En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Resumen

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

Resumen

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Introducción

Las caspasas son proteasas de cisteína que median la muerte celular por apoptosis mediante la escisión de muchas proteínas intracelulares después de residuos de aspartato clave. Por ejemplo, caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras, nucleasas de ADN derepress, componentes del citoesqueleto escinden y alteran la composición de lípidos de las membranas celulares para desmantelar rápidamente las células y estimular su reconocimiento y la inmersión por las células que disponen de los cadáveres célula vecina. ^1-4 Se estima que miles de millones de células mueren por día en el cuerpo humano, y la apoptosis es un mecanismo importante de la muerte de células tumorales inducida por la quimioterapia. ⁵ un conjunto diferente de las caspasas puede causar la muerte celular por procesos no apoptóticas distintas para estimular la inmunidad innata. ⁶ por lo tanto, mayoría de las investigaciones sobre las caspasas se ha centrado en sus funciones a favor de la muerte.

Curiosamente, las primeras pruebas en el campo reveló que los mismos caspasas responsables de promover la muerte de las células también tienen no la muerte funciones. Estudios pioneros han demostrado que las caspasas están implicadas en diversas funciones celulares en las células sanas, incluyendo la regulación de la proliferación celular y la migración durante la embriogénesis. ^7-9 se requieren caspasas para la individualización spermatid en Drosophila ^10,11, para el bloqueo de una vía de la muerte celular necroptotic alternativa en ratones ^12,13, y para el procesamiento de microARN en C. . elegans ^14,15 En quizás los más longevos células, las neuronas, las caspasas y otra maquinaria apoptótica están implicados en la regulación de la actividad neuronal mediante la poda de terminaciones sinápticas, un proceso que se cree que es esencial para el fortalecimiento de otras sinapsis para el aprendizaje y la memoria ^{16-. 18} es posible que las caspasas facilitar la poda sináptica por un tipo de mini-apoptosis de las proyecciones neuronales diminutas sin muerte de células enteras. ¹⁹ sin embargo, las caspasas pueden tener funciones alternativas no relacionadas con eventos de apoptosis similares. ^20,21 papel Duals en la vida y la muerte no son exclusivos de las caspasas; BCL-2 y proteínas de la familia del citocromo c tienen papeles en la energética celular en las células sanas, pero también son parte de la ruta apoptótica núcleo que se activa por muchos tipos de estrés celular. ^22-25 Aunque no está comprobado, parece lógico que la evolución ha vinculado día -Jobs hasta la muerte, puestos de trabajo en las mismas moléculas para asegurar la eliminación oportuna de las células no aptas o no deseables.

En la actualidad, los mecanismos moleculares de la actividad de caspasa no apoptótico no se entienden, y el grado de actividad de la caspasa no apoptótico durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos también no se conoce. Un reto importante es la dificultad de distinguir día-trabajos desde death-puestos de trabajo de las caspasas. En contraste con la apoptosis y pyroptosis, cuando la actividad de caspasa se amplifica por una cascada proteolítica, se espera que los trabajos diurnos de las caspasas se produzca a niveles mucho más bajos de actividad enzimática, probablemente por debajo de la detección por muchos tecn disponiblesgías.

Antes del trabajo presentado aquí, otros desarrollaron una variedad de biosensores de caspasa para diferentes propósitos. Los biosensores de SCAT (por ejemplo, ECFP-DEVD-Venus) detectar rápidamente la actividad de caspasa en tiempo real en células cultivadas y tejidos animales utilizando FRET. ^26,27 Tras la escisión de la caspasa, la fracción GFP dirigido al núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sufre relocalización subcelular dentro de minutos cuando su membrana de sujeción plasma es escindido por las caspasas. ²⁸ del mismo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocaliza desde el citosol al núcleo tras la escisión de la caspasa. ^29,30 Más recientemente, el cromóforo en iCasper fue diseñado inteligentemente a emitir fluorescencia cuando se escinde por caspasas, lo que permite la detección de la actividad de biosensor en tiempo real en las neuronas de embriones de Drosophila, pero principalmente en asociación con la muerte celular de desarrollo. muerte ³¹ dependiente de caspasa de las neuronas olfativas durante el envejecimiento estaba demonstclasificado por inmuno-detección de la forma de la caspasa-escindido de biosensores CPV (por ejemplo, mCD8-PARP-Venus). ^32,33 Es importante destacar que, se detectó la forma activada de la caspasa-3 en ausencia de muerte celular por inmunotinción sensible en espinas de neuronas cultivadas, y en el soma usando la fluorescencia dependiente de caspasa del colorante indicador CellEvent nuclear, pero se encontraron dificultades debido a la foto-toxicidad, aunque la muerte celular se retrasa hasta después de la eliminación columna vertebral. ¹⁹ por lo tanto, se necesitan nuevos biosensores caspasas para detectar y realizar un seguimiento de las células con actividad de caspasa basal in vivo.

Para superar estas dificultades, hemos generado un nuevo biosensor de color caspasa doble, designado CaspaseTracker. Esta estrategia combina una versión modificada del biosensor Apoliner Drosophila caspasa-sensible ²⁸ con el sistema FRT recombinasa Drosophila G-TRACE ³⁴ para etiquetar y rastrear células en vivo de forma permanente. ^{35 El sistema G-TRACE activado-Gal4 permite que los niveles muy bajos de caspasas para activar CaspaseTracker, lo que resulta en la expresión de RFP en el citoplasma y la expresión de GFP dirigido al núcleo permanente en cualquier célula que nunca ha experimentado la actividad de caspasa. 35 Este sistema puede etiquetar las células durante toda la vida en animales enteros utilizando Drosophila melanogaster, un sistema modelo tratable y ampliamente utilizado para el estudio de las caspasas y la muerte celular. 36-38}

Protocolo

1. Preparación de las moscas CaspaseTracker

1. Para preparar CaspaseTracker (DQVD) vuela de experimentos, realice esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Stop> GFP-nls), mediante la transferencia de 7-10 hembra virgen (o macho) las moscas que lleva el sustrato de la caspasa-biosensor mCD8 DIAP1-Gal4 impulsada por el promotor de ubiquitina ³⁵ junto con el mismo número de hombres (o mujeres) moscas G-TRACE, que tienen el segundo cromosoma equilibrador CyO para evitar la letalidad de la combinación homocigótica del G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, y Ubi> Stop> GFP-nls) ^34. Lugar vuela en un vial de alimentos frescos con pasta de levadura fresca como fuente de proteínas.
2. Incubar los archivos a 18 ° C durante 5 a 7 días (máximo 2 semanas) y luego retire el padre vuela desde el vial para evitar el hacinamiento con la nueva progenie, y la creación de nuevos viales de cría.
3. Continuar la incubación a 18 ° C hasta que la progenie vuela eclose. Seleccione la no CyO [no-cURLy ala] progenie del genotipo correcto de CaspaseTracker, que son transgénicos para los elementos CaspaseTracker y ^G-35 TRACE.
4. Al mismo tiempo, generar control parental W118 moscas no transgénicas y la caspasa-insensibles (DQVA) vuela en paralelo para verificar RFP CaspaseTracker específica y la fluorescencia de GFP.
5. Realizar el genotipado por PCR para confirmar los archivos con CaspaseTracker utilizando los cebadores: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producir un producto de 3897 pb. Para la genotipificación los loci G-Trace, utilice los siguientes cebadores para GFP (474 ​​pb), 5'-GAC CAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GAG GCC GAT AGT C; para la solicitud de propuestas (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC GTC CAG CTT GGA CAC GTA GTA GTA GC; y para Flpase (655 pb), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-CCG TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Para la genotipificación de Gal4 en el vector pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC TCG CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Preparación del tejido, tinción y montaje

1. Para las disecciones de moscas, evitar que los tejidos disecados se peguen a las puntas de pipeta de plástico y tubos de centrífuga, puntas de la capa y tubos con albúmina de suero bovino al 1% (BSA) disueltos en agua.
2. Dissect vuela sobre un cojín de silicona con fórceps.
   1. Para evitar daños en la punta de pinzas sobre una superficie dura cuando se realiza la disección del tejido, realice la disección en una superficie de silicio. Para la fabricación de placas de disección de silicona, fundir el silicio en el kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lista de Materiales). Después de fundir la silicona, añadir de 3 a 4 ml a una placa de cultivo tisular de diámetro 60 mm. platos de silicio pueden ser reutilizados.
   2. Anestesiar a una mosca con CO _2, y la transfiere a una placa de silicona con 1 ml de PBS frío. Introducir el CO ₂ a un vial que contiene la marcha usando una pistola de aire, y luego transferir la mosca t anestesiadasOA cojín que tiene un suministro de _CO2.
   3. Use un par de pinzas para sujetar la cabeza de la mosca, y un segundo par de pinzas para tirar del tórax en la dirección opuesta para desconectar la cabeza mosca del cuerpo que cubre sin dañar la conexión entre la cabeza y el intestino anterior.
   4. Use 2 pares de pinzas para quitar las alas y las patas del tórax.
   5. Use un par de pinzas para sostener el tórax, y otro par de pinzas para tirar del abdomen para separarlo del tórax de nuevo sin dañar la conexión entre el intestino anterior y del intestino medio.
   6. Diseccionar los órganos internos, incluyendo cerebro, intestino, tubos de Malpighi y los ovarios como se ha demostrado anteriormente. ^39-41
   7. Retire todas las piezas de la cutícula y los cuerpos grasos con unas pinzas, ya que estos tejidos producen fuertes autofluorescencia. La paciencia y la práctica se requieren para preparar un sistema de órgano completo, como se muestra.
3. Transferir los tejidos disecados a 1,5 mL tubos de centrífuga, y fijar tejidos wiTH 0,5 ml de paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) a TA durante 20 a 30 minutos con rotación en la oscuridad para evitar RFP blanqueo y GFP en los tejidos. Evitar la fijación prolongada que puede comprometer los resultados de tinción posteriores.
4. Retire el paraformaldehído por pipeteo suave y lavar 3 veces con 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) a TA.
5. Permeabilizar los tejidos con 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante la noche con agitación suave. incubaciones cortas pueden causar permeabilización y el compromiso de tinción resultados incompletos.
   1. Si es necesario para reducir la tinción de fondo, considere la incubación de los tejidos en 0,5 ml de PBST con 1% de BSA, en lugar de PBS.
6. Lavar los tejidos 3 veces con 0,5 ml de PBST.
7. Para la tinción de los núcleos y la actina filamentosa (F-actina), aplicar 0,5 ml de PBST con 10 mg / ml de Hoechst 33342 tinte nuclear azul y 0,3 M Alexa Fluor mancha 633 faloidina F-actina y se incuba de forma simultánea con los tejidos durante 1 h a TA wITH rotación suave en la oscuridad. Evitar las manchas prolongado ya que esto aumentará el fondo.
   1. Para la inmunotinción, incubar fija y permeabilizadas tejidos con 0,1% Triton X-100 en 0,5 ml de PBS durante la noche a 4 ° C, tinción con dilución 1: 100 de anticuerpo anti-ELAV o con dilución 1: 200 de anti-caspasa-3 durante la noche a 4 ° C (300 l). Siga por el correspondiente anticuerpo secundario diluido 1: 100 y se incuba durante 1-3 h a TA. Ver Lista de Materiales para obtener información anticuerpo específico.
8. Lavar los tejidos 3 veces, cada una durante 5 minutos en 0,5 ml de PBST con rotación suave.
9. Con una pipeta, retire todo el PBST, y luego añadir 200 l anti-blanqueador de un medio de montaje (ver materiales) para cubrir completamente los tejidos durante 1-3 horas a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la noche. tejidos óptimas que han absorbido plenamente el agente de montaje se hundirá hasta el fondo del tubo.
10. Pre-limpiar el portaobjetos de vidrio con agua o etanol al 70% y transferir los tejidos con el agente de montaje a los glass de diapositivas.
11. Con cuidado, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre los tejidos. Aplique vaselina en el portaobjetos de vidrio y la hoja de la cubierta para evitar la destrucción del tejido por compresión excesiva. Eliminar los agentes de montaje adicional con papel de seda.
12. Sellar la hoja de la cubierta mediante la aplicación de esmalte de uñas a lo largo de los bordes de la hoja de la cubierta para evitar la fuga de agentes de montaje de los tejidos.

3. Microscopía Confocal

1. Utilizar un microscopio de epi-fluorescencia confocal invertido. Sin embargo, microscopios arriba-derecha también se pueden utilizar. Para tejidos de imagen utilizando suelo de baldosas, mantener estable a temperatura ambiente para evitar la deriva de enfoque y el desplazamiento de plano xy debido a la expansión y contracción térmica de los componentes. sistemas de control ambiental y sistemas de compensación de deriva enfoque ayudan a evitar este problema debido a la pérdida de termo-equilibrio del sistema de microscopio.
2. Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio. Tome algunas imágenes de prueba usando baja resolución (125 x 125 píxeles) de unad determinar el número adecuado de azulejos necesarios para cubrir toda la región de interés (ROI).
3. Establecer el sistema de barrido microscopio para capturar imágenes con una resolución de escaneo tales como 500 x 500 píxeles. Seleccione el objetivo tales como 20X NA 0,8 o un 1,4 NA objetivo 63X Plan-Apocromático para el análisis de tejidos a través de cubreobjetos de vidrio, de manera que cada una de las imágenes (azulejos) se solapa en un 20% en todos los lados.
4. Establecer la secuencia de imágenes de largo al más corto longitudes de onda de excitación, como la luz de longitud de onda larga provoca menor de foto-blanqueo. La secuencia del más largo al más corto de longitud de onda de excitación es de: (i) 633 nm para faloidina F-actina y para el anticuerpo a caspasas activadas, (ii) 561 nm para RFP, (iii) 488 nm para GFP, y (iv) 405 nm para Hoechst tinción nuclear.
5. Durante estas pruebas, minimizar la exposición de las células a excitación láser fluorescente durante el proceso de obtención de imágenes para evitar la foto-blanqueo mediante la reducción de la intensidad del láser para obtener imágenes de alta calidad de los tejidos.
6. Despues de que yomagos se recogen, fusionar las imágenes utilizando el software de microscopio.

Resultados

Existen dos componentes clave que permiten CaspaseTracker para detectar la actividad de la caspasa en las células sanas normales (Figura 1A). El primero de ellos es un polipéptido de la caspasa-escindible 146 amino ácido el modelo de la caspasa biosensor Apoliner (Figura 1b). ²⁸ Este polipéptido se deriva de DIAP1 (inhibidor de Drosophila de apoptosis) que contiene un único sitio de la caspasa natural que se escinde durante la ap...

Discusión

A continuación se ilustra la construcción y el funcionamiento interno de CaspaseTracker que facilitan la detección de la actividad de caspasa basal generalizada en los tejidos sanos. Los pasos críticos para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica in vivo son: 1) la generación de moscas con el transgén biosensor, 2) verificar la función reportero-caspasa específico con controles apropiados, 3) la práctica de técnicas de disección para observar todos los sistemas de órganos internos de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CONSUMABLES AND REAGENTS
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
EQUIPMENT
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W	AmScope	WBM99316	Light source