Direto Rato Trauma / Burn Modelo de ossificação heterotópica

Resumo

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Resumo

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

Introdução

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

Protocolo

Declaração de ética: Todos os procedimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definido nas orientações fornecidas no Guia para uso e cuidado de Animais de Laboratório: Oitava Edição do Instituto de Laboratório de Pesquisa Animal (ILAR de 2011) e foram aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal Institucional da Universidade de Michigan (PRO0001553).

1. mouse Procedimentos Cirúrgicos

NOTA: Use 8-10 semanas de idade C57BL / 6 ratos. Outras idades, origens e linhagens de camundongos também pode ser usado para testar diferentes condições ou composição genética. Para a parte tenotomia do procedimento, manter condições estéreis, utilizando máscara facial, bonnet cabelo, e avental estéril, luvas e instrumentos. Locais cirúrgicos devem ser esterilizada preparada com iodopovidona e drapeados estéril. Evitar a hipotermia usando uma almofada de aquecimento e veterinária para o aquecimento de soluções de ressuscitação 37 ° C antes da adminis-ção.

1. Anestesiar o rato usando 2,5% de isoflurano inalado. Use um cone do nariz para deixar o dorso e traseiras-membros de fácil acesso. Ajustar a taxa de administração de isoflurano para manter a taxa respiratória apropriada e coloração das mucosas e para garantir anestesia, verificando o tônus ​​muscular, toe pitada, e reflexo da córnea. Aplicar pomada oftálmica sem graça para os olhos do rato para evitar lesões do olho seco durante o procedimento. Manter a temperatura corporal adequada usando uma almofada de aquecimento veterinária ou circulador de água quente sob o campo cirúrgico.
2. Administrar buprenorfina, 0,1 mg / kg, por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia para analgesia.
3. Intimamente raspar o local da cirurgia na pata traseira esquerda usando cortadores desde o calcanhar até o joelho.
4. Estreitamente raspar o dorso do rato, começando ao longo da coluna vertebral e que se estende a área rapada à esquerda da linha média dorsal, limpar uma área de pelo menos 2 cm x 3 cm para acomodar o ferimento de queimadura.
5. Prepara-se o local de cirurgia, incluindo a pata traseira ao joelho utilizando 3 alternadas esfrega povidona-iodo.
6. Realize uma incisão longitudinal ao longo do aspecto medial do tendão de Aquiles esquerdo. Estender a incisão para que o tendão de Aquiles pode ser facilmente visualizado; aproximadamente 0,5 cm.
7. Executar uma tenotomia de Aquiles com dissecção aguda de tendão no ponto médio com uma tesoura de tecido afiadas. Inserir uma lâmina da tesoura de tecido no plano do tecido abaixo do tendão e dissecar ao longo do plano até que a lâmina está no ponto central do tendão. Feche as lâminas da tesoura para cortar o tendão acentuadamente.
   NOTA: Certifique-se de inclusão de todos os tendões posteriores incluindo gastrocnêmio, sóleo, e tendões plantar.
8. Hemostasia, aplicando pressão com gaze estéril (deve haver sangramento mínimo) e fechar a incisão na pele com um ponto vicryl 5-0.
9. Realize o dorsal queimadura de espessura parcial com um bloco de alumínio com peso de 35 g com measuremen aproximadosTS 2 cm por 2 cm x 3 cm aquecida a 60 ° C num banho de água aplicada ao dorso rapada do ratinho durante 17 seg.
   NOTA: Atingir a profundidade de gravação apropriado colocando o bloco no topo do rato anestesiado, assegurando que toda a superfície do bloco está em contacto com o rato, no entanto, evitar a aplicação de qualquer pressão adicional para o bloco, ou seja, permitir que a gravidade seja a única força que prende o bloco no lugar. Um cabo de plástico fino ligado a um lado do bloco é conveniente para a manipulação, de estabilização, e recuperação a partir do banho de água quente. Isto irá criar uma área de superfície total do corpo queimar cerca de 30% em um 8-10 semanas de idade C57BL / 6 mouse. Este queimadura contato foi escolhido em detrimento de outros métodos (chama ou escaldão queimaduras), devido à uniformidade da profundidade da queimadura sobre a ferida e a reprodutibilidade entre os animais.
10. Seque o site queimadura com uma gaze e aplicar um curativo Tegaderm.
11. Administrar fluidos de ressuscitação aquecidos: solução de Ringer com lactato de 1 mlinjecção intraperitoneal e subcutânea de 0,5 ml. Esta administração única de reanimação é adequada para a recuperação da lesão por queimadura e tenotomia.
    NOTA: Não retornar ratos anestesiados para jaulas de habitação com outros ratos, casa individualmente em gaiolas limpas sob monitoramento até que os ratos são totalmente recuperado. A recuperação típica ocorre no prazo de 1-6 horas. Locais queimados geralmente curar dentro de 2-4 semanas e raramente são complicados por infecção da ferida se mantido em ambientes de habitação limpas.
12. Administrar Buprenorfina 0,1 mg / kg injecção subcutânea a cada 12 horas durante 3 dias após o procedimento. Monitorar o crescimento HO com varreduras μCT de série em intervalos apropriados. Crescimento ósseo ectópica é evidente pela primeira vez em torno de 3 semanas pós-operatório por μCT.
    NOTA: A maioria do desenvolvimento HO é completa por nove semanas de pós-operatório. Nós não observamos uma diferença de HO volume ou local com repetidas varreduras μCT bi-semanal, durante 15 semanas, em comparação a um único ponto-final μCT digitalizar em 15 semanas.No final das experiências, todos os ratinhos a eutanásia com _CO2 inalação de acordo com as orientações institucionais e verificar a morte com deslocamento cervical depois de 10 min.

2. μCT Aquisição e Análise

1. Prenda o rato anestesiado na mesa do scanner na posição prona. Tape os membros posteriores segurança para a cama para evitar respirar movimento artefato. Inclua o ar, a água, e hidroxiapatita contendo fantasma sob o mouse para calibração de imagem.
2. Abra o software de análise de osso e definir uma região de interesse (ROI) que engloba ambos os membros posteriores da articulação da anca proximal à ponta da pata traseira distalmente. Obter uma imagem usando os seguintes parâmetros:. 80 kV, 500 mA e 1.300 ms de exposição, 48 mm tamanho voxel ^14,15
3. Calibre a imagem para unidades Hounsfield (HU) pelo desenho de um ROI em cada uma das três câmaras fantasmas e introduzir a densidade média nos campos apropriados emo software.
4. Usando a ferramenta "apanhando" no software, re-orientar a imagem de modo a tíbia do membro posterior esquerdo é paralelo ao longo do eixo Z para permitir a mais clara vista anatômico para a delimitação das estruturas ósseas corticais ortotópicos e HO.
5. Começando na altura do joelho, desloque distalmente através das fatias de imagem até HO é encontrado. Usando a ferramenta de spline o manual, faça um ROI em torno do osso ectópico em cada 5 ^th fatia continua distalmente através da pata ou até HO foi ultrapassado. Use a ferramenta extrapolar para ampliar e costurar as ROIs juntos em um ROI que contém todas as HO.
6. Faça um ROI 3D e escolha o menu de análise. Calcule o volume ósseo, definindo os valores de limite inferior e superior que melhor mostram a janela do osso. Use os mesmos valores-limite fixados para todas as digitalizações.

Resultados

No presente estudo, o protocolo é descrito para o modelo de rato previamente publicado de trauma / queimadura induzida HO ^14-17. Isto envolve a criação de concomitante lesão musculoesquelética localizada com uma tenotomia Aquiles e insulto inflamatório global, com uma espessura parcial queimaduras. Isto resulta na formação fiável do osso no local reactivo Tenotomia que pode ser seguido com imagens em série. Até à data, todos os ratinhos (mais de 50) que sofreram ambos Aquiles Tenotomia e lesão po...

Discussão

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada