Doğrudan Fare Travma / Heterotopik Kemikleşme Model Yanık

Özet

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

Özet

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

Giriş

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.^1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.^4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.^6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.^10-13

In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.^14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.^14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.^14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.^15,16

Protokol

Etik bildirimi: Laboratuar Hayvan Araştırmaları Enstitüsü'nden Sekizinci Edition (Ilar, 2011) ve kişi: Bütün hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kılavuzda verilen kılavuzda tanımlanan iyi hayvan uygulamaları ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir Michigan Üniversitesi'nden Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (PRO0001553) tarafından onaylanmıştır.

1. Fare Cerrahi İşlemleri

NOT: 8-10 haftalık C57BL / 6 fareler. Diğer yaş, arka planlar ve farelerin suşları farklı koşullar veya genetik makyaj test etmek için kullanılır. Prosedürün tenotomi kısmı için, yüz maskesi, saç kaputu ve steril önlük, eldiven ve enstrümanları kullanarak steril koşullar korumak. Cerrahi siteler steril povidon-iyot ve steril draping ile hazırlanmalıdır. 37 ° C resüsitasyon çözümleri bir veteriner ısıtma yastığı kullanılarak ve ısıtarak hipotermi önlemek yönetilmekteydi önceyon.

1. % 2.5 solunan izofluran kullanarak fare anestezisi. Kolay erişilebilir dorsum ve arka-bacaklarda bırakmak için bir burun konisi kullanın. Mukoza zarının uygun solunum hızı ve renklerini korumak için izofluran yönetiminin hızını ayarlayın ve kas tonusu, ayak tutam ve kornea refleksi kontrol ederek anestezi sağlamak. İşlem sırasında kuru göz yaralanmasını önlemek için farenin gözlerine mülayim oftalmik merhem sürün. Cerrahi alanının altında bir veteriner ısıtma yastığı veya sıcak su sirkülatör kullanılarak yeterli vücut ısısını korumak.
2. Analjezi için cerrahi subkutan hemen önce, buprenorfin, 0.1 mg / kg yönetme.
3. Yakından diz topuktan makası kullanarak sol arka pençe cerrahi siteyi tıraş.
4. Yakından omurga üzerinde başlayan ve dorsal orta hattın solunda traş alanını genişleten yanık karşılamak için bir alan en az 2 cm x 3 cm temizleyerek, fare dorsumuna tıraş.
5. 3 alternatif povidon-iyot scrubs kullanarak diz arka pençesine dahil, cerrahi siteyi hazırlayın.
6. Sol Aşil tendonu medial boyunca uzunlamasına bir kesi yapın. Aşil tendonu kolayca görülebilmesi böylece kesi uzatmak; Yaklaşık 0.5 cm.
7. Keskin doku makas ile orta noktasında tendonun keskin diseksiyon ile Aşil tenotomisi gerçekleştirin. Tendon altındaki doku düzleminde doku makas biri bıçak yerleştirin ve bıçak tendon orta noktasında olduğu kadar düzlem boyunca teşrih. Keskin tendon koparmaya makas bıçakları kapatın.
   NOT: Gastrocnemius, Soleus ve Plantaris tendonlar da dahil olmak üzere tüm arka tendonların dahil olun.
8. Steril gazlı bez ile basınç uygulayarak hemostaz (orada en az kanama olmalıdır) ve 5-0 vikril dikiş ile cilt kesisi kapatın.
9. Yaklaşık ölçümü ile 35 g ağırlığında bir alüminyum bloğu ile dorsal kısmi kalınlıkta yanık gerçekleştirints 2 cm x 2 cm x 3 cm 17 sn için fare traş sırtına tatbik edilen bir su banyosu içinde 60 ° C'ye kadar ısıtıldı.
   Not: Bununla birlikte, yani blok için ek basınç uygulamak bilmek bloğun bütün yüzey alanı fare ile temas halinde olması sağlanır anestezi fare üstünde blok dinlenme uygun yanık derinliği elde için yerçekimi izin yerinde bloğu tutan tek güç. Bloğun bir tarafına bağlı bir ince plastik kolu sıcak su banyosundan manipülasyonu, stabilizasyon ve alınması için uygundur. Bu yaklaşık% 30 toplam vücut yüzey alanı 8-10 haftalık C57BL / 6 fare yanık oluşturur. Bu iletişim yanık nedeniyle yara üzerinde yanık derinliği bütünlüğü ve hayvanlar arasındaki tekrarlanabilirlik diğer yöntemlerle (alev veya haşlanma yanığı) üzerinden seçildi.
10. Gazlı bez ile yanık sitesini kurulayın ve bir TEGADERM pansuman uygulanır.
11. Isıtılmış canlandırma sıvıları yönetme: Laktatlı Ringer çözeltisi 1 mlintraperitoneal enjeksiyon ve 0.5 ml deri altı enjeksiyonu. Resüsitasyon Bu tek seferlik idare yanık ve tenotomi kurtarma için yeterli.
    NOT: fareler tamamen iyileşti kadar gözetim altında temiz kafeslerde tek tek diğer fareler konut kafesleri evin anestezi fareler iade etmeyin. Tipik geri kazanım 1-6 saat içinde gerçekleşir. Yanık siteleri genellikle 2-4 hafta içinde iyileşir ve temiz konut ortamlarında muhafaza edilmesi durumunda nadiren yara enfeksiyonu ile komplike olur.
12. Buprenorfin 0.1 mg / kg deri altı enjeksiyonu prosedüre göre, 3 gün süre ile, her 12 saat uygulayın. Uygun aralıklarla seri uCT taramaları ile HO büyüme izleyin. Ektopik kemik büyümesi ilk uCT tarafından belirgin yaklaşık 3 hafta post-op olduğunu.
    NOT: HO geliştirme çoğunluğu post-op 9 hafta tamamlandı. Biz 15 haftada tarama uCT tek uç noktaya göre 15 hafta süreyle iki haftalık HO hacim veya tekrarlanan uCT ile yerde fark tarar gözlenen değil.Deneylerin sonunda, kurumsal kurallarına göre CO ₂ inhalasyon sahip tüm fareleri euthanize ve 10 dakika sonra servikal dislokasyon ile ölüm doğrulayın.

2. uCT Toplama ve Analizi

1. Yüzüstü pozisyonda tarayıcı yatağına anestezi fare sabitleyin. Hareket objeyi nefes önlemek için yatağa sıkıca arka bacaklarda bantlayın. Görüntü kalibrasyonu için fare altındaki hayalet içeren hava, su ve hidroksiapatit ekleyin.
2. Kemik Analizi yazılımı açın ve proksimal distale arka pençe ucuna kalça eklemi hem arka bacaklarda kapsar faiz (ROI) bir bölgeyi tanımlamak. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir görüntü elde. 80 kV, 500 uA ve 1.300 msn maruz kalma, 48 mikron voksel boyutu ^14,15
3. Uygun alanlara ortalama yoğunluğu üç hayalet odalarının her birinde bir yatırım getirisi çizerek ve girilerek Hounsfield üniteleri (HU) görüntü kalibreyazılımı.
4. Sol arka bacak tibia paralel ortotopik kortikal kemik yapıları ve HO belirlenmesi için net anatomik görünüm sağlamak için Z ekseni boyunca yani yazılımdaki "kapmak" aracını kullanarak, görüntüyü yeniden yönlendirin.
5. HO karşılaştı kadar diz başlayarak, görüntü dilimleri boyunca distale ilerleyin. Manuel spline aracını kullanarak, pençe üzerinden veya HO aştı kadar distale devam her 5 ^inci dilim ektopik kemik etrafında bir ROI yapmak. Genişletmek ve tüm HO içeren tek bir ROI bir araya İB'leri dikiş tahmin etmek aracını kullanın.
6. 3D yatırım getirisi yapın ve analiz menüsünü seçin. En iyi kemik penceresini göstermek alt ve üst eşik değerlerini ayarlayarak kemik hacmini hesaplayın. Tüm taramalar için aynı sabit eşik değerlerini kullanın.

Sonuçlar

Bu çalışmamızda, protokol travma önce yayınlanan fare modeli tarif edilmiştir / HO. ^14-17 Bu yanık kısmi kalınlıkta bir Aşil tenotomisinin ve küresel inflamatuar hakaret ile eş zamanlı lokalize kas-iskelet yaralanması oluşturulmasını içerir kaynaklı yanık. Bu seri görüntüleme ile takip edilebilir tenotominin sahasında reaktif kemik güvenilir oluşumu ile sonuçlanır. Bugüne kadar, hem Aşil tenotomisi sürekli ve yanık var (50'den fazla) tüm fareler tenotomi yerinde HO ölç...

Tartışmalar

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).¹⁸ Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	664	8-10 weeks old
Isoflurane – Fluriso	VET one, Boise, ID	V1 501017
Buprenorphine – Buprenex	Reckitt Benckiser Healthcare	NDC 12496-0757-1	0.3 mg/ml solution
Betadine	Owens and Minor, Mechanicsville, VA	2047PVP202
5-0 Vicryl sutures	Ethicon, Summerville, NJ	J493
Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Cut in half to properly cover burn site
µCT - GE eXplore Locus SP	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada
Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application	GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada