직접 마우스 외상 / 이소성 골화의 모델을 굽기

요약

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

초록

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

서문

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

프로토콜

윤리 문 : 실험 동물 연구를위한 연구소의 여덟 번째 판 (ILAR, 2011)과 같다 : 모든 동물의 절차는 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 가이드에 제공된 지침에 정의 된대로 좋은 동물 관행에 엄격한에 따라 수행 하였다 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (PRO0001553)에 의해 승인했다.

1. 마우스 외과 적 치료

참고 : 사용 8-10주 된 C57BL가 / 6 마​​우스. 다른 연령, 배경, 및 생쥐 균주는 또한 상이한 조건 또는 유전 적 테스트를 위해 사용될 수있다. 프로 시저의 건 절단술 부분에 대한, 얼굴 마스크, 헤어 모자, 멸균 가운, 장갑, 및 악기를 사용하여 멸균 조건을 유지한다. 외과 사이트는 무균 포비돈 - 요오드 살균 입체 재단으로 준비를해야합니다. 37 ° C의 소생 솔루션을 수의학 가열 패드를 사용하고 따뜻하게하여 체온을 피 administra 이전기.

1. 2.5 % 흡입 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취. 쉽게 접근 배부 및 뒷다리 - 사지를 떠나 코 콘을 사용합니다. 점막의 적절한 호흡 속도와 착색을 유지하기 위해 이소 플루 란 관리의 속도를 조절하고 근육, 발가락 핀치, 각막 반사를 확인하여 마취을 보장합니다. 절차를 수행하는 동안 건조 눈 부상을 방지하기 위해 마우스의 눈에 개성 안과 연고를 적용합니다. 수술 필드 아래 수의학 가열 패드 또는 온수 순환 장치를 사용하여 적절한 체온을 유지한다.
2. 무통 수술에 피하 직전에, 부 프레 노르 핀, 0.1 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
3. 밀접하게 무릎 발 뒤꿈치에서 가위를 사용하여 왼쪽 뒷발에 수술 부위를 면도.
4. 밀접하게 척추를 통해 시작과 등쪽 정중선의 왼쪽에 면도 영역을 확장, 화상 부상을 수용 할 수있는 영역을 적어도 2cm × 3 cm의 제거, 마우스의 배부를 면도.
5. 3 교대 포비돈 - 요오드 스크럽을 사용하여 무릎에 뒷발을 포함하여 수술 부위를 준비합니다.
6. 왼쪽 아킬레스 건의 안쪽면을 따라 세로 절개를 수행합니다. 아킬레스 건 쉽게 시각화 할 수 있도록 절개를 확장; 약 0.5 cm.
7. 날카로운 조직 가위로 중간에 힘줄의 날카로운 해부와 아킬레스 건 절단술을 수행합니다. 건 아래에있는 조직면에서 조직 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 블레이드 건 중간에 때까지 평면을 따라 해부. 급격히 건을 절단하기 위해 가위 블레이드를 닫습니다.
   참고 : 비복근, 가자미근과 족저 건을 포함하여 모든 뒤쪽 힘줄의 포함을 확인합니다.
8. 멸균 거즈로 압력을 적용하여 지혈을 달성 (이 최소한의 출혈을해야한다)와 5-0 vicryl 스티치로 피부 절개를 닫습니다.
9. 대략 measuremen와 35g의 무게 알루미늄 블록 등의 부분 층 화상을 수행TS 2cm X 2cm X 3cm 17 초간 마우스의 등쪽에 도포 면도 수욕에서 60 ° C로 가열 하였다.
   주 : 그러나 즉, 블록에 추가적인 압력을 가하지 않도록, 블록의 전체 표면 영역은 마우스와 접촉하는 것을 보장하는, 마취 된 쥐의 상부에 블록을 놓아 적절한 화상 농도를 달성 할 중력 허용 장소에 블록을 들고있는 유일한 힘. 블록의 일 측면에 부착 된 얇은 플라스틱 핸들 온수욕에서 조작, 안정화, 및 검색을 위해 편리하다. 이는 약 30 %의 총 체 표면적이 8-10 주 된 C57BL / 6 마​​우스에 화상이 생성됩니다. 이 접촉 화상으로 인해 상처를 통해 화상 깊이의 균일과 동물 사이의 재현성에 다른 방법 (불꽃 또는 소독 번)를 통해 선정되었다.
10. 거즈로 화상 부위를 건조하고 tegaderm 드레싱을 적용합니다.
11. 따뜻하게 소생술 유체를 관리 : 락 테이트 링거액 1 ml에복강 내 주사하고 0.5 mL를 피하 주사. 소생이 한 시간 관리는 화상 부상과 건 절단술에서 복구에 적합합니다.
    참고 : 마우스가 완전히 회복 될 때까지 모니터링에서 깨끗한 케이지에 개별적으로, 다른 마우스와 주택 케이지에 집에 마취 된 쥐를 반환하지 않습니다. 일반적인 복구는 1-6 시간 내에 발생합니다. 굽​​기 사이트는 일반적으로 2~4주 내에 치유하고 깨끗한 주거 환경에서 보관하는 경우는 거의 창상 감염에 의해 복잡하지 않습니다.
12. 부 프레 놀핀 0.1 ㎎ / ㎏ 피하 주사에게 절차에 따라 3 일간 매 12 시간을 관리 할 수​​ 있습니다. 적절한 간격으로 일련 μCT 검사와 HO의 성장을 모니터링합니다. 자궁외 뼈의 성장이 먼저 μCT에 의해 분명 약 삼주 수술 후입니다.
    참고 : HO 개발의 대부분은 수술 후 구주로 완료됩니다. 우리는 15 주에 검사 μCT 단일 엔드 포인트에 비해 15주에 대한 격주 호 볼륨 또는 반복 μCT와 위치의 차이를 스캔 관찰되지 않았다.실험의 끝에서, 제도적 지침에 따라 CO ₂ 흡입으로 모든 쥐를 안락사와 10 분 후 자궁 전위와 죽음을 확인합니다.

2. μCT 수집 및 분석

1. 발생하기 쉬운 위치에 스캐너 침대에 마취 마우스를 고정합니다. 동 잡음 호흡 방지하기 위해 침대에 단단히 뒷다리를 테이프입니다. 이미지 보정을위한 마우스 아래에 팬텀이 포함 된 공기, 물, 및 하이드 록시 아파타이트를 포함합니다.
2. 뼈 분석 소프트웨어를 열고 근위 말단 뒷발의 선단에 고관절에서 양쪽 뒷다리를 포함 ROI (region of interest)를 정의한다. 다음 매개 변수를 사용하여 이미지를 얻습니다. 80 kV로, 500 μA 및 1,300 밀리 초 노출, 48 μm의 복셀 크기를 ^{14, 15를}
3. 에 해당 필드에 평균 밀도를 세 팬텀 챔버의 각 투자 수익 (ROI)을 그리기 및 입력하여 하운 스 필드 단위 (HU)에 이미지를 보정소프트웨어.
4. 왼쪽 뒷다리의 경골 평행 동소 피질골 구조 및 HO의 묘사를위한 명확한 해부학 뷰를 허용하는 Z 축을 따라하므로 소프트웨어 "그래버"툴을 사용하여, 화상을 재 방향.
5. HO가 발견 될 때까지 무릎에서 시작하여, 이미지 조각을 원심으로 스크롤합니다. 수동 스플라인 도구를 사용하여 발을 통해 또는 HO가 초과 될 때까지 원심 계속 매 5 ^번째 조각에 자궁외 뼈 주변의 투자 수익 (ROI)을합니다. 확장하고 모든 호를 포함하는 하나의 투자 수익 (ROI)에 함께 로아 스티치 추정 해 도구를 사용합니다.
6. 3D 투자 수익 (ROI)을 확인하고 분석 메뉴를 선택합니다. 가장 뼈 윈도우 표시 하위 및 상위 임계 값을 설정하여 뼈의 양을 계산한다. 모든 검사에 대해 동일한 고정 임계 값을 사용합니다.

결과

이 본 연구에서, 프로토콜은 외상의 이전에 발행 된 마우스 모델에 대한 설명 / 호. ^{14 ~ 17이} 부상을 구울 부분 두께의 아킬레스 건 절단술 및 글로벌 염증 모욕과 동시에 지역화 근골격계 손상의 생성을 포함 유도 구울 수 있습니다. 이 시리얼 이미징 따라 할 수있는 건 절단술 사이트에서 반응 뼈의 안정적인 형성을 초래한다. 현재까지 모두 아킬레스 건 절단술을 유지하고 부상을 구울 수...

토론

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada