Modélisation encéphalopathie de prématurité Utilisation prénatale hypoxie ischémie avec un lipopolysaccharide intra-amniotique chez le rat

Résumé

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Résumé

Encéphalopathie de prématurité (EOP) est un terme qui englobe le système nerveux central (SNC) anomalies associées à la prématurité. Pour meilleurs objectifs avance de translation et de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les lésions cérébrales associées à la prématurité, des modèles précliniques de EoP doit inclure des mécanismes similaires de blessure mondiale prénatale observée chez les humains et d'impliquer plusieurs composants du système maternelle-placentaire et fœtale. Idéalement, les modèles devraient produire un spectre similaire de déficits fonctionnels chez l'animal mature et récapituler les multiples aspects de la physiopathologie. Pour imiter systémiques défauts humains placentaires de perfusion, underperfusion placentaire et / ou chorioamniotite associées à l'inflammation induite par un agent pathogène au début de la prématurité, nous avons développé un modèle de prénatale transitoire systémique hypoxie-ischémie (TSHI) combinée avec un lipopolysaccharide intra-amniotique (LPS). Dans rats Sprague-Dawley enceintes, via TSHI utérine occlusion de l'artère on jour embryonnaire 18 (E18) induit un défaut de underperfusion placentaire graduée associée à une augmentation des dommages du système nerveux central chez le fœtus. Lorsqu'il est combiné avec des injections de LPS intra-amniotique, l'inflammation placentaire est augmentée et les dommages du système nerveux central est mélangé avec de la substance blanche, la démarche et d'imagerie des anomalies associées. Prénatale tshi et TSHI + LPS insultes prénatales répondre à plusieurs des critères d'un modèle EoP y compris récapitulant l'insulte intra-utérine, provoquant la perte de neurones, les oligodendrocytes et les axones, la perte d'embase, et les déficits fonctionnels chez les animaux adultes qui imitent ceux observés chez les enfants nés extrêmement prématuré. En outre, ce modèle permet la dissection de l'inflammation induite par types de blessures divergentes.

Introduction

Avec plus de 12% des enfants nés aux États-Unis avant 37 semaines de gestation estimée ¹ âge, périnatale lésion cérébrale (PBI) à partir de la prématurité est une cause importante d'invalidité permanente. PBI de prématurité, encéphalopathie également appelé de la prématurité (EOP), affecte l'ensemble du système nerveux central (SNC). Lésion du SNC commence souvent in utero, et est aggravée par les processus de soins prénatals, y compris les complications postnatales et chorioamniotite tels que l'hypoxie et la septicémie. PBI des insultes systémiques altère le développement neurologique et conduit à la paralysie cérébrale, l'épilepsie, retard cognitif et de nombreux troubles neuropsychiatriques touchant la régulation émotionnelle, la mémoire et les fonctions exécutives ^1,2. Bien que beaucoup de progrès ont été réalisés, une compréhension limitée reste la façon dont les conséquences cellulaires et moléculaires de lésion du SNC de naissance prématurée se traduisent par la multitude de séquelles neurologiques chez les enfants qui sont nés avant terme. Ce manque de biche connaissancesERS diagnostic en temps réel des CNS gravité des blessures et le dosage informé de nouvelles interventions. En outre, les stratégies thérapeutiques adaptées à l'âge de cette population de patients vulnérables demeurent insaisissables.

L'inflammation intra-utérine est très commun dans l'extrême prématurité et implique une cascade inflammatoire materno-fœtale-placentaire complexe ^3. Infection intra-utérine est souvent subclinique. Conclusions placentaires spécifiques compatibles avec une inflammation aiguë ou chorioamniotite histologique, sont des déterminants majeurs de la réponse inflammatoire du fœtus et coïncident avec les blessures du cerveau associée à la prématurité ^3-5. En effet, la réponse inflammatoire du fœtus a des implications cliniques distinctes pour les résultats à long terme de la prématurité. Les nourrissons qui sont petits pour l'âge gestationnel (SGA) ou qui éprouvent infection sont extrêmement vulnérables aux déficits neurologiques ^3,4. Chorioamniotite est une naissance prématurée diagnostic pathologique typique suivante ^{6,7, et l'examen histologique révèle des signes d'inflammation dans 70% des placentas de bébés nés très prématurés 4. En outre, la chorioamnionite est associée à une déficience cognitive à deux ans 8. Preuve de underperfusion vasculaire maternelle dans le placenta des nourrissons nés extrêmement prématurés est également associée à la paralysie cérébrale dans l'enfance 9. L'impact synergique de chorioamniotite et placentaires défauts de perfusion est bien illustrée par le risque élevé de résultats remarquablement neurologiques anormaux dans cette population de patients à deux ans de 10,11 ans.}

Pour imiter les défauts systémiques de perfusion placentaire humaines et chorioamniotite associées à l'inflammation induite par un agent pathogène, nous avons développé un modèle de prénatale transitoire systémique hypoxie ischémie (TSHI) combinée avec un lipopolysaccharide intra-amniotique (LPS) chez le rat. Notre objectif était d'adapter notre modèle de TSHI seul rats ^12-16 pour inclure une inflammation intra-utérine,pour faciliter la modélisation préclinique de lésion du SNC associée à la prématurité. Seul TSHI a révélé la perte persistante de cellules de la lignée oligodendrogliales, les neurones corticaux, l'augmentation de la mort cellulaire, et des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires, avec des intervalles ischémiques progressives conduisant à un modèle gradué de blessures compatibles avec lésion cérébrale prénatale ^16. Les modifications des composants ischémiques de ce modèle ont également démontré des déficits de codage de la mémoire, et la mémoire à court terme et à long altérations musculo-squelettiques chez le rat doux car ils vieillissent ^17-19. En effet, nous avons déjà démontré que la combinaison de TSHI + LPS récapitule les caractéristiques physiopathologiques de EoP, y compris les oligodendrocytes et la perte neuronale, lésions axonales, l'inflammation cellulaire et des anomalies fonctionnelles ^20.

Protocole

Soins en établissement et à utiliser des comités à l'hôpital de deux enfants de Boston et de l'Université du Nouveau-Mexique Health Sciences Center ont approuvé toutes les procédures expérimentales.

REMARQUE: Avant de commencer la procédure, joint, stériliser et autoclave tous les instruments chirurgicaux et des draps chirurgicaux. En outre, de préparer les médicaments post-opératoires dans des flacons stériles, y compris 0,125% bipivucaine et 0,1 mg / kg de buprénorphine. Aussi préparer la solution lipopolysaccharide (LPS) stérilement: 0,04 mg / ml de LPS (0111: B4) dans une solution saline stérile contenant diluer colorant bleu d'Evan.

1. Anesthésie

1. Induire une anesthésie dans un jour embryonnaire 18 (E18) enceinte rat Sprague Dawley avec un mélange de 3% d'isoflurane équilibrée 70% d'azote et 30% d'oxygène.
2. Retirer rat de la chambre d'induction et placer le décubitus dorsal de rat sur drapé couverture de circulation d'eau chirurgicale réglé à 37 ° C. Transfert anesthésie pour cône de nez et de réduire isofluraNE niveau à 2%.
3. Appliquer doucement pommade ophtalmique à chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée. Au cours de la procédure surveiller en permanence la température, le taux de respiration et le rythme de l'animal de coeur. La physiologie maternelle devrait rester stable tout au long de la procédure.

2. Préparation chirurgicale et Gommage

1. Utilisation tondeuse pour petits animaux supprimer tous les poils dans la région inférieure de l'abdomen. Raser dans un motif rectangulaire avec soin pour éviter de couper les mamelons ou générer rasoir éruption cutanée qui peut être irritant pour les soins infirmiers avenir de chiots nés vivants.
2. Préparer la peau abdominale par l'application de l'éthanol gommage povidone-iode et 70% en alternance avec des tampons de coton stériles. Répétez le gommage de telle sorte que la povidone-iode et 70% d'éthanol sont chacun 3x appliqué de manière alternée. Laisser sécher.
3. Confirmez profondeur de l'anesthésie par l'absence de pincement pincée réflexe. En l'absence de réflexe et de stimuli à la douleur, réduire le niveau de l'isoflurane à 1%.
4. En utilisant des serviettes chirurgicales stériles,draper l'animal. Prenez soin de placer les rideaux à un angle approprié de telle sorte qu'ils maximisent la quantité de liquide d'irrigation, ils absorbent tout en ne gênant pas la circulation sanguine vers les cornes utérines.

3. abdominale laparotomie

1. L'utilisation d'un scalpel faire une incision médiane de 3 cm dans la peau abdominale préparé. Carrément disséquer la couche de la peau de l'aponévrose abdominale avec des ciseaux. En utilisant des pinces et ciseaux chirurgicaux, élever le fascia abdominal et faire une incision de l'alba avasculaire linea pour accéder à la cavité péritonéale.
2. Placer gaze chirurgicale à l'extérieur de l'incision et humidifier avec une solution saline stérile. En utilisant le forceps émoussé et une pression externe sur l'abdomen, retirer délicatement les cornes utérines de la cavité péritonéale et les disposer sur la gaze humidifiée.
3. Soigneusement éviter l'enchevêtrement et le contact avec les intestins. Organiser foetus en utilisant une pince en communiquant avec seulement le tissu musculaire entre les deux sacs amniotiques individuels.Exposer et isoler les artères utérines 4 utilisant dissection.
   NOTE: Il faut prendre soin de disséquer les artères utérines. Tissus environnants et les navires eux-mêmes sont extrêmement délicates. Les dommages aux vaisseaux maternels peut provoquer des saignements, et dans les cas graves, la mort fœtale et maternelle.

4. Placement d'anévrisme Clips

1. Placez un anévrisme G pince rat 30 sur chaque artère utérine. D'assurer la cessation de la circulation sanguine, y compris proximale et distale impulsions, et l'assombrissement des vaisseaux utérins dont placentas individuels. Couvrir les cornes exposées et tout le champ opératoire avec de la gaze et irriguer avec une solution saline stérile. Prenez soin de garder le terrain humide avec l'irrigation d'environ toutes les 10 min.
2. Après 60 min, retirer la gaze et irriguer le champ. Veiller à ce que les cornes utérines et les vaisseaux sont suffisamment humidifiées pour le retrait du clip de succès. Retirez délicatement chaque clip d'anévrisme en utilisant une pince. Prenez soin de ne pas causer un traumatisme à la cuve, et maintl'intégrité des tissus Ain lors de l'enlèvement.
3. Rincer soigneusement les cornes utérines et terrain, en prenant soin d'enlever toutes les discussions errants de gaze des sacs amniotiques.

5. L'injection de lipopolysaccharide pour amniotique Sacs

1. A la base de chaque sac amniotique individuelle, juste en avant de la plaque placentaire, injecter 100 ml de LPS (4 ug / sac) avec un colorant bleu de Evan diluée dans le liquide amniotique. Utilisez pince émoussée à stabiliser et à faire tourner chaque sac amniotique dans une position optimale pour l'injection. Colorant bleu de Diluer Evan est un agent de contraste qui est utile pour confirmer le placement de la seringue et l'injection correcte.
   REMARQUE: Utilisez uniquement un ultra-fine seringue 0,3 ml à l'insuline avec joint 8 mm 31 G aiguille pour les injections intra-amniotique. Utilisation de grandes aiguilles de calibre se traduira par la perte de liquide amniotique chronique, mort fœtale et la réabsorption de la grossesse. De petites quantités de liquide amniotique fuite lors du retrait de la seringue peuvent être mitigATED par une pression directe sur le sac amniotique. Certains fœtus de rat peuvent tolérer un degré de oligohydramnios. Toutefois, la perte de liquide amniotique aiguë de ponction avec de grandes aiguilles de calibre, ou perforation accidentelle entraînant une fuite chronique de liquide, les résultats dans la perte du fœtus et dans les cas graves, la perte de grossesses voisins.
2. Irriguer l'utérus cornes 3x avec une solution saline stérile.

6. Fermeture de la laparotomie

1. En utilisant des pinces, retourner soigneusement les cornes utérines à la cavité péritonéale. Assurer un espace suffisant entre les sacs amniotiques et l'incision médiane, re-rapprocher les bords de la couche musculofascial utilisant une course suture de soie 3-0. Soyez conscient de l'emplacement des sacs amniotiques lors de la fermeture de l'incision musculaire. Soyez prudent de ne pas suturer dans ou à travers un sac.
2. Re-approximation de la couche de peau, en utilisant une suture 3-0 fonctionnement de la soie, la fermeture de la couche de peau.
   NOTE: La laparotomie doit être fermé dans deux couches de sutures continues pour permettrepour la peau et de dilatation musculaire avec l'augmentation de la gestation. Sutures continues permettent de tension de la plaie uniformément répartie. Sutures interrompues sont moins désiraient que plusieurs noeuds sont irritants et peuvent être facilement mâchés par le rat sur la récupération de l'anesthésie. Agrafes chirurgicales ne sont pas souhaitées. Tails de noeuds chirurgicaux doivent être coupés très court (<3 mm).
3. Injecter 1 ml de 0,125% bupivacaïne voie sous-cutanée bords autour de la plaie à l'aide d'une aiguille 26 G. Administrer une dose de 0,1 mg / kg par voie sous cutanée à la buprénorphine nuque.
4. Éteignez l'isoflurane et serviette rat sèche que possible. Placez dans un endroit propre cage de la maison et surveiller le rétablissement de l'anesthésie. Assurer rat ne devient pas d'hypothermie.

7. postopératoire Récupération et soins

1. Surveiller le rat tous les 8-12 h pour 72 h, puis tous les jours jusqu'à chiots sont nés (environ E22 ou E23). Administrer des doses supplémentaires de buprénorphine q8-12 h / 72 h ou prn comme dicté par le IACUC.
2. Surveiller les rats pour des signes de douleur, l'inconfort, des saignements vaginaux ou des saignements du site chirurgical. Inspectez les sutures et incision et veiller à ce rat est pas mâcher ou de retirer leurs sutures prématurément. Bien exceptionnellement rare, les rats qui compromettent leurs sutures sont à risque de déhiscence de la plaie.
   NOTE: Parfois rats peuvent ingérer des quantités excessives de literie ou des articles non alimentaires, appelé pica, comme un effet secondaire de l'administration de la buprénorphine. Bien que très rare, les rats doivent être surveillés pour pica et l'obstruction de l'intestin potentiel ultérieur.

8. Traitement des tissus et Cryosectioning

1. Pour se préparer à l'hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration du cerveau postnatal, enlever les chiots de leur cage sur postnatale jour 2 (P2). Avec des ciseaux chirurgicaux décapitent les ratons et retirez délicatement le cerveau du crâne.
2. Déposer correctif cerveau dans un tube conique de 15 ml contenant 7 ml de paraformaldehyde à 4% dans une solution saline tamponnée au phosphate(PBS). Placez cerveau à 4 ° C et fixer pendant 72 heures.
3. Après 72 heures, transférer cerveaux à une solution PBS stérile contenant 30% de saccharose (p / v) et revenir à 4 ° C.
   NOTE: Une fois que les cerveaux tombent dans la solution de saccharose ils sont prêts à être sectionnée sur un cryostat.
4. Geler rapidement les cerveaux et monter sur un pilon cryostat pour l'acquisition de coupes coronales congelées. Couper 20 um coupes coronales congelées et monter sur des lames. Assurer sections sont recueillis en série.
5. Laisser les lames sécher à la température ambiante pendant la nuit. Magasin glisse à -20 ° C.

9. hématoxyline & éosine

1. Prenez coulisseau monté coupes congelées et chaud à la température ambiante.
   NOTE: Préparer toutes les solutions fraîches.
2. Placer les lames sur une lame de jeu plus chaud à 50 ° C pendant 2 heures.
3. Transfert glisse à un support de coloration. Tremper les lames 10x dans de l'eau distillée deux déminéralisée (ddH _{2 O).}
4. Incuber les lames à 100% hématoxyline pendant 5 min. Timoi dans hématoxyline peut être optimisée en fonction de degré de coloration pourpre.
5. Tremper les lames 4x prise H _{2 O,} et laisser reposer dans un endroit propre robinet H _{2 O} pendant 1 min.
6. Tremper les lames 15x dans l'alcool de l'acide (250 ml éthanol à 70% + 1 ml d'acide chlorhydrique concentré).
7. Tremper les lames 4x prise H _{2 O,} et laisser reposer dans un endroit propre robinet H _{2 O} pendant 1 min.
8. Incuber dans du carbonate de lithium à 1% pendant 2 min.
9. Tremper les lames 4x prise H _{2 O,} et laisser reposer dans un endroit propre robinet H _{2 O} pendant 1 min.
10. Incuber à 95% d'éthanol pendant 1 min.
11. Tremper les lames 7X 100% éosine. Nombre de creux dans l'éosine peut être modifié selon le degré de coloration rose.
12. Tremper les lames 5x dans 95% d'éthanol.
13. 5x Dip de diapositives dans un nouveau changement de 95% d'éthanol.
14. Incuber les lames dans de l'éthanol à 100% pendant 1 min.
15. Incuber les lames dans un nouveau changement de 100% d'éthanol pendant 1 min.
16. Incuber les lames dans du xylene à 100% pendant 15 min.
    REMARQUE: étapes xylène etlamelles devrait se produire dans une hotte.
17. Incuber les lames dans de nouveaux changements de xylene pendant 15 minutes.
18. Lamelle avec Permount et laisser sécher dans une hotte.
19. Image glisse avec un microscope optique.

Résultats

Après TSHI + LPS au E18, hématoxyline et éosine révèle des anomalies significatives histopathologiques dans le placenta (Figure 1) et dans le cerveau (Figure 2). Placentas examinés sur E19 et E21 sont grossièrement oedémateux avec des micro-hémorragies, et une nécrose au long de la caduque et labyrinthe. Infiltrat inflammatoire importante et augmentation de la vascularisation est également observée. Brains examinés sur P2 révèlent ventriculomégalie, ainsi que la matière...

Discussion

Encéphalopathie de prématurité est difficile de modéliser des animaux en raison de l'interaction complexe des étiologies, évolution dans le temps du développement neurologique, la complexité de la formation du réseau cérébral humain, les mécanismes de blessures qui se chevauchent, et les divers phénotypes de SNC insulte manifeste chez les prématurés humaines. EoP est associé à des vulnérabilités spécifiques de type cellulaire (c.-à-oligodendrocytes immatures) ^21, ainsi que le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
LPS 011B4	Sigma	L2630
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Surgical gloves	Biogel	40870
OR Towels	Cardinal Health	287000-008	Sterile
PDI Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62
Mini Arco Rechargeable Clippers	Kent Scientific Corp.	CL8787
Betadine surgical scrub	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	00023-0312
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Scissors	Roboz	RS-6808
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	F.S.T.	14002-16
Syringe	BD	309628	1 ml
Needle	BD	305122	25G 5/8
Needle	BD	305128	30G 1
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	Small, 6 inch sterile
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS600109	12.5 CM STR
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS600120	30G Pressure
3-0 Perma Hand Silk Sutures	Ethicon	1684G	Black braided, 3-0 (2 metric), 18", non-absorbable,  PS-1 24 mm needle, 3/8 circle
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31G
Pentobarbital
Buprenorphine
Bupivacaine
Isoflurane
Lithium Carbonate	Acros Chemicals	554-13-2
Superfrost Plus Microscope Slides	VWR	48311-703
Hematoxylin	Leica	3801521	Surgipath Gill II Hematoxylin
Eosin	Leica	3801601	Surgipath Eosin
Xylenes	Fisherbrand	X3S-4	Histological Grade
Permount	Fisherbrand	SP15-100
Coverglass	Fisherbrand	12-548-5P	Fisher Finest Premium Coverglass