Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen

Zusammenfassung

Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen eingesetzt werden und liefert höhere Peptidspiegel sowie ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form. Daher wird dieses Verfahren ein wertvolles Werkzeug in der Peptid Forschung sein.

Zusammenfassung

Die Forschung im Bereich der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Dazu gehört oft die Messung von Peptiden Regulierung der Nahrungsaufnahme. Für die korrekte Bestimmung der Konzentration des Peptids, sollte es während der Blutverarbeitung stabil sein. Dies ist jedoch nicht der Fall für mehrere Peptide, die durch endogene Peptidasen schnell abgebaut werden. Vor kurzem haben wir eine Blutverarbeitungsverfahren unter Verwendung von R educed Temperaturen entwickelt, A cidification, rotease P Hemmung, I sotopic exogenen Kontrollen und D ilution (RAPID) für die Verwendung in Ratten. Hier haben wir diese Technik für den Einsatz beim Menschen festgestellt und untersucht Erholung, molekulare Form und zirkulierende Konzentration der Nahrungsaufnahme regulatorischen Hormone. Die RAPID Verfahren erheblich verbessert die Erholung für ¹²⁵ I-markierte Somatostatin-28 (+ 39%), Glucagon-like Peptid-1 (+ 35%), Acyl- Ghrelin und Glukagon (+ 32%), Insulin und kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), Leptin(+ 21%) und Peptid YY _3-36 (+ 19%) im Vergleich zu Standard - Verarbeitung (EDTA - Blut auf dem Eis, p <0,001). Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigte die Elution von endogenen Acyl Ghrelin an der erwarteten Position, nachdem eine schnelle Verarbeitung, während nach Standardverarbeitungs 62% der Acyl Ghrelin abgebaut wurden in einem früheren Peak resultierende Wahrscheinlichkeit darstellt Desacyl Ghrelin. Nach dem schnellen Verarbeitung der Acyl- / Desacyl Ghrelin - Verhältnis im Blut von normalen gewichtigen Probanden betrug 1: 3 im Vergleich zu 1.23 folgende Standardverarbeitung (p = 0,03). Auch endogene kisspeptin Werte waren höher nach RAPID Vergleich zu Standardverarbeitung (+ 99%, p = 0,02). Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen verwendet werden, ergibt höhere Peptidspiegel und ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form.

Einleitung

Angesichts der weltweit zunehmenden Verbreitung von Fettleibigkeit ^1,2, Forschung auf dem Gebiet der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Während bisher nur ein Peptid bekannt ist , dass peripher produziert und wirkt zentral Nahrungsaufnahme zu stimulieren, nämlich Ghrelin ^3, in den letzten Jahrzehnten hat sich ein breites Spektrum von Peptiden worden , die Aufnahme zu reduzieren Lebensmittel identifiziert, z. B. Leptin, Peptid YY (PYY) und auch Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und Insulin - ⁴ daher in Studien , die die Regulationsmechanismen von Hunger und Sättigung Peptidspiegel sucht werden oft beurteilt und zugleich wird angenommen , dass das Peptid untersucht ist stabil und mit hoher Ausbeute während der Plasmabildung wiedergewonnen. Doch sehr oft ist dies nicht der Fall aufgrund der schnellen endogenen Abbau nach wie vor für zB gezeigt. Ghrelin , die aus Acyl abgebaut wird Ghrelin ⁵ bis Desacyl. Deshalb haben wir beschrieben, vor kurzem die schnelle Methode zur Blut VorarbVerwendung von R educed Temperaturen bei Ratten singen, A cidification, rotease P Hemmung, ich sotopic ⁶ exogene Kontrollen und D ilution. Dieses Verfahren verbessert die Erholung für 11 von 12 Peptiden getestet und für die Bestimmung des richtigen zirkulierende molekularer Form im Vergleich zu Standardblutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis) erlaubt ^6. Dieses Verfahren wurde in mehreren nachfolgenden Studien ^7-12 zur Detektion von zirkulierenden Ghrelin sowie Corticotropin-Releasing - Faktor ¹³ verwendet. Daher hat das Verfahren für die Peptidforschung in Nagetieren als nützlich erwiesen. da Nagetier Studien sind jedoch nicht immer übersetzbar zu anderen Spezies, soll das Verfahren auch für die Verwendung im menschlichen Blut hergestellt werden.

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die schnelle Methode zur Blutverarbeitung beim Menschen im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung, EDTA - Blut auf dem Eis zu testen, die weit ¹⁴ empfohlen und häufig uin der klinischen sowie Forschungs Einstellung sed. Wir testeten die Wiederherstellung einer Auswahl von ¹²⁵ I-markierten Peptiden in der Regulation der Nahrungsaufnahme einschließlich etablierten Peptide beteiligt sowie neue Kandidaten vor kurzem in der Fütterung Regulierung eine Rolle zu spielen vorgeschlagen folgende Verarbeitung (Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme sind in Tabelle 1 gezeigt) mit beiden Methoden. Hormone wurden auch verwendet, um Peptide von unterschiedlicher Länge und Ladung (Tabelle 2) ausgewählt. Darüber hinaus für Ghrelin untersuchten wir die molekularen Form (en) nach dem Standard und schnelle Methode. Schließlich wir endogene Ghrelin (acyl und Desacyl Ghrelin) sowie kisspeptin Ebenen bewertet, ein Peptid , auch vor kurzem vorgeschlagen , eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme ^15,16 folgenden RAPID oder Standard - Verarbeitung zu spielen. Darüber hinaus untersuchten wir auch diese Peptid - Werte in einer Population von Patienten mit einer breiten Palette von Body - Mass - Index ( im Bereich von 10,2 bis 67,6 kg / m ²⁾ possib zu studierenle Unterschiede zu chronisch veränderte Körpergewicht bezogen.

Diagnose, Bewertung und Plan:
Die Studienteilnehmer
Alle Studienteilnehmer wurden neu Patienten im Krankenhaus (Aufnahme innerhalb von zwei Tagen nach der Aufnahme ins Krankenhaus war) der Abteilung für Psychosomatische Medizin an der Charité-Universitätsmedizin Berlin und gab informierte Zustimmung geschrieben. Um zu vermeiden, wurden keine Auswirkungen von Geschlecht nur weibliche Patienten eingeschlossen. Insgesamt 42 Probanden nahmen an dieser Studie und wurden in drei Gruppen eingeteilt: Normalgewicht (BMI 18,5 bis 25 kg / m ^2, n = 12), Anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m ^2, n = 15) und Adipositas (BMI> 30 kg / m ^2, n = 15). Anorexic und adipösen Patienten warennach der Internationalen Klassifikation der Krankheiten-10 diagnostiziert und für die Gewichtszunahme (Anorexia nervosa) oder Gewichtsreduktion (Adipositas), die jeweils im Krankenhaus. Alle Normalgewicht Patienten wurden ausschließlich auf somatoforme Symptome ohne relevante somatische Störungen ins Krankenhaus. Patienten mit Magen-Darm-somatoforme Symptome oder einer Vorgeschichte von Magen-Darm-Chirurgie wurden ausgeschlossen. Ausschlusskriterien umfassten auch ein Alter <18 Jahre, aktuelle Schwangerschaft und unbehandeltem psychotischen Erkrankungen. Die Blutentnahme wurde am Tag 2 oder 3 nach Einlieferung ins Krankenhaus durchgeführt, bevor diätetischen Behandlung, um Aufnahmekörpergewicht zu erhöhen oder zu verringern, beziehungsweise. Anthropometrische Parameter wurden am selben Tag untersucht.

Protokoll

Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Humanforschung genehmigt (Protokollnummer EA1 / 114/10).

1. Blutverarbeitung

1. Venöses Blut von 7.00 bis 08.00 Uhr nach nächtlichem Fasten aus einem Unterarm Vene und Verfahren nach Standardverfahren oder der RAPID-Methode. Weisen Sie die Themen nicht ausüben oder rauchen vor der Blutentnahme.
2. Für Standard-Verarbeitung, sammeln Blut in gekühlten EDTA-enthaltenden Röhrchen und Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und halten bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay.
3. Für die schnelle Verarbeitung, sofort Blut verdünnen (innerhalb von 1 min nach der Blutentnahme) 1:10 in eiskaltem Puffer (pH 3,6), enthaltend 0,1 M Ammoniumacetat, 0,5 M NaCl und Enzyminhibitoren (Diprotin A, E-64-d, Antipain , Leupeptin, Chymostatin, 1 & mgr; g / ml). Dann Zentrifuge innerhalb von 10 min bei 3000 xg für 10 min bei 4 ° C und sammle Überstand using einer Pipette in Polypropylenröhrchen nach wie vor ⁶ bei Ratten beschrieben.
   1. Lade Chromatographie Patronen (360 mg, 55 bis 105 & mgr; m) mit 100% Acetonitril (Rate 10 ml / min), ins Gleichgewicht mit 0,1% Trifluoracetat (TFA, Rate 10 ml / min) und die Last mit dem Überstand bei einer konstanten Geschwindigkeit von 1 ml / min eine Spritzenpumpe.
   2. Danach waschen Kartuschen mit 3 ml 0,1% TFA (Rate 10 ml / min) und langsam mit 2 ml 70% Acetonitril, das 0,1% TFA (2 ml / min) eluiert.
   3. Trockene eluierten Proben unter Verwendung von Vakuum Zentrifugation und bei -80 ° C bis zur weiteren Verarbeitung durch Radioimmunoassay.
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in Polypropylen (RAPID - Verarbeitung) und Borosilikat (Radioimmunoassay) Rohre , die deutlich niedrigere Oberflächenbindungseigenschaften aufweisen und somit Peptidverlust für die meisten der vor ²⁶ suchten Peptide minimieren.

2. Messungen

Hinweis: Die Schritte in diesem Abschnitt sollte in einem Labor durchgeführt werden,für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen zertifiziert. Standard - Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit ¹²⁵ I genommen werden sollte.

1. Wiederherstellung von radiomarkiertem Peptides
   1. Erhalten Sie ¹²⁵ I-radiomarkierte menschliche Peptide (z. B. Acyl-Ghrelin, GLP-1, Glukagon, Insulin, kisspeptin, Leptin, nesfatin-1, PYY _3-36 und Somatostatin-28).
   2. Halten Peptide in Pulverform, bis das Experiment, dann frisch verdünnt in 0,1% Essigsäure (~ 100.000 cpm pro ml).
   3. Für Standard-Blutverarbeitung, direkt nach der Blutentnahme in ein gekühltes EDTA enthaltenden Röhrchen, je 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 50 ul radioaktiven Marker enthält 3000-6000 cpm (direkt gezählt, bevor das Experiment beginnt).
   4. Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut aus EDTA-Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer, enthaltend (Zusammensetzung siehe 1.3) und 500 & mgr; l radioaktiven Marker enthält 30.000-60.000 cpm. Aufgrund der 1:10 Verdünnung Einsatz 10-mal höheres Volumen an radiolabel für eine schnelle Verarbeitung.
   5. Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben.
   6. Für die Wiederfindungsversuche, nicht trockene Proben durch Vakuum Zentrifugation und lagern nicht bei -80 ° C. Stattdessen beurteilen Gewinnung von radioaktiv markierten Peptiden direkt danach einen Gamma-Zähler verwendet wird.
   7. Messen Sie die gesamte Überstand in Standardproben, während in RAPID Proben 1/10 des Gesamtvolumens analysieren Vergleichbarkeit der Menge an radioaktiver Markierung verwendet zu erhalten. Zur Messung den Überstand in den Rohren in den Gamma-Zähler Einbau und die Zählungen pro Minute beurteilen
   8. Als 100% ige Standard, verwenden Sie zwei Proben mit 50 ul ¹²⁵ I-radiomarkierten Peptid , das die Verarbeitung nicht unterziehen. Messen, die gleichzeitig mit anderen Proben, wie in 2.1.7 beschrieben.
   9. Führen Sie die Experiment fünf bis sechs Mal für jedes Peptid.
2. High Performance Liquid Chromatography of Radiolabeled Ghrelin
   1. Ziehen Sie Blut in chilled EDTA-Röhrchen und je 1 ml in Röhrchen, die 200 & mgr; l radiomarkierten-acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm (gezählt direkt bevor das Experiment beginnt) enthält.
   2. Für die schnelle Verarbeitung, Übertragung 1 ml Blut in ein Röhrchen mit 9 ml RAPID-Puffer (Zusammensetzung siehe 1.3) und 200 & mgr; l radiomarkierte Acyl- Ghrelin enthält 15.000-20.000 cpm.
   3. Danach Prozessproben wie in den Schritten 1.2 bis 1.3.2 beschrieben.
   4. Zur weiteren Analyse durch Umkehrphasen-HPLC, laden direkt Proben auf eine stabile Bindung C18-Säule (2,1 mm x 50 mm, 1,8 & mgr; m), äquilibriert in 17% Acetonitril in Wasser (beide mit 0,1% TFA ergänzt).
   5. Nach 5 min Äquilibrierung mit einem Gradienten von 17 bis 40% Acetonitril verwenden, um die Probe in 40 min (Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min) zu eluieren.
   6. Sammle Fraktionen von 1 ml pro Minute und zu analysieren, die Radioaktivität eines Gamma-Zählers verwendet wird.
   7. In einem separaten Experiment, Last 200 ul radioaktiv markiertes Acyl Ghrelin enthält 15.000-20.000cpm auf die Säule direkt und HPLC zuführen, wie 2.2.4 bis 2.2.6 in Schritten beschrieben.
3. Radioimmunoassay
   1. Für Radioimmunoassay, auftauen gefrorenen Stände (Standardverarbeitung) und getrocknete Pulver (RAPID-Methode) bei Raumtemperatur-Vakuum.
   2. Unmittelbar vor dem Radioimmunoassay, resuspendieren trockenen RAPID Proben in doppelt destilliertem H ₂ O nach dem ursprünglichen Volumen von Plasma (500 ul).
   3. Beurteilen kisspeptin und insgesamt (einschließlich sowohl Desacyl und Acyl Ghrelin) sowie acyl Ghrelin wie zuvor beschrieben ^12,27 kommerziellen Radioimmunoassays verwendet , gemäß der Herstellerprotokolle. Verwenden Sie Borosilikat-Rohre, die stabile Pelletbildung ermöglichen.
      1. Am ersten Tag, inkubiere die Proben mit Testpuffer und primärem Antikörper (z. B. anti-Ghrelin) in der Verdünnung durch den Hersteller für einen Zeitraum von 24 Stunden vorgesehen ist .
      2. Am zweiten Tag, fügen Sie die ¹²⁵ I - Tracer (zB ¹²⁵ I-Ghrelin), voRTEX und für einen Zeitraum von 24 Stunden inkubieren.
      3. Am dritten Tag, fügen Sie das Fällungsreagenz, Wirbel und Inkubation, wie vom Hersteller empfohlen. Dann Zentrifugenröhrchen bei 3.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie die Überstände und zählen Radioaktivität in den Pellets mit einem Gamma-Zähler mit
   4. Berechnen Desacyl Ghrelin als Differenz der gesamten minus Acyl- Ghrelin. Beurteilen Sie die Acyl / Desacyl Ghrelin Verhältnis von Acyl von Desacyl Ghrelin für jede einzelne Probe dividiert wird.
   5. Verarbeiten Sie alle Proben - wenn möglich - in einer Charge Variabilität zwischen den Tests zu vermeiden. Die Intra-Assay-Variabilität in dem vorliegenden Experiment war <8% für kisspeptin, <7% für insgesamt und <9% für Acyl Ghrelin.

3. Statistische Analyse

1. Bestimmen Sie die Verteilung der Daten des Kolmogorov-Smirnov-Test. Express-Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM).
2. Beurteilen, Unterschiede zwischen zweiGruppen durch t-Test. Beurteilen Sie die Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen von allen paarweisen Mehrfachvergleichsverfahren (Tukey post hoc - Test) oder Zwei-Wege - ANOVA , gefolgt von Holm-Sidak Methode.
3. Betrachten Sie p <0,05 signifikant und führen Analysen ein Statistik - Programm.

Ergebnisse

RAPID Blutverarbeitung erhöht die Ausbeute von ¹²⁵ I-radiomarkierten Peptide im menschlichen Blut im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung.
Nach Standardblutverarbeitungs (EDTA Blut auf Eis), war die Rückgewinnung von radiomarkierten Peptide ~ 60% in 9/9 Peptide ( im Bereich von 48 bis 68%, 1A - K). Schnellverarbeitung , die Ausbeute in allen ¹²⁵ I-markierte Peptide, nämlich in Somatostatin-28 (+ 39%, 1A),

Diskussion

Wir berichteten vor , dass die schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Erholung für 12.11 Peptide im Vergleich zu Standardblutverarbeitung bei Ratten verbessert ^6. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass dieses Verfahren auch für die Anwendung beim Menschen geeignet ist. Im Anschluss an eine schnelle Verarbeitung, die Erholung für 9 von 9 ¹²⁵ I-markierten Peptiden getestet wurde verbessert im Vergleich zu Standard - Blutverarbeitung (EDTA - Blut auf Eis). Die beobachtete Verbesserun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin	Millipore, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioactive
GLP-1	Millipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioactive
Glucagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioactive
Insulin	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioactive
Leptin	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioactive
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioactive
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioactive
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	Radioactive
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioactive
Total ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	Radioactive
Active ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioactive
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA	online download