Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología

Resumen

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Resumen

Accidente cerebrovascular que afecta a las cuentas de la materia blanca de hasta el 25% de los accidentes cerebrovasculares presentaciones clínicas, se produce en silencio a velocidades que pueden ser 5-10 veces mayor, y contribuye de manera significativa al desarrollo de la demencia vascular. Pocos modelos de derrame cerebral focal materia blanca existen y esta falta de modelos apropiados ha dificultado la comprensión de los mecanismos neurobiológicos implicados en la respuesta lesión y reparación después de este tipo de accidente cerebrovascular. La principal limitación de otros modelos de accidente cerebrovascular subcortical es que no restrinjan de manera focal del infarto de la sustancia blanca o principalmente han sido validados en las especies no murinos. Esto limita la capacidad de aplicar la amplia variedad de herramientas de investigación murinos para estudiar la neurobiología de la carrera de la materia blanca. Aquí presentamos una metodología para la producción fiable de un derrame cerebral focal en la sustancia blanca murino mediante una inyección local de un inhibidor de eNOS irreversible. También presentamos algunas variaciones en el protocolo general entre ellos dos estereotáctica únicovariaciones, la localización neuronal retrógrada, así como el etiquetado de disección de tejido fresco y que en gran medida ampliar las posibles aplicaciones de esta técnica. Estas variaciones permiten múltiples enfoques para analizar los efectos neurobiológicos de esta forma común y poco estudiada de accidente cerebrovascular.

Introducción

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocolo

El uso de animales en este protocolo se ha realizado de acuerdo con los procedimientos aprobados por la Universidad de California en Los Ángeles Cuidado de Animales y el empleo.

Nota: Comience por identificar la población objetivo murino. En estudios anteriores, de tipo salvaje ratones C57 / Bl6 solamente masculinas se han utilizado, sin embargo varios ratones transgénicos o knockout también se pueden utilizar. Tenga en cuenta que las coordenadas estereotácticas se basan en C57 / Bl6 anatomía. Se recomienda que cada usuario verificar inicialmente la localización de la carrera a la sustancia blanca.

1. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua medial

1. Comience por la preparación de una pipeta de vidrio tirado usando tubo capilar 0,5 mm de tal manera que el diámetro distal es de entre 15 a 25 micras ^11.
2. Preparar una alícuota de 10 l estéril de L-Nio (N (5) - (1) -iminoethyl-L-ornitina HCl) a 27,4 mg / ml (130 mM) en solución salina normal estéril al 0,9%.
3. Pre-llenar la pipeta de vidrio tiradocon un pequeño volumen de L-Nio (2-5 l) fijando el pipeta de vidrio a un tubo conectado a una línea de vacío. Acostar a la pipeta sobre la mesa de trabajo e introduzca el extremo tirado en la solución de L-Nio.
   1. Aplicar el vacío hasta que al menos 2 mm de la porción de 0,5 mm de la pipeta se llena. Apague el vacío y retirar la pipeta. Coloca a un lado hasta Paso 1.12.
4. Coloque el ratón en una cámara de inducción e inducir anestesia del ratón usando estándar de 32% de isoflurano fluía a través de un vaporizador (5 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N ₂₎ durante 1 min o hasta que profundamente anestesiados. Transferir el ratón para un aparato estereotáxico equipado con un microscopio estereotáctica. Proporcionar anestesia de mantenimiento utilizando 32% de isoflurano fluido a través de un vaporizador (2 L / min inhalado con 5 L / min de oxígeno y 0,5 L / min N ₂₎ y un cono de nariz. Comprobar la profundidad de la anestesia con una pizca dedo del pie.
5. Ajuste el brazo de la inyección de 36 °.
6. Affixa sacó titular de la pipeta de vidrio al extremo distal de un sistema de inyección a presión de bajo volumen y adjuntarlo al brazo de la inyección de la configuración estereotáctica.
7. Escudo bigotes del animal anestesiado con vaselina y lugar artificial ungüento de lágrimas sobre ambos ojos. Preparar un campo quirúrgico estéril mediante la colocación de un campo estéril sobre la cabeza del animal con una abertura de 5 a 10 cm sobre la cabeza. Preparar una superficie quirúrgica aspetic por el afeitado de la piel que recubre el cráneo. Limpiar el cuero cabelludo con la alternancia de betadine y el 70% algodones con alcohol.
8. Hacer una incisión media de 1,5 cm del cuero cabelludo con unas tijeras finas estériles para exponer la superficie del cráneo. Se seca el cráneo con un hisopo de algodón estéril y usando un microscopio estereotáctica en 1-3x magnificación, retirar cualquier tejido del periostio que recubre el uso de una herramienta de punto de micro estéril.
9. Marcar el bregma como punto de referencia con un marcador de punta fina.
10. Perforar una craneotomía ellipitical 2 mm con una broca quirúrgica estéril fina stip0; comenzando posterior al bregma y que se extiende hacia delante justo a la izquierda de la línea media. Eliminar fragmentos de hueso y el tejido superior de blando, de manera que la corteza cerebral puede ser visualizado.
11. Mantenga el campo quirúrgico y la superficie cortical húmedo aplicando intermitentemente gotas de solución salina estéril.
12. Colocar una pipeta de vidrio tirado al brazo inyector del aparato estereotáxico. Alinear el extremo distal de la pipeta con la Bregma y poner a cero las coordenadas estereotácticas.
13. Avanzar en la pipeta a la primera anterior / posterior (A / P) y medial / lateral (M / L) coordenadas proporcionadas en la Tabla 1.
14. Avanzar en la pipeta a la superficie cortical y cero el ventral (V D /) medición dorsal /.
15. Pasar lentamente la pipeta en el cerebro hasta llegar a la primera D / V de coordenadas en la Tabla 1.
16. El uso de un sistema de inyección de baja presión de volumen ajustado a 20 psi durante 20 ms pulsos, inyectar 100 nl de L-Nio en el cerebro y esperar 5 minutos para prevenir el reflujohasta la pista de la pipeta.
    1. Utilizar una retícula calibrada en el ocular del microscopio estereotáctica y un aumento de 3 veces.
    2. Por consiguiente, desplazar a un total de 0,100 mm ³ (0,5 mm de longitud en una pipeta 0,5 mm de diámetro, que corresponde a 100 nl) de la pipeta de vidrio tirado para cada conjunto de coordenadas. Mediante el uso de una retícula, medir y estandarizar ya que cada organizadas varía según la ampliación y las escalas utilizadas.
    3. Para la medición exacta del volumen durante cada inyección, el enfoque de la pipeta en ángulo con el microscopio de un lado para que el menisco aire-líquido tiene una vista sagital. El menisco debe aparecer en el mismo plano focal, tanto de la pared interior y exterior de la pipeta.
17. Retire lentamente la pipeta y repita los pasos 1.13-1.16.3 en el segundo y tercer conjunto de coordenadas que figuran en la Tabla 1.
18. Después de la inyección final, retire la pipeta y colocar la cera suficiente hueso para llenar el sitio de la craneotomía. UNpproximate los bordes de la herida del cuero cabelludo y se unen con adhesivo dérmico.
19. Inyectar 0,1 ml de 0,5% bupivacaína en los márgenes de la herida utilizando un 30 G aguja estéril para evitar para prevenir el dolor local asociado con la incisión del cuero cabelludo.
20. Devolver el animal a la vivienda y suministro de antibióticos postoperatorios (0,48 mg / ml de trimetoprim-sulfametoxazol, o 0,5 mg / ml levofloxacino) en el agua de bebida durante 5 días.

2. Sustancia Blanca carrera de inducción - Aproximación oblicua posterior

1. Realice los pasos 1.1 a 1.12 como en el protocolo de enfoque en ángulo medial, excepto ajustar el brazo de la inyección de la configuración estereotáctica a 45 grados orientados anterior a la posterior.
2. Avanzar en la pipeta a la primera A / P y M / L de coordenadas que figuran en la Tabla 2.
3. pasos restantes completos 1.14-1.20 como en el protocolo de enfoque en ángulo lateral.

3. El etiquetado neuronal retrógrada

1. Preparar una estéril 10alícuota l de L-Nio a 54,8 mg / ml en solución salina normal al 0,9%.
2. Preparar una alícuota estéril de 20% Fluororuby (o 20% de amina de dextrano biotinilado o 2% Fluorogold) en solución salina normal al 0,9%.
3. Diluir juntos 1: 1 para concentraciones finales de 27,4 mg / ml L-Nio y 10% Fluororuby.
4. Realizar el protocolo de ACV como anteriormente en las etapas 1.3-1.23.
5. Visualizar el trazador fluorescente de forma nativa en la sección de tejido mediante fijación por perfusión, cryosectioning y microscopía como se ha descrito previamente ^8.

4. Procesamiento de tejidos para la inmunofluorescencia

1. En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia a los ratones a través de la sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
2. Abrir la cavidad torácica con unas tijeras en ángulo e insertar una aguja 23 G de la mariposa en el ventrículo izquierdo.
3. Coloque una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras finas para permitir una vía de salida para el líquido de perfusión.
4. Transcardially perfundir con 30-40 ml de solución salina tamponada con fosfato fría, seguido de 30 a 40 ml de paraformaldehído al 4% frío a una velocidad de 10 ml / min a TA.
5. Decapitar al ratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo por detrás y luego retire con cuidado el cráneo recubre con una espátula, colocar el cerebro en frío PFA al 4% durante 24 horas, y luego se transfieren a un 30% de sacarosa en PBS durante 48 horas .
6. Preparar cuarenta secciones micras flotantes usando un criostato y realizar el procesamiento de anticuerpo como se describe anteriormente ^6-8. En este estudio, utilice los siguientes anticuerpos: (: 500 dilución 1); de conejo anti-neurofilamentos 200 conejo anti-vimentina (1: 500); de cabra anti-GFAP (1: 500); conejo anti-Iba-1 (1: 1.000).

5. Procesamiento de tejidos para la proteína o el análisis de ARN

1. En un intervalo posterior al accidente cerebrovascular adecuada que varía de 3 horas a 14 días después del accidente cerebrovascular, la eutanasia mediante sobredosis de isoflurano o CICUAL local aprobó procedimiento.
2. decapitar alratón y eliminar el cerebro con unas tijeras estériles para abrir el cráneo posterior y retire suavemente el cráneo recubre con una espátula.
3. Insertar un 4 mm espátula estéril en la parte delantera del cerebro para cortar el bulbo olfatorio y los nervios ópticos. Levante suavemente el cerebro fuera de la bóveda craneal y el lugar en tampón de disección enfriado con hielo (solución salina equilibrada de 1x Hank, 25 mM HEPES-KOH, pH 7,4, glucosa 35 mM, bicarbonato de sodio 4 mM, y 0,01 mg / ml ciclohexamida).
4. El uso de un bloque de cerebro y cuchillas de afeitar estériles nuevas, preparar losas 2-3 mm que contienen la carrera y el lugar en el tampón de disección fría.
5. Bajo un microscopio de disección, identificar la materia blanca de la corteza motora subyacente en el hemisferio inyectado. A intervalos post-carrera más larga, la región puede ser identificado visualmente por necrosis focal y la palidez de la mielina.
   Nota: A intervalos post-ictus anteriores, la inyección de L-Nio mezcla con 1 l de 10% Fast Green puede permitir la identificación visual de la carrera ( Figura 4A).
6. Bajo la guía de un microscopio de disección y el uso de un bisturí fresca, diseccionar cuidadosamente la región de la sustancia blanca que contiene el accidente cerebrovascular, identificado por cualquiera de etiquetado verde rápida o pérdida de tejido. Retirar la corteza suprayacente y el cuerpo estriado subyacente si lo deseas.

Resultados

Usando el modelo presentado, la sustancia blanca subyacente extremidad anterior corteza sensoriomotora fiable puede ser objetivo. Este modelo accidente cerebrovascular inducida químicamente produce axonal focal y la pérdida de mielina, astrocitosis y microgliosis (Figura 1), como se ve típicamente en infartos lacunares humanos. Mediante el uso de tres inyecciones, un modelo de utilidad clínica se establece con deterioro temprano en las tareas motoras miembro delanter...

Discusión

Un número de modelos anteriores de accidente cerebrovascular subcortical se han descrito incluyendo inyecciones focales de endotelina-1 en la cápsula interna, materia blanca subcortical y el cuerpo estriado en la rata y el ratón ^{12 a 14 6,15.} Los modelos más recientes de pequeños accidentes cerebrovasculares focales han utilizado la inyección microembolias colesterol en la arteria carótida y la oclusión ¹⁶ photothrombotic de una sola de las arteriolas penetrantes ^17. C...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810