Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Zusammenfassung

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Zusammenfassung

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.

The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.

This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Einleitung

Der Bereich der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering schnell voran, mit Durchbrüchen in der Luftröhre und Nierenregeneration zwei bemerkenswerten jüngsten Erfolge. Die im Tissue Engineering entwickelte Biomaterialien werden immer zugänglich, mit Möglichkeiten, solche Protokolle auf weniger spezialisierten Laboratorien zu übertragen. Ein Feld vorbereitet, um durch zunehmende Nutzung von Biomaterialien profitieren ist in-vitro-Diagnostik.

In-vitro-Studien sind eine wichtige Plattform, um intra-zelluläre Signalwege innerhalb der einzelnen Zelltypen zu untersuchen und dazu beigetragen haben, zu beschreiben Mechanismen, die zahlreiche Krankheiten Pathophysiologien. Diese Studien beruhen im allgemeinen auf einem einzigen Zelltyp ist als eine Monoschicht auf Gewebekultur-Plastik (TCP) kultiviert; eine zweidimensionale (2D) starre Oberfläche weit weniger elastisch und porös als die dreidimensionale (3D) Umgebung Zellen innerhalb eines Gewebes oder Organs ausgesetzt ist. Tiermodelle sind traditionell employed Effekte in vitro wurde auch festgestellt, um das gesamte Gewebe zu übersetzen zu bestätigen, und kann auch als vorklinischen Plattformen verwendet werden, um Krankheiten des Menschen untersucht werden. Jedoch Unterschiede zwischen den Arten zu untergraben dieses Vertrauen in Tiermodellen in unserem Verständnis der menschlichen Krankheiten ^-. So wird beispielsweise viel Verständnis für die Lungenerkrankung Asthma bei trotz inhärenten Unterschiede zwischen der menschlichen Existenz und das Modell einschließlich wenig Hinweise auf Mastzellinfiltration der glatten Atemwegsmuskulatur bundle, oder die Fähigkeit zur spontanen Entwicklung der Krankheit im Tier einem Mausmodell basiert modellieren ^3,4. Es gibt auch ethische Überlegungen in Bezug auf die Verwendung von Tiermodellen, mit der "3R" Standard "Ersetzung, Verfeinerung und Reduzierung" in Tierversuchen, die in Großbritannien und anderen Ländern gefördert.

Eine attraktive Alternative wäre die Reprise von menschlichem Gewebe in vitro schaffen Strukturs, um den kooperativen Charakter zwischen erwachsenen Menschen Zelltypen in einem einzigen Gerät zu untersuchen. Zellen existieren in 3D mehrzelligen Strukturen im Gewebe, jeweils in einem einzigartigen Mikroumgebung. Das Kultivieren von Zellen auf TCP erlaubt nur die Kultur von Zell-Monoschichten, nicht auf dieses Umfeld zu replizieren, oder bieten die Fähigkeit zur Mehrzellenkultur. Biomaterials Weiterentwicklung bietet die Möglichkeit, sowohl natürliche als auch synthetische 3D-Plattformen für die Zellkultur zu entwickeln. Dezellularisierte ECM kann für 3D-Zellkultur verwendet werden, wenn sie mit anderen Zelltypen einschließlich Stammzellen ¹ rezellularisiertes jedoch solchen Protokollen kann komplex und zeitaufwendig sein kann, mit der Verfügbarkeit von Gewebe begrenzt ist und im Wesentlichen aus nicht-menschlichen Ursprungs. Andere Protokolle ermöglichen eine bessere Kontrolle über die zellulären Umgebungen erstellt, wie Nanoimprint, ECM Abscheidung Zellschicht Technologien oder Elektrospinnen. Elektrospinnen erzeugt Vlies 3D poröse Matten aus Fasern mit Durchmessern von Nanometern bis Mikrometern, replicating natürlichen ECM Dimensionen. Elektro Gerüste werden zunehmend als 3D-Zellkultur-Plattformen verwendet ^-. Manipulation der Elektrospinnen Parameter ermöglicht komplizierte Kontrolle über Gerüst Eigenschaften wie Porengröße, Faserdurchmesser, Topographie und Ausrichtung und Oberflächenchemie. Änderungen solcher Parameter sind gezeigt worden, um unmittelbar auf die Zelladhäsion und Wachstum, wenn die Zellen isoliert, kultiviert.

Diese Vorteile wurden in der vorliegenden Studie ausgenutzt, um die Kultivierung von mehreren Zelltypen als einzelne 3D-Gewebekonstrukt zu ermöglichen, mit dem Atemweg bronchiole als Modell 3D-Gewebestruktur. Die bronchiole Wand besteht aus drei Hauptbereichen (Abbildung 1). Die Schleimhaut ist, wo Atemwegsepithelzellen sitzen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) und bietet eine wichtige Barriere gegen die äußere Umgebung. Sie befinden sich auf dem retikulären Basalmembran (RBM), ein dicht kompakte ECM hauptsächlich aus collag umfassteen IV, perlecans und Laminine. Die submuköse Schicht direkt unterhalb der Schleimhaut, einer porösen Bereich von mehreren Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten und infiltrierenden Leukozyten unter Krankheitsbedingungen umfasst gefunden. Schließlich glatte Muskelbündel umschlingen den Luftweg in einer spiralförmigen Art und Weise, und werden von ausgerichteten Folien aus glatten Atemwegsmuskulatur (ASM) besteht. Es ist relativ Kontraktionszustand der glatten Muskulatur der Atemwege, die Klangregler. Der Einsatz von elektro Gerüste im Lungensystem hatte bis vor kurzem auf regenerative Zwecke beschränkt worden; mit einem elektroLuftRöhrenErsatz erfolgreich transplantiert. Obwohl erfolgreich, sind solche Behandlungen in begrenzter Zahl und werden von der Trachea infolge der relativen einfachen Natur der Funktion des Gewebes konzentriert. Begrenzte Beispiele von Atemwegs Modelle für die in vitro Diagnostik verwendet existieren, und in erster Linie auf Kontraktion der glatten Muskulatur Messungen ^{konzentriert.} Die nicht-toxisch und nichtn-abbaubares Polymer Polyethylenterephthalat (PET) wurde zuvor elektrogesponnen wurde, und wurde in der vorliegenden Studie auf Gerüsten hergestellt könnte für längere Zeit gelagert werden ohne Beeinträchtigung zu gewährleisten beschäftigt (so dass sie "von der Stange" verwendet werden), aber auch geeignet sein für stabile Zellkultur über einen längeren Zeitraum. Frühere Studien von unserer Gruppe haben gezeigt, daß die Verwendung von drei Variationen einer Basiselectro Protokoll können drei einzelne PET elektroGerüsten hergestellt werden, um eine optimale Topographien für die Kultivierung Atemwegsepithelzellen, Fibroblasten und glatten Muskelzellen in Isolation ^21,22 und der Co-Kultur von Atemwegs bereitzustellen epitheliale und Fibroblasten-Zellen ^22. Faserdurchmesser wurde festgestellt, epithelialen Funktionalität ²² großen Einfluss, und Faserausrichtung erlaubt die Erzeugung von ausgerichteten Blätter der glatten Muskulatur ^21. Diese Studien wurden unabhängig voneinander unter statischen Bedingungen durchgeführt. In der vorliegenden Studie werden diese different Gerüste ausdifferenzierten erwachsenen menschlichen Zellen enthalten, wurden für eine Woche bei ALI in einem handelsüblichen Bioreaktor als 3D-Abschnitt der Atemwegswand kokultiviert worden, die eine physiologisch in vitro-Modell relevant Atemwegsinterzelluläre Reaktionen zu untersuchen. Während dieses Protokolls wird mit dem Atemweg bronchiole als Modellsystem, als Plattform für die 3D-Kokultur Schleimhaut Einheiten anderer Organe angepasst werden könnten.

Protokoll

Primäre ASM Zellen aus nicht-asthmatischen Personen wurden aus Bronchialbiopsien am Glenfield Hospital (Leicester, UK), wie zuvor beschrieben isoliert. Die Forschung wurde von der Ethikkommission genehmigt Leicestershire und Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung nach Aufklärung.

1. Elektrospinnen PET Scaffolds (Abbildung 2)

1. Eine Lösung (10 ml) zu trinken PET von Flaschenqualität in einer 1: 1 Dichlormethan (DCMro) - (TFA) Lösung. PET-Konzentrationen von 8%, 30% und 10% Gewicht / Volumen (G / V) für Nanofaser, Mikrofaser erforderlich und ausgerichtet und dann Gerüste bzw. rühren Sie die Lösung, O / N bei RT für das Tier, sich aufzulösen.
2. Übertragen Sie die PET-Lösung in eine Spritze und fügen Sie eine 23-G (für Nanofaser) oder einen 18-G (für Mikrofaser und ausgerichtet) Nadel auf die Spritze und legen Sie die Spritze in einem motorisierten Spritzenpumpe. Sicherzustellen, dass die Spitze der Nadel ist an dem Boden gedreht wird.
3. Positionieren Sie den mandrel 15 cm entfernt von der Spitze der Nadel, wodurch sich die Nadel in der Mitte der Trommel hingewiesen.
4. Befestigen Sie die Stromversorgung an der Nadelspitze mit Krokodilklemmen und erden Sie die Spindel (über Bananenbuchse) auf die Erde. Schalten Sie die Stromzufuhr zu dem Dorn und eingestellte Geschwindigkeit auf 60 Umdrehungen pro Minute (entspricht ca. 13,2 m · min ^-1) für Nanofasergerüste und Mikrofaser. Solldrehzahl auf 2000 Umdrehungen pro Minute (entspricht ca. 440 m · min ^-1) für flucht Gerüste.
5. Set die Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 0,5 ml · h ^-1 für Nano zufällig und ausgerichtet Gerüsten oder 2,0 ml · h ^-1 für Mikrofaser Gerüsten. Kann die Pumpe laufen, bis die Lösung von der Nadelspitze, um jegliche Luft in der Nadel zu entfernen, extrudiert. Dann die Pumpe stoppen.
6. Auf der Spritzenpumpe, setzen das Gesamtvolumen der Lösung zu 2 ml ausgestoßen werden und starten Sie die Pumpe.
7. Set Spannungsversorgung bis 14 kV, und schalten Sie die Spannungs supply.
8. Elektrospinnen, bis 2 ml der Lösung wurde elektrostatisch (4 h für Nanofasern ausgerichtet und Gerüste, 1 h für Mikrofaser Gerüsten).
9. Schneiden Sie das Gerüst mit einer Klinge entlang der Breite des Dorns. Dies erzeugt eine 2D Blatt Gerüst die Größe des Dorns Fläche (in diesem Fall wird ein rechteckiges Blatt 22 cm x 11 cm), die sorgfältig von dem Dorn abgezogen werden kann). Lagern Sie das Gerüst in Aluminiumfolie elektrostatische Aufladung zu reduzieren).
   Hinweis: Biphasic Gerüste werden durch sequentielle Elektrospinnen einer Nanofasergerüst direkt auf ein Mikrofaser-Gerüst hergestellt.

2. Sterilisierung der Gerüste vor dem Einsatz in Zellkultur

1. Vom Gerüst Blatt, Punch-Out-Discs von zweiphasigen oder ausgerichtet Gerüste mit einem Biopsie-Stift 0,8 mm Durchmesser und halten Sie sich an die Dichtung mit nicht-toxischen Aquarium Kleber.
2. Sterilisieren Gerüste mit Ultraviolettbestrahlung für 30 min auf jeder Seite der Gerüste vor dem Einweichen in einer 20% Vol / vol Antibiotikum / Antimykotikum-Lösung (2x10 ⁵ Einheiten ml ^-1 Penicillin G, 2,000 mg ml ^-1 Streptomycinsulfat und 500 & mgr; g ml ^-1 Amphotericin B) O / N bei 4 ° C.
3. Waschen Gerüste mit PBS 3x und dann zu speichern Gerüste in TCP-Well-Platten in PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung.

3. Zellkulturmedienbestand

1. Kultur CALU3 Epithelzellen in DMEM-F12-Medium mit 10% Vol / Vol fötales Kälberserum (FCS), 2 nM L-Glutamin-Lösung, 1% Vol / Vol Antibiotikum / Antimykotikum-Lösung ergänzt (10.000 Einheiten ml ^-1 Penicillin G, 100 mg ml ^-1 Streptomycinsulfat und 25 & mgr; g ml ^-1 Amphotericin B).
2. Kultur Fibroblasten MRC5 und ASM-Zellen in DMEM-Medium mit 10% Vol / Vol fötales Kälberserum (FCS), 2 nM L-Glutamin-Lösung, 1% Vol / Vol Antibiotikum / Antimykotikum-Lösung ergänzt (10.000 Einheiten ml ^-1 Penicillin G, 100 mg ml ^-1 Streptomycinsulfat und 25 & mgr; g ml ^-1 Amphotericin B).
3. Kultur epithelial-Fibroblasten-Zell ASM Co-Kulturen in einem 70:30 DMEM-F12: DMEM-Medium-Mischung.

4. Setzen von Fibroblasten und Epithelzellen auf Biphasic Scaffold

1. In einer Gewebekulturplatte, genießen die Gerüste in DMEM-Medien ergänzt und bei 37 ° C für 1 Stunde, bevor Zellaussaat.
2. Entfernen Sie die DMEM-Medien ergänzt, legen Sie das Mikrofaser Phase der Gerüst apikal und Samen 1,5 x10 ⁴ MRC5-Fibroblasten-Zellen in 30 ul DMEM-Medien ergänzt. Agitieren Platte auf einem Orbitalschüttler für 2 Stunden, bevor Sie in einem Brutschrank bei 37 ° C 5% CO ₂ in Luft O / N.
3. Drehen Sie das Gerüst auf, so dass die Nanophase Gerüst steht apikal, Samen 3,0 x10 ⁴ CALU3 Epithelzellen in 30 ul DMEM-F12-Medium, ergänzt auf der Nanofaser Phase des Gerüsts und Inkubation for 2 h bei 37 ° C, 5% CO ₂ in Luft vor dem Eintauchen des Gerüsts in 70:30 DMEM-F12: DMEM-Medium ergänzt O / N vor der Übertragung in den Bioreaktor.

5. Setzen von ASM Cells auf die Aligned Scaffold

1. In einer Gewebekulturplatte, tränken die Gerüste in DMEM-ergänztem Medium und Inkubation für 1 h bei 37 ° C vor der Aussaat 2,5 x10 ⁴ Zellen in 30 & mgr; l DMEM-Medium ergänzt und Inkubation für 2 h (37 ° C, 5% CO ₂ in Luft). Tauchen Sie Gerüst in DMEM-Medium ergänzt Rückkehr zu Inkubator und lassen Sie O / N, bevor Sie einen Tri-Kultur in den Bioreaktor.

6. Einrichten des Tri-Kultur mit dem Bioreaktorsystem (Abbildung 7)

1. Legen Sie die zweiphasige Gerüst Dichtung in die Rille in einer Kammer mit der epithelialen Phase nach oben in die Kammer.
2. Legen Sie das ausgerichtet Gerüst unter dem zweiphasigen Gerüst (so ist es neben dem mi istcrofiber Phase des zweiphasigen Gerüst) und verriegeln Sie die beiden Kammern des Bioreaktors zusammen.
3. Zubauen zwei Perfusionsströmung Schaltungen zwei Medienspeicher angeschlossen (DMEM-F12-Medium, ergänzt in apikalen Reservoir DMEM-F12 / DMEM-Medium, ergänzt der basalen Reservoir) und Pumpenmittel um die zwei Schaltungen auf etwa 0,1 ml / min unter Verwendung einer Peristaltikpumpe (40 ml Medium durch jeden Kreislauf zurückgeführt). Haus alle Teile des Systems in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO ₂ in Luft.
4. Nach einer Woche, entfernen Sie die Medien aus dem apikalen Kammer und Kultur die Epithelzellen an der ALI für eine weitere Woche vor der Analyse.

Ergebnisse

Rasterelektronenmikroskopische Bilder von dezellularisierten Atemwege Gewebe oder immunhistologische Bilder von Atemwegs Biopsien identifiziert wünschenswerten Eigenschaften der Atemwege ECM wir in elektro Gerüst Topographien präsentieren wollte: Mutter RBM Matrix aus Fasern etwa 153 nm 30,6 nm ± (Mittelwert ± Standardabweichung n = 50 Messungen ) Durchmesser (3A & 5A), während die Matrix umgebenden RBM war poröser Natur (3C). Immunhistologische Schnitte durch glatte Muskelbündel zeigen vorliegende ASM als ausgerichteten Blätter von Zellen ²¹ (3E). Diese Information wurde verwendet, um die in die elektro Gerüste eingeführt Eigenschaften führen. Eine sich drehenden Dorn konnte stabil drehen bei hohen Geschwindigkeiten (> 2.000 min / 440 m · min ^-1), um Gerüste mit ausgerichteten Fasern. Langsam Dorndrehung (60 Umdrehungen pro Minute 13,2 m · min ^-1) hatte keinen Einfluss auf die Faserorientierung, Aber produziert Gerüste mit gleichmäßiger Dicke als bei Elektrospinnen auf einer statischen Platte. Durch Änderung der Elektrospinnparameter (PET Konzentration und Lösungsflussrate), war es möglich, Gerüsten Fasern mit Durchmessern von einigen Mikrometern oder einigen hundert Nanometern zu erzeugen (Elektrospinnparameter sind in Tabelle 1 angegeben).

Elektrospinnfasern mit äquivalenten Faserdurchmesser von Natur RBM Fasern (150 nm) wurden unter Verwendung einer 6% PET-Lösung hergestellt wird, jedoch in so geringen Konzentrationen PET, Sicken der Fasern aufgetreten ist (4A). Dies wurde durch die Erhöhung der Konzentration des PET-Lösung auf 8%, die gleichmäßige Nanofasern einen durchschnittlichen Durchmesser von 255 nm 2,4 nm ± hergestellt eliminiert (Mittelwert ± SEM) und die durchschnittliche Porengröße von 1,43 um ± 0,02 um (Figuren 4B, 5A und B). Um Nanofasern elektrospinnen war es notwendig, um die Nadel der Größe von 18 G bis 23 G zu reduzieren, so dass langsamere Fließgeschwindigkeiten whilst Aufrechterhaltung einer höheren Strömungsgeschwindigkeit und die Reduzierung nadel Verstopfung, ein wiederkehrendes Problem mit der größeren Nadel. Beim Elektrospinnen Mikrofasern, ein Anstieg in PET Lösung auf> 30% PET zu einer Uneinheitlichkeit der Faserdurchmesser (4F) zusätzlich zu mehreren Verstopfungen an der Nadelspitze auf Grund der hohen Viskosität der Lösung. Uniform Mikrofasermatten einen durchschnittlichen Faserdurchmesser von 2,50 um ± 0,02 um (Mittelwert ± SEM) und die durchschnittliche Porengröße von 10,45 & mgr; m ± 0,13 & mgr; m erzeugt wird, wenn das Elektrospinnen einer 30% wt / vol PET-Lösung bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml / h ^-1 (4F, 5A & B). Sequential Elektrospinnen von Nanofasergerüst direkt auf ein Mikrofaser-Gerüst (immer noch an dem Dorn befestigt) erstellt eine zweiphasige Gerüst (3D). Der mittlere Faserdurchmesser betrugen 280 nm ± 20 nm und 2,30 & mgr; m ± 0,06 um für die Nanofaser und Mikrofaser-Phasen jeweilsvergleichbar mit Abmessungen von einzelnen Nanofasergerüste und Mikrofaser. Zusätzlich kann die Dicke des zweiphasigen Gerüst war ähnlich wie die Summe der einzelnen Nanofaser und Mikrofaser Gerüste (5C). Durch die Erhöhung der Dorndrehzahl (2.000 min / 440 m · min ^-1), wurden stark ausgerichtete Nano- oder Mikrofasergerüste produziert. Die 8% G / V PET Lösung nicht optimal zur Erzeugung ausgerichtet Nanofasern hergestellten Fasern besitzen eine wellenförmige Morphologie (Figur 3F). Eine Erhöhung auf 10% PET annulliert diesen Effekt, jedoch immer noch in Folge einer reduzierten Faserdurchmesser (216 nm 2,2 nm (Mittelwert ± SEM) ±) im Vergleich zu den zufällig ausgerichteten Nanofasergerüste. Faserausrichtung wurde durch Bestimmung der Abweichung jedes Faserwinkel aus dem mittleren Faserwinkel berechnet. In ausgerichteten Nanofasergerüste 79% der Fasern ausgerichtet sind (± 10 ° mittleren Faserwinkel) im Vergleich zu 10,2% der Fasern in dem Zufallsprinzip ausgerichtete Nanofaser Scaffolds (5D).

Die 8% Nanofasergerüst wurde verwendet, um die auf dem RBM Epithelzellen befinden rekapitulieren, und wurde verwendet, um die Kultur der CALU3 Zellen (eine Atemwegsepithelzellen Zelllinie) zu unterstützen. Die 30% G / V Mikrofaser Gerüst, da sie eher poröser Natur wurde verwendet, um die Unterschleimhaut Region nachahmen, und war mit MRC5 Zellen (eine Atemwegs Fibroblasten-Zelllinie) kultiviert. Die 10% G / V ausgerichtet Nanofasergerüst vorgesehen topologischen Referenzierung auf ASM Zellenausrichtung zu gewährleisten, wenn auf dem Schafott kultiviert. Alle drei Zelltypen zeigten eine Zunahme der Lebensfähigkeit, wenn sie auf ihre einzelnen Träger über einen Zeitraum von 2 Wochen (6A) kultiviert und die exprimierten Zelltyp-spezifische Proteine ​​nach 2 Wochen Kulturdauer (6B, 6C und 6D). Die weitere Charakterisierung der einzelnen Zellgerüst Wechselwirkungen wurden an anderer Stelle ^{21 berichtet.} Die sequentielle Elektrospinnen von Nanofasergerüstauf die Mikrofaser Gerüst erzeugt eine zweiphasige Gerüst für die Co-Kultur der CALU3 Epithelzellen und MRC5 Fibroblasten auf die Nanofaser und Mikrofaser-Phasen auf. Das Kultivieren der beiden Zellen miteinander unter statischen Bedingungen wurde an anderer Stelle ²² angegeben. Weitere Arbeiten versuchen, andere Zellschichten zweiphasigen Kultivierungszeiten über 2 Wochen unter statischen Bedingungen hinzuzufügen oder zu erweitern, scheiterten (Daten nicht gezeigt). Die Kultur ein Tri-Schichtenmodell über einen längeren Zeitraum haben wir eine Perfusionsfluss Bioreaktor. Die CALU3 und MRC5-Zellen wurden auf der zweiphasigen Gerüst ausgesät und ASM-Zellen ausgesät auf einer ausgerichteten Gerüstes, und beide wurden getrennt für 2 Tage kultiviert. Die beiden Gerüste wurden dann zusammen gekauft, um einen Dreischichtenmodell der Atemwegswand innerhalb des Bioreaktors (Figur 7) zu bilden. Beide Kammern wurden mit Medium 7 Tage lang perfundiert, bevor das apikale epitheliale Kammer hatte seine Medien entfernt und die Epithelzellen an die kultivierteALI für weitere 7 Tage. Gerüste wurden fixiert und entweder geschnitten und gefärbt, oder ganze Gerüste wurden für zellspezifische Marker immunogefärbt. Schnitte durch das Dreischichtkultur zeigten Zellkerne durch alle drei Schichten der Cokultur (8B) verteilt. Wenn die Zellen für zellspezifische Marker Immunofärbung Epithelzellen bevölkerten die apikale Nanophase als konfluente Zellschicht und eine positive Färbung für Zytokeratin (8C) auf der Mikrofaserphase gefärbten Fibroblasten positiv für S100A4 (8D) und zum die ausgerichteten 10% Gerüst ASM gefärbten Zellen positiv für SM22α (8E), was auf eine gute Überlebensrate jeder Zelltyp innerhalb des 3D-Modells der Luftwegwand.

Abbildung 1. Die Atemwege Bronchiolen. Bronchiale Biopsie von einer schwerenasthmatischen Atemwege, die das Epithel auf der retikulären Basalmembran (RBM), mit dem darunterliegenden submucosalem Region mit mesenchymalen Zellen besiedelt und die umgebenden glatten Muskelbündel mit glatten Muskelzellen glatte Muskulatur von alpha-Aktin (braun) angefärbt besiedelt. Maßstabsbalken zeigt 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2 Eine schematische Darstellung der Elektrospinningtechnik. Eine Spritze mit dem Polymer / Lösungsmittel-Lösung (mit Nadel befestigt) auf einer Spritzenpumpe mit Blick auf den Dorn gelegt. Ein elektrisches Potential wird zwischen der Nadel und Dorn verursacht Fasern von der Nadelspitze ausgestoßen wird und auf dem sich drehenden Dorn abgelegt werden etabliert. Da die Faser durch die Atmosphäre,verdampft das Lösungsmittel verursacht Abscheidung von Polymerfasern auf dem Dorn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Vergleich der elektro Gerüste auf native Atemwegs ECM. Rasterelektronenmikroskopische Bilder von dezellularisierten Basalmembran (A), dezellularisierte Atemwegs bronchiole Querschnitt (C) und einer histologischen Schnitt einer glatten Atemwegsmuskulatur Bündel (gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, Skala bar 40 & mgr; m) (E) im Vergleich zu Nanofaser (B) zweiphasige (D) ausgerichtet ist und (F) PET Gerüste. Bitte klicken Sie hier, um zu seheneine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1 Parameter für Elektrospinnen der Mikrofaser, Nanofaser verwendet und individuell und für die zweiphasige Gerüst ausgerichtet Gerüste.

Abbildung 4. Änderung in PET-Konzentrationen wirkt Fasereigenschaften. Rasterelektronenmikroskopische Bilder der elektro Gerüste von 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% und 35% (EG) (G / V) PET Lösungen versponnen . Ebenfalls gezeigt ausgerichtet sind Gerüste von 8% (D) und 30% hergestellt (H) Gewicht / Volumen PET-Lösungen. AD bei 5.000-facher Vergrößerung abgebildet, EH bei 1,000x Vergrößerung abgebildet. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Abbildung 5. Eigenschaften von elektrogesponnenen PET Gerüste. (A) Verteilungskurven zeigt, Faserdurchmesserverteilung von der netzartigen Basalmembran extrazellulären Matrix (ECM RBM), nach dem Zufallsprinzip ausgerichtet Nano- und Mikro-Faser-Gerüste, und der ausgerichteten Nanofasergerüst. (B) Histogramm, das die relative Porengrößenverteilung in Nano- und Mikrofasergerüste. (C) mittlere Dicke der Nanofaser, Mikrofaser, zweiphasige und ausgerichtet Gerüste (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 6). (D) Histogramm-Plot, der die Abweichung vom Mittelwert der Faserorientierung in zufälliger oder ausgerichteten Nanofasergerüste Scaffold Faseranalyse wurde mit ImageJ-Software durchgeführt. Pmieten klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6. Die Kultur der einzelnen Zelltypen zu den einzelnen Gerüsten. (A) alamarBlue Zellviabilität Assayergebnisse für ASM Zellen ausgerichtet Gerüste CALU3 Zellen auf Nanofasergerüste und MRC5 Zellen auf Microgerüste (Mittelwert ± SEM, n = 3 20). Rasterelektronenmikroskopaufnahmen der Nanofaser, Mikrofaser und ausgerichtete Fasergerüste (B, C und D) und Immunfluoreszenzbilder von CALU3 Zellen E-Cadherin (rot) gefärbt, MRC5 Zellen Vinculin (rot) und ASM Zellen SM22α befleckt (red) alle auf ihre Spezialgerüst (E, F und G jeweils). Hoechst wurde verwendet, um Zellkerne (blau) zu färben, zeigt Maßstab 40 &# 181;. M Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Perfusion System zur dreischichtigen Atemweg Wandmodell. (A) Fotographie der Bioreaktor zur Schlauchpumpe und 2x Medienreservoirs verbunden ist. (B) Schematische Darstellung des dreischichtigen Gerüste. (C) Schematische Darstellung der beiden Bioreaktorschaltungen, wenn der Atemwege Modell wird an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche gehalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8. Complete 3D Atemweg Wandmodell. (A) bronchiale Biopsie der Atemwegswand mit der Schleimhautschicht rot hervorgehoben, markiert das submucosale Region in grün, und die glatte Muskelbündel in Gold hervorgehoben. (B) Schnitt durch Dreischichtatemwegswand bestehend aus zweiphasigen und ausgerichtet Gerüste mit Epithelzellen, Fibroblasten und glatten Muskelzellen nach 2 Wochen Kokultur Fest besiedelt. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) mit Gerüstreflexionsgrad (grau) gleichzeitig abgebildet wird gefärbt. Gerüste wurden fixiert und für die zellspezifische Marker nach 2 Wochen Immunofärbung mit CALU3 Zellen Cytokeratin (grün) angefärbt (C), MRC5 Zellen für S100A4 (grün) (D) und Zellen der glatten Muskulatur für SM22α (rot) gefärbt gefärbt ( E). Maßstabsbalken zeigt 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1.

Diskussion

Die Fähigkeit, Polymerfasern mit strukturellen Eigenschaften vergleichbar mit natürlichem ECM elektrospinnen hat zu zahlreichen natürlichen oder synthetischen Polymeren oder Polymermischungen als elektro diese Umgebungen neu ^geführt. Manipulation der Prozessparameter (einschließlich Polymer Wahl, Polymerkonzentration, Lösungsmittel, Nadelspitze Entfernung und Temperatur) können alle Einfluss Gerüst Eigenschaften; aber einige Parameter haben größeren Einfluss auf Gerüst Eigenschaften als andere ^25,. Beim Ändern PET Faserdurchmesser, fanden wir die Schlüsselparameter, um die Konzentration des Polymers verwendet wird, die Rate, mit der die Polymerlösung war elektro und Durchmesser der Nadel ist. Beim Elektrospinnen ausgerichteten Fasern die wichtigsten Parameter sind die (a rotierenden Dorn) Sammlungsverfahren, und die Geschwindigkeit, mit der sich der Dorn dreht. Durch die Verringerung der Dorngeschwindigkeit auf 60 Umdrehungen pro Minute, fanden wir, die nach dem Zufallsprinzip ausgerichtet Gerüste hergestellt zeigte eine größere Gerüst uniKonformität gegenüber Elektrospinnen auf einer flachen Kollektorplatte.

Die Merkmale des dezellularisierten Atemwegsgewebe wurden analysiert, um Führung für die verschiedenen Gerüst Topographien für die Kultur von jedem Luftweg Zelltyp entwickelt werden. Elektrogesponnenen Nanofasern sind ein attraktiver Gerüst Basalmembran Strukturen aufgrund der geringen Porengröße aber insgesamt hohe Porosität, die für eine erhöhte Stoffwechsel Diffusion, während die Beschränkung zelluläre Bewegung ermöglicht replizieren. ⁹ Während der Optimierung der Elektrospinnparameter, wurden eine Reihe von PET-Konzentrationen und Flussraten getestet. Die dünnsten Fasern wurden mit einem 6% Gewicht / Volumen PET-Lösung, die zuvor von anderen Gruppen verwendet werden, erreicht. Jedoch ein hohes Maß an Perlen, und ein Mangel an Einheitlichkeit waren ständig Probleme. Anfängliche Versuche, um das Bördeln entfernen enthalten Zugabe eines kationischen Tensids, Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), zu der Lösung, um die Oberflächenspannung zu senken, und das Testen verschiedener Quellenvon PET. Die Zugabe von Tensid reduziert die Menge der Perlen, aber nicht vollständig. Nach dem Versuch, eine Reihe von kommerziellen Quellen von PET-Granulat, Trinken Lebensmittelqualität Flasche PET verwendet wurde, durch Zerschneiden Getränkeflaschen und Auflösen dieser in der DCM: TFA Lösungsmittel-Lösung. Mit diesem als die PET Quelle führte zu einer Erhöhung der Fasergleichmäßigkeit und eine Verringerung der Faser Bördeln. Durch Erhöhung der Lösungskonzentration leicht auf 8% G / V und die Verringerung der Nadeldurchmesser (18G bis 23G) wir konsequent defektfreie Nanofasern mit einem Faserdurchmesser von etwa 250 nm hergestellt. Elektrogesponnenen Nanofasergerüste können stark elektro bei der Abholung vom Dorn macht manuelle Handhabung der Gerüste schwierig sein. Dies wurde durch die Speicherung der Gerüste in Aluminiumfolie nach dem Spinnen und Einweichen in 70% IMS vor der Anwendung verbessert. Dies schien zu helfen, leiten die elektrostatische Aufladung Rest links auf dem Gerüst aus der Elektrospinnverfahren.

Nach oben stellenographien ähnlich wie die einzelnen Mikroumgebungen von den drei wichtigsten Atemwegszelltypen innerhalb der Atemwege Wand gestoßen, eine grundlegende Elektro Protokoll wurde angepasst, um drei einzigartige Gerüste für diesen Zelltypen herzustellen: durch Elektrospinnen einer niedrigen Konzentration PET Lösung langsam, wurden zufällig ausgerichteten Nanofasern erzeugt wird, , auf die Epithelzellen wurden ausgesät (imitiert die RBM). Durch Elektrospinnen einer höheren Konzentration PET-Lösung bei einer schnelleren Rate, wurden zufällig ausgerichteten Mikrofasern erzeugt (Herstellung eines poröser Scaffold), in welche Fibroblasten ausgesät (Nachahmung der submukösen Bereich unmittelbar unterhalb der RBM). Durch Elektrospinnen einer niedrigen Konzentration PET Lösung auf eine mit hoher Geschwindigkeit drehenden Dorn ausgerichteten Nanofasern wurden hergestellt, auf die glatten Muskelzellen in der Faserrichtung orientiert, wodurch ausgerichteten Blätter von Zellen.

Erhöhte Faserdurchmesser führen zu einer erhöhten Porengröße, so dass größere Zell penetration in Gerüsten und so zur Schaffung eines echten ^{3D-Umgebung,.} Mikrofaser Gerüste wurden für die Kultivierung von Fibroblasten in der Studie verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen residiert auf mehreren Ebenen innerhalb des Gerüsts. Durch Erhöhung der PET Konzentration von 30% Gewicht / Volumen, wurden PET-Fasern mit einem mittleren Durchmesser von 2,5 um hergestellt. Größeren Durchmesser Fasern (≈ 4 um) wurden unter Verwendung einer 35% wt / vol PET-Lösung hergestellt, jedoch Gleichförmigkeit Gerüstdicke war verloren und höhere Variabilität zwischen einzelnen Fasern war offensichtlich. Poren in der Mikrofaser Gerüst waren mehr als 7-mal größer als die in den Nanofasergerüste gemessen (10,45 & mgr; m vs 1,43 & mgr; m), aber immer noch statische Aussaat von Zellen bereitgestellt begrenzten zellulären Penetration. Dies wurde durch dynamisches Aussäen der Zellen unter Verwendung eines Orbitalmischers, gezeigt, dass sie eine zuvor wirksame Methode verbessert.

Stark ausgerichtete Nanofasergerüste wurden durch Elektrospinnen einer 10% erstelltbei 2000 Upm Gewicht / Volumen PET-Lösung auf den Dorn dreh (≈ 440 m · min ^-1). Die PET-Konzentration von 8% erhöht werden, um ein unregelmäßiges wellenförmige Morphologie, die Fasern bei niedrigeren Konzentrationen zeigten verhindern. Trotz der Zunahme der Konzentration, die Ausrichtung der Fasern reduziert die durchschnittlichen Faserdurchmesser (216 nm gegen 255 nm, gegen zufällige ausgerichtet). Die hohe Geschwindigkeit des Dorns Ziehen der Fasern, bevor sie getrocknet wurden, dürfte diese Wirkung hervorrufen. Die Ausrichtung der Fasern beeinflusst die Ausrichtung des ASM-Zellen und auch andere physiologische Wirkungen auf die ASM-Zellen, die bereits an anderer Stelle ²¹ gekennzeichnet sind.

Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist die Unfähigkeit, Bild lebenden Zellen auf / in den Gerüsten Treffen Sie zunächst die zell Befestigung oder Differenzierung über einen längeren Zeitraum nicht möglich, ohne Proben zu bestimmen. Das bedeutet, die meisten Optimierung nach der Kulturperiode auftritt, dh fixing Proben und dann die Messung, ob der Zellkultur wurde erfolgreich nach der nicht während der Zellkultur. Beobachten einer Farbänderung in Gerüste in alamarBlue inkubiert (blau zu rosa) zeigt Zellen vorhanden und lebensfähig sind, ist aber nicht ideal. Elektrospinnen transparenter Polymere wie Gelatine konnten bei der Visualisierung Zellen auf den Gerüsten zu unterstützen. Das Elektrospinnen einer Nanofasergerüst innerhalb unseres Modells erlaubt die Replikation des Atemwegs RBM, ähnlich dichten Nanofasern auf der die Epithelzellen wohnen zusammen. Es wurde zuvor gezeigt, dass Strukturzellen nicht durch die Nanofasergerüst ²² wandern, obwohl Immunzellen in der Lage sind (Daten nicht gezeigt). Während für die Kultivierung von spezifischen Zelltypen auf einer 3D-Oberfläche vorteilhaft (wie epitheliale und endotheliale Zellen), kann diese Prävention struktureller Zellmigration durch die Nanofasern nachteilig für die Kultivierung von anderen Zelltypen sein. Wie der glatten Muskulatur kann nicht durch Th migrierene ausgerichtet Nanofasergerüst montiert wir die dreischichtige Co-Kultur mit der glatten Muskelzellen und Fibroblasten-Schichten einander gegenüber (an der ausgerichteten Gerüst zwischen den beiden Zelltypen gegenüber). Während dies ermöglicht es den Zellen, die in enger Apposition ist, kann die vorliegende Studie nicht feststellen, ob ein Zelltyp (entweder die Fibroblasten oder glatten Muskelzellen) würde die gesamte Schicht über eine längere Kulturzeit zu überholen. Trotz dieser Einschränkungen ist eine lebensfähige Dreischichtmodell der Atemwegswand entwickelt, das eine alternative Plattform, um die Wechselwirkungen zwischen diesen multiplen Zelltypen zu untersuchen. Eine ähnliche dreischichtigen Studie wurde kürzlich veröffentlicht, wo Fibroblasten wurden in einem zylindrischen Kollagen I Hydrogels mit glatten Muskelzellen auf der äußeren Oberfläche und Epithelzellen innerhalb der luminalen Oberfläche ¹⁷ ausgesät eingebettet. Die mechanische Stabilität der elektroGerüste hier entwickelten wäre ähnlich Rohr ermöglichen Konstrukte gebildet werden soll, und bleibt ein Strom research Ziel innerhalb unserer Gruppe. Während die Studie über die Atemwege, verschiedene Organe im Körper teilen diese Grund Schleimhaut-Struktureinheit und durch Veränderung der Mieter konzentriert in dieser Studie hervorgehoben, könnten ähnliche Plattformen für Gewebe, das eine Basalmembran Einheit, die Blutgefäße, die Blase und entwickelt werden Die Hornhaut, wobei auf Kollagenbasis mehrschichtigen Modellen verwendet worden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene terephthalate (PET)	Lucozade (GSK) bottles	N/A	Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary
Dichloromethane (DCM)			Solvent for PET
Trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma		Solvent for PET
Rotating Mandrel	Built in house		Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented
Syringe Pump	Harvard apparatus		used in the electrospinning process
DMEM-F12	Gibco		Culture medium for CALU3 cells
DMEM	Gibco		Culture medium for HASM cells
MEM	Gibco		Culture medium for MRC5 cells
Antibiotic/ antimycotic solution	Gibco		Media supplement
FCS	Gibco		Media supplement
Orbital mixer (Orbital shake 503)	Stuart Scientific		For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds
Peristaltic Pump	Watson Marlow		For providing media flow through bioreactor
3DKube	Kiyatec		Bioreactor for 3D cell culture