Direkter Maus Trauma / Brennen Modell heterotoper Ossifikationen

Zusammenfassung

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Zusammenfassung

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

Einleitung

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

Protokoll

Ethics Statement: Eighth Edition aus dem Institut für Labortierforschung (ILAR, 2011) und waren: Alle tierischen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis in den Leitlinien im Leitfaden für die Benutzung und Pflege von Labortieren vorgesehen definiert durchgeführt von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Michigan (PRO0001553) zugelassen.

1. Maus Chirurgische Verfahren

HINWEIS: Verwenden Sie 8-10 Wochen alte C57BL / 6 Mäusen. Andere Altersgruppen, Hintergründe und Stämme von Mäusen können auch verwendet werden, um verschiedene Bedingungen oder Erbgut zu testen. Für die Tenotomie Teil des Verfahrens zu erhalten sterilen Bedingungen unter Verwendung von Gesichtsmaske, Haarhaube und sterile Kittel, Handschuhe und Instrumente. Operationsstellen sollten steril mit PVP-Jod und sterilen Abdeckung hergestellt werden. Hypothermie zu vermeiden, indem ein veterinär Heizkissen und Aufwärmen Reanimation Lösungen bis 37 ° C vor dem Verwaltungstion.

1. Betäuben die Maus mit 2,5% inhalativen Isofluran. Verwenden Sie einen Nasenkegel, um den Rücken und hinteren Extremitäten leicht zugänglich zu verlassen. Passen Sie die Geschwindigkeit von Isofluran Verwaltung, geeignete Atemfrequenz und Färbung der Schleimhaut zu erhalten und Anästhesie, indem Muskeltonus, toe Prise, und Kornealreflex gewährleisten. Bewerben fad Augensalbe die Augen der Maus die zu trockene Augenverletzung während des Verfahrens zu verhindern. Es ist für ausreichende Körpertemperatur mit Hilfe eines Veterinär Heizkissen oder warmem Wasser Zirkulator unter dem OP-Feld.
2. Verabreichen Buprenorphin, 0,1 mg / kg, subkutan unmittelbar vor der Operation zur Analgesie.
3. Eng rasieren die Operationsstelle auf der linken Hinterpfote mit Schermaschinen von der Ferse bis zum Knie.
4. Eng rasieren den Rücken der Maus, beginnend über die Wirbelsäule und die Verlängerung der rasierten Bereich auf der linken Seite der Rückenmittellinie, Clearing über eine Fläche von mindestens 2 cm x 3 cm, um die Brandverletzung unterzubringen.
5. Bereiten Sie die Operationsstelle, einschließlich der Hinterpfote bis zum Knie mit 3 Wechsel Povidonjod Peelings.
6. Führen einen Längsschnitt entlang der medialen Seite des linken Achillessehne. Verlängern Sie den Schnitt, so dass die Achillessehne leicht sichtbar gemacht werden; ca. 0,5 cm.
7. Führen Sie eine Achilles-Tenotomie mit scharfen Dissektion der Sehne in der Mitte mit scharfen Gewebe Schere. Einfügen einer Klinge der Schere Gewebe in der Gewebeebene unterhalb der Sehne und sezieren entlang der Ebene, bis das Blatt an der Sehnenmittelpunkts. Schließen Sie die Scherenblätter um die Sehne scharf zu trennen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, Einbeziehung aller hinteren Sehnen einschließlich Gastrocnemius, Soleus und Plantaris Sehnen.
8. Blutstillung zu erreichen, indem Druck mit steriler Gaze (es sollte minimal Blutungen) und schließen Sie die Hautschnitt mit einem 5-0 Vicryl Stich.
9. Führen Sie die Rückenteildicke brennen mit einem Aluminiumblock mit einem Gewicht von 35 g mit ungefähren Messung!ts 2 cm x 2 cm x 3 cm bis 60 ° C erhitzt in einem Wasserbad auf den rasierten Rücken der Maus für 17 sec aufgebracht.
   HINWEIS: Erreichen Sie die entsprechende Brenntiefe um den Block ruht auf der Oberseite des narkotisierten Maus, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche des Blocks in Kontakt mit der Maus, aber vermeiden, dass keine zusätzlichen Druck auf den Block, das heißt, die Schwerkraft zu sein die einzige Kraft, die den Block an Ort und Stelle. Eine dünne Kunststoffgriff zu einer Seite des Blocks angebracht ist für Manipulation, Stabilisierung und Wiedergewinnung aus dem heißen Wasserbad. Diese schaffen eine etwa 30% Körperoberfläche zu verbrennen in einer 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus. Dieser Kontakt burn wurde gegenüber anderen Methoden (Flamme oder verbrühen burn) aufgrund der Gleichmäßigkeit der Verbrennung Tiefe über die Wunde und die Reproduzierbarkeit zwischen Tieren ausgewählt.
10. Trocknen Sie die Verbrennungsstelle mit Gaze und tragen Sie eine Tegaderm Verband.
11. Verwalten erwärmt Reanimation Flüssigkeiten: Ringer-Lactat-Lösung 1 mlintraperitoneale Injektion und 0,5 ml subkutane Injektion. Diese einmalige Verabreichung von Lungen-Wiederbelebung ist ausreichend für die Wiederherstellung von der Brandverletzung und Tenotomie.
    HINWEIS: narkotisierten Mäusen mit anderen Mäusen einzeln in saubere Käfige zurück Sie nicht, Gehäuse Käfigen, Haus unter Kontrolle, bis die Mäuse vollständig erholt. Typische Erholung tritt innerhalb von 1-6 Std. Burn-Sites in der Regel innerhalb von 2-4 Wochen heilen und werden nur selten von Wundinfektion kompliziert, wenn in sauberen Umgebungen Gehäuse gehalten.
12. Verwalten Buprenorphin 0,1 mg / kg subkutan alle 12 Stunden für 3 Tage nach dem Eingriff. Überwachen HO Wachstum mit Serien μCT-Scans in angemessenen Zeitabständen. Ektope Knochenwachstum ist zunächst klar, rund 3 Wochen postoperativ durch μCT.
    HINWEIS: Die Mehrheit der HO Entwicklung komplett von 9 Wochen nach der Operation ist. Wir haben beobachtet, einen Unterschied in der Lautstärke oder HO gelegene wiederholt μCT scannt zweimal wöchentlich für 15 Wochen im Vergleich zu einer einzelnen Endpunkt μCT bei 15 Schwangerschaftswochen.Am Ende der Versuche, einschläfern Alle Mäuse mit CO ₂ Inhalation gemäß gültiger Richtlinien und überprüfen Sie den Tod mit Genickbruch nach 10 min.

2. μCT-Akquisition und Analyse

1. Sichern Sie den narkotisierten Maus auf das Scanner-Bett in der Bauchlage. Kleben Sie die Hinterbeine sicher an dem Bett Atembewegungsartefakte zu vermeiden. Fügen Sie die Luft, das Wasser und Hydroxylapatit enthält Phantom unter der Maus für die Bildkalibrierung.
2. Öffnen Sie die Knochenanalyse-Software und eine Region of Interest (ROI), die beide Hinterbeine aus dem Hüftgelenk proximal zu der Spitze der Hinterpfote distal umfasst definieren. Erhalten Sie Bild mit den folgenden Parametern:. 80 kV, 500 & mgr; A und 1,300 msec Exposition, 48 & mgr; m Voxelgröße ^14,15
3. Kalibrierung des Bildes auf Hounsfield-Einheiten (HU), die durch Ziehen eines ROI in jeder der drei Kammern Phantom und Eingeben der mittleren Dichte in die entsprechenden Felder indie Software.
4. Mit dem "Grabber" Werkzeug in der Software, neu orientieren das Bild so das Schienbein des linken Hinterbein parallel entlang der Z-Achse, um das klarste Ansicht anatomische für die Abgrenzung der orthotopen kortikalen Knochen Strukturen und HO ermöglichen.
5. Beginnend am Knie, distal blättern Sie durch die Bildschnitte bis HO angetroffen wird. Verwendung des manuellen Spline-Werkzeug, machen Sie eine ROI um die ektopische Knochen auf jedem ^5. Scheibe distal weiter durch die Pfote oder bis HO wurde übertroffen. Verwenden Sie das extrapolieren-Tool zu erweitern und zu nähen die ROIs zusammen in einem ROI, die den ganzen HO enthält.
6. Einen 3D-ROI und wählen Sie das Analyse-Menü. Berechnen Sie die Knochenvolumen, indem Sie die untere und obere Grenzwerte, die das Knochenfenster am besten zeigen. Verwenden Sie die gleichen festen Schwellenwerten für alle Scans.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wird das Protokoll für die zuvor veröffentlichten Maus-Modell der Trauma beschrieben / brennen induzierte HO. ^14-17 Dieses beinhaltet die Schaffung von gleichzeitigen lokalisierten Muskel-Skelett-Verletzungen mit einer Achilles-Tenotomie und globale entzündliche Beleidigung mit einer Teildicke Verletzungen verbrennen. Dies führt bei der zuverlässigen Bildung reaktiver Knochen an der Stelle, die mit tenotomy seriellen Bildgebung verfolgt werden kann. Bisher wurden alle Mäuse (m...

Diskussion

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada