Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

Özet

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Giriş

Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. 1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. 5 caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için farklı olmayan apoptotik süreçler tarafından hücre ölümüne neden olabilir. 6 bu nedenle, kaspaslara çoğu araştırma yanlısı ölüm fonksiyonları üzerine yoğunlaşmıştır.

İlginç bir şekilde, alanda dair kanıtlar teşvik hücre ölümünden sorumlu olan kaspaz non ölüm f olduğunu ortayaonksiyonlar ı. Öncü çalışmalar kaspazlar embriyojenez esnasında hücre çoğalması ve göçünün düzenlenmesinde dahil olmak üzere sağlıklı hücrelerde çeşitli hücresel fonksiyonları yer aldığını göstermiştir. 7-9 Kaspazlar alternatif necroptotic hücre ölüm yolunu bloke etmek için, Drosophila 10,11 spermatid Kişiselleştirme için gereklidir farelerde 12,13 ve mikroRNA işleme C. elegans. 14,15 belki de en uzun ömürlü hücreler, nöronlar, kaspaz ve diğer apoptotik makine sinaptik sonlar budama yoluyla nöronal aktivitenin düzenlenmesinde rol olan, inanılan bir süreç öğrenme ve hafıza için diğer sinaps güçlendirmek için önemli olduğu. 16- 18 kaspazlar bütün hücre ölümü olmadan minik nöronal projeksiyonları mini apoptoz bir türüne göre sinaptik budama kolaylaştırmak mümkündür. 19 Bununla birlikte, kaspaz apoptoz gibi olaylara ilgisiz alternatif işlevlere sahip olabilir. 20,21 Çift rolüyaşam ve ölüm s caspases özgü değildir; Kanıtlanmış olmasa da BCL-2 ailesi proteinleri ve sitokrom-c sağlıklı hücrelerde hücresel enerji endüstrisinde rol var ama aynı zamanda hücre stres birçok türleri tarafından aktive edilir çekirdek apoptotik yolun bir parçasıdır. 22-25, evrim gün bağlantılı olduğu mantıklı görünüyor uygun olmayan veya istenmeyen hücrelerin zamanında eleme sağlamak için aynı moleküllerden içinde ölüm işlere -iş.

Şu anda, apoptotik olmayan kaspaz etkinliğinin moleküler mekanizmalar anlaşılmamıştır ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi bulunması da bilinmemektedir. Büyük bir meydan okuma caspases ölüm işlerden gün işleri ayırmada zorluk olduğunu. kaspaz aktivitesi bir proteolitik akışı ile amplifiye edilir apoptoz ve pyroptosis, aksine, kaspaz günlük iş mevcut olan birçok techn göre büyük olasılıkla algılanan değer altına enzimatik aktivite çok daha düşük seviyelerde olması beklenmektedirologies.

Burada sunulan çalışma öncesinde, diğerleri farklı amaçlar için kaspaz biyosensörler çeşitli geliştirdi. SCAT biyosensörler (örneğin, ECFP-DEVD-Venüs) hızla FRET kullanarak kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında gerçek zamanlı kaspaz aktivitesini algılar. 26,27 kaspaz bölünme üzerine, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nükleer hedefli GFP kısmı nucGFP) plazma membran bağlama caspase'lar tarafından yarılır dakika içinde hücre içi yerini değiştirmesi geçirmektedir. 28 Benzer şekilde, ApoAlert-pCaspase3 Sensör (NES-DEVD-YFP NLS) kaspaz yarılma üzerine çekirdeğe sitosolden relocalizes. 29,30 fazlası son zamanlarda, iCasper içinde kromofor akıllıca Drosophila embriyo nöronların gerçek zamanlı olarak biyosensör etkinliğinin bulgulanması izin kaspaz parçalanabilen, ancak öncelikle gelişimsel hücre ölümü ile ilişkili olarak kaldığında parlayan şekilde işleme sokuldu. koku nöronların 31 Kaspaz bağımlı ölüm olduğu yaşlanma sırasında demonstGBM biyosensörler (örneğin, bunun ardından mCD8-PARP Venüs) kaspaz-klivaj formunun immüno-algılama derecelendiren. 32,33 Önemli olarak, kaspaz-3 aktive edilmiş şekli dikenler duyarlı immunostain hücre ölümünün kaybolması saptandı kültürlü nöronlar ve soma nükleer CellEvent raportör boyanın kaspaz-bağımlı floresan kullanılarak, ancak hücre ölümü omurga eleme sonrasına kadar ertelendi olmasına rağmen zorluklar nedeniyle foto-toksisite rastlanmıştır içinde. 19 Böylece, yeni kaspaz biyosensörler algılamak için gerekli olan ve in vivo bazal kaspaz aktivitesi ile hücreleri izlemek.

Bu zorlukları aşmak için, biz CaspaseTracker belirlenen yeni çift renkli kaspaz biyosensör, oluşturulan. Bu strateji kalıcı etiket ve in vivo hücreleri izlemek için Drosophila G-İZ FRT rekombinaz sistemi 34 ile Drosophila kaspaz-duyarlı Apoliner biyosensör 28 değiştirilmiş bir sürümü birleştirir. 35 Gal4 aktive G-TRACE sistemi. caspases çok düşük seviyelerde hiç kaspaz aktivitesini yaşadı herhangi bir hücrede sitoplazma ve kalıcı bir nükleer hedefli GFP ifade RFP ifade sonuçlanan CaspaseTracker etkinleştirmek için izin verir 35 Bu sistem etiketleyebilirsiniz Drosophila melanogaster, kaspaz ve hücre ölümü çalışma için izlenebilir ve yaygın olarak kullanılan bir model sistemi kullanarak tüm hayvanlarda ömrü boyunca hücreleri. 36-38

Protokol

CaspaseTracker Sineklerin hazırlanması 1.

  1. Bu haç gerçekleştirmek, CaspaseTracker (DQVD) hazırlamak deneyler için uçar için: 7-10 bakire kadın aktarılması (ya da erkek) tarafından, UBI-CaspaseTracker G-İZ (Ubi> Dur> GFP-nls;; UAS-FLP UAS-RFP) x kaspaz biyosensör substrat mCD8-DIAP1-Gal4 taşıyan erkek (ya da kadın) aynı sayıda ubikutin destekleyicisi 35 araya tarafından G- homozigot kombinasyonu ölümcül önlemek için ikinci kromozom CYO dengeleyici olan G-İZ sinekler, tahrik sinekler İZ (UAS-RFP, UAS-FLP ve Ubi> Dur> GFP-nls) 34. Bir yerde bir protein kaynağı olarak taze maya macun ile bir taze gıda flakon uçar.
  2. 5 ila 7 gün (en fazla 2 hafta) 18 ° C'de dosyaları inkübe ve sonra da üst yeni döl ile aşırı kalabalık önlemek için, ve yeni ıslah şişeleri kurmak için tüpten uçar kaldırın.
  3. döl Eclose uçar kadar 18 ° C'de inkübasyon devam edin. olmayan CYO seçin [non-cCaspaseTracker ve G-TRACE elemanları 35 için transgenik olan CaspaseTracker doğru genotip, bir urly kanat] döl.
  4. Aynı zamanda, belirli CaspaseTracker RFP ve GFP floresan doğrulamak için kontrol ebeveyn transgenik olmayan w118 sinekler ve kaspaz-duyarsız (DQVA) paralel sinekler oluşturmak.
  5. primerler kullanılarak CaspaseTracker dosya teyit etmek için PCR genotipleme gerçekleştirmek: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA bir 3,897 bp ürünü üretir. G-İz lokusların genotipleme için GFP (474 ​​bp) için aşağıdaki primerler kullanın, 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP (258 bp) için, 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ve Flpase (655 bp), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG için 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. pUWR vektörü olarak genotiplendirme Gal4 (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT için CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Doku Hazırlama, Boyama ve Montaj

  1. Uçucu disseksiyonlar için, su içinde eritildi,% 1 sığır serum albümini ile plastik pipet uçları ve santrifüj tüpleri, kaplama uçları ve borular (BSA) yapışmasını kesilerek dokuların engeller.
  2. Teşrih forseps kullanarak bir silikon yastık üzerinde uçar.
    1. doku diseksiyonu yaparken sert bir yüzeye forseps ipuçları zarar görmesini önlemek için, bir silikon yüzey üzerinde diseksiyon. Silikon diseksiyon plakaları yapmak için, üreticinin talimatlarına (Malzeme Listesi) göre ticari kit silikon eritebilir. silikon erime sonra, 60 mm çapında bir doku kültürü çanağı 3 ila 4 mL ekleyin. Silikon yemekleri yeniden kullanılabilir.
    2. CO2 ile bir sinek anestezisi, ve soğuk 1 mL PBS ile bir silikon plaka aktarın. Bir blowgun kullanarak anında ihtiva eden bir şişeye CO2 giriş, ve daha sonra anestezi uçucu t aktarmakCO 2 kaynağı vardır oa Pad.
    3. Baş ve foregut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden vücudu örten uçucu kafasını kesmek için ters yönde toraks çekmek için sinek kafa tutmak için forseps bir çift ve forseps ikinci bir çift kullanın.
    4. toraks kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak için forseps 2 çift kullanın.
    5. toraks tutmak için forseps bir çift kullanın ve forseps başka çift foregut ve midgut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden tekrar toraks ayırmak için karın çekin.
    6. Daha önce gösterildiği gibi, beynin, gut, Malpighi tüplerinin ve yumurtalıkların da dahil olmak üzere iç organlarını teşrih. 39-41
    7. Bu dokular, güçlü otofloresans üretmek olarak forseps ile manikür tüm parçaları ve yağ organları çıkarın. Sabır ve pratik gösterildiği gibi tam bir organ sistemini hazırlamaları gerekmektedir.
  3. 1.5 ml santrifüj tüplerine disseke dokuların aktarın ve dokular wi düzeltmek20 karanlıkta rotasyonu ile 30 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit 0.5 mL (fosfat-tamponlu tuzlu su) inci dokularda ağartıcı RFP ve GFP'yi önlemek için. sonraki boyama sonuçları tehlikeye düşürebilecek uzun süreli fiksasyon kaçının.
  4. yumuşak bir pipetleme paraformaldehid çıkartın ve oda sıcaklığında, 0.5 mL PBST (PBS +% 0.1 Triton X-100) ile 3 kez yıkanır.
  5. hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C'de 0.5 mL PBST ile dokuların geçirgenliği. Kısa inkubasyon eksik permeabilization ve uzlaşma boyama sonuçlara neden olabilir.
    1. Bu arka plan boyama azaltmak için gerekli ise, yerine PBS,% 1 BSA ile 0.5 mL PBST dokuları inkübe düşünün.
  6. 0.5 mL PBST ile dokular 3 kere yıkayın.
  7. , Çekirdek ve filamentli aktin (F-aktin) leke / ml Hoechst 33342 mavi çekirdek boyası ve 0.3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-aktin boya ile boyanırken 10 ug, 0.5 mL PBST uygulamak ve oda sıcaklığında 1 saat w doku ile eş zamanlı olarak kuluçkalanmasıKaranlıkta Ith nazik dönme. Bu arka plan artacak olarak uzun süreli boyama kaçının.
    1. immün için, dokuya sabit ve geçirgen inkübe% 0.1 Triton X-100, 0.5 ml PBS içinde bir gece boyunca 4 ° C, 1 lekeye: Anti-ELAV antikorun veya 1 100 seyreltme: Anti-kaspaz-3 200 seyreltme gece boyunca 4 ° C (300 uL). 100 ve oda sıcaklığında 1 ila 3 saat süre ile inkübe: 1 seyreltilmiştir karşılık gelen ikincil antikor devam edin. Belirli antikor bilgi için Malzeme Listesi bakın.
  8. yavaşça döndürülerek 0.5 mL PBST 5 dakika boyunca dokular 3 defa, her bir yıkama.
  9. Bir pipet ile, tüm PBST kaldırın ve sonra tamamen gece boyunca oda sıcaklığında 1-3 saat ya da 4 ° C için dokular kapsayacak şekilde (malzeme bakınız) 200 uL, anti-ağartıcı montaj ajanı ekleyin. Tam montaj ajan absorbe Optimal dokular tüpün dibine batar.
  10. Ön temizlemek, su ya da% 70 etanol ile cam slayt ve glas ajan montaj dokuları transferis slayt.
  11. Dikkatle dokular üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. cam slayt ve overcompression dokuyu tahrip önlemek için kapak kayma vazelin uygulayın. kağıt mendil ile ekstra montaj ajan çıkarın.
  12. dokulardan maddeleri montaj sızıntısını önlemek için tüm kapak kayma kenarları boyunca oje uygulayarak kapak kayma mühür.

3. Konfokal Mikroskop

  1. ters konfokal epi-floresan mikroskop kullanarak. Bununla birlikte, yukarı doğru mikroskoplar da kullanılabilir. döşeme kullanarak görüntü dokulara nedeniyle bileşenlerin ısıl genleşme ve daralma nedeniyle odaklanma ve xy düzleminin kayması sürüklenme önlemek için kararlı oda sıcaklığını korumak. Çevresel kontrol sistemleri ve odak kayması ücret sistemleri nedeniyle mikroskop sistemi termo-denge kaybına, bu sorunu önlemek için yardımcı olur.
  2. mikroskop sahnede slayt yerleştirin. Düşük çözünürlük kullanarak birkaç test görüntüleri çekmek (125 x 125 piksel) birFaiz (ROI) tüm bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli karoların uygun sayısını belirlemek d.
  3. tarama çözünürlüğü gibi 500 x 500 piksel ile görüntü yakalamak için mikroskop tarama sistemini ayarlayın. görüntüleri (çini) her her tarafta% 20 örtüşür ki, böyle bir 20X NA 0.8 veya cam lamelleri ile dokuları analiz etmek için bir 63X NA 1.4 Plan-Apochromat hedef olarak hedef seçin.
  4. uzun dalga boyu ışık düşük foto-ağartma neden olarak, uyarma dalga boylarını kısaya uzun görüntü dizisi ayarlayın. dalgaboyu kısaya uzun sekansı şöyledir: (i) Phalloidin F-aktin ve aktive kaspazlara karşı antikorları saptamak için 633 nm, RFP (ii) 561 nm, GFP (iii) 488 nm, ve (iv) 405 nm için Hoechst nükleer leke.
  5. görüntüleme sırasında, dokuların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için lazer yoğunluğu azaltarak foto-ağartma önlemek için işlemi görüntüleme sırasında floresan lazer uyarma hücrelerin maruziyeti en aza indirmek.
  6. i sonramages mikroskop yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirmek, toplanır.

Sonuçlar

CaspaseTracker normal sağlıklı hücreleri (Şekil 1a) kaspaz aktivitesini algılamasına izin iki önemli bileşeni vardır. Bunlardan ilki, kaspaz biyosensör Apoliner (Şekil 1b) örnek alınarak 146 amino asit kaspaz-bölünebilir polipeptiddir. Bu polipeptid tipik olarak apoptoz sırasında bölünen tek bir doğal olarak oluşan kaspaz bölgesi içeren DIAP1 (apoptoz Drosophila inhibitörü) türetilir 28 kaspaz ile drice.

Tartışmalar

Burada sağlıklı dokularda yaygın bazal kaspaz aktivitesinin saptanmasını kolaylaştırmak CaspaseTracker inşaat ve iç işleyişini göstermektedir. In vivo olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) 2) uygun kontroller ile kaspaz-özel raportör fonksiyonu doğrulayarak, 3) diseksiyon tekniklerini uygulayarak yetişkin Drosophila tüm iç organ sistemlerini gözlemlemek, biyosensör transgen ile sinekleri üreten, autofluorescent eserler gelen ve 4)...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Biz Şekil Drosophila çizimler için Polan Santos ve Darren Obbard teşekkür ederiz. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena JHMRI insectary kullanımı için. Bu çalışma Hayat Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenmiştir, Üniversite Ödenekler Komitesi Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) ve NIH NS096677, NS037402 ve NS083373 (JMH) verir. Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables and Reagents
VectashieldVector ProductsH-1000Mounting medium
ForcepsTed Pella#505 (110mm, #5)Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop SlidesFisher Scientific12-565BGlass slides
Hoechst 33342Molecular ProbesH1399DNA stain
Alexa Fluor 633 PhalloidinMolecular ProbesA22284Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)Antibody Registry ID:  AB_528218 Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibodyCell Signaling Technology#9661Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagentLife TechnologiesP36934to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer KitDow Corning Product code: 0001023934for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscopeCarl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 WAmScopeWBM99316Light source

Referanslar

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. . Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 117Kaspazbiyosens rDrosophilaApoptozsigara apoptotikbeyinn ronlarCaspaseTracker

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır