In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Riepilogo

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

Abstract

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Introduzione

Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l'adesione molte proteine ​​intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. ^1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l'apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemioterapia. ⁵ un diverso insieme di caspasi può causare la morte cellulare da processi non apoptotici distinte per stimolare l'immunità innata. ⁶ Perciò, maggior parte della ricerca sulle caspasi è concentrata sulla loro funzioni pro-morte.

È interessante notare che le prove nelle prime fasi del campo ha rivelato che gli stessi caspasi responsabili della promozione della morte cellulare hanno anche non-morte funzioni. Studi pionieristici hanno dimostrato che caspasi sono coinvolte in diverse funzioni cellulari in cellule sane, tra cui la regolazione della proliferazione cellulare e la migrazione durante l'embriogenesi. ^7-9 Caspases sono necessari per l'individualizzazione spermatid in Drosophila ^10,11, per bloccare un percorso di morte cellulare necroptotic alternativa nei topi ^12,13, e per l'elaborazione microRNA in C. elegans. ^14,15 In forse la più lunga vissuto cellule, i neuroni, caspasi e altri macchinari apoptotica sono implicati nella regolazione dell'attività neuronale da potatura terminazioni sinaptiche, un processo che si ritiene essere essenziale per rafforzare altri sinapsi per l'apprendimento e la memoria ^{16. 18} E 'possibile che caspasi facilitare la potatura sinaptica da un tipo di mini-apoptosi di minuscole proiezioni neuronali senza morte cellulare intero. ¹⁹ Tuttavia, caspasi possono avere funzioni alternative non correlati ad eventi apoptosi-like. ^20,21 duplice ruolos nella vita e la morte non sono riservate caspasi; BCL-2 proteine della famiglia e citocromo c hanno ruoli in energetica cellulari in cellule sane, ma sono anche parte del nucleo via apoptotica che viene attivato da molti tipi di stress cellulare. ^22-25 Anche se non è provato, sembra logico che l'evoluzione ha legato giorno : i processi di morte-posti di lavoro all'interno delle stesse molecole per garantire la tempestiva eliminazione delle cellule inadatti o indesiderabili.

Allo stato attuale, i meccanismi molecolari di attività caspasi non-apoptotica non sono comprese, e la misura dell'attività di caspasi non apoptotica durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti non è noto. Una sfida importante è la difficoltà nel distinguere giornaliere di posti di lavoro da death-lavori di caspasi. In contrasto con l'apoptosi e pyroptosis, quando l'attività delle caspasi è amplificato da una cascata proteolitica, si prevede che i giorno-lavori di caspasi che si verifichi a livelli molto più bassi di attività enzimatica, probabilmente al di sotto di rilevamento da molti Techn disponibileologies.

Prima del lavoro qui presentato, altri svilupparono una varietà di biosensori caspasi per scopi diversi. I biosensori SCAT (ad esempio, ECFP-DEVD-Venere) individuare rapidamente l'attività della caspasi in tempo reale in cellule in coltura e tessuti animali utilizzando FRET. ^26,27 Al caspasi scissione, la frazione GFP nucleare mirato di Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subisce rilocalizzazione subcellulare in pochi minuti quando la sua membrana plasmatica-tether viene scisso dalla caspasi. ²⁸ allo stesso modo, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) rilocalizza dal citoplasma al nucleo su caspasi scissione. ^29,30 Altro di recente, il cromoforo in iCasper è stato abilmente progettato per fluorescenza quando spaccati dalla caspasi, permettendo la rilevazione di attività biosensore in tempo reale nei neuroni di embrioni di Drosophila, ma soprattutto in associazione con la morte delle cellule di sviluppo. morte ³¹ caspasi-dipendente dei neuroni olfattivi durante l'invecchiamento, è stato demonstvotata da immuno-rilevamento della forma caspasi-spaccati di biosensori CPV (ad esempio, mCD8-PARP-Venere). ^32,33 È importante sottolineare che la forma attiva della caspasi-3 è stato rilevato in assenza di morte cellulare da immunostain sensibile a spine di neuroni in coltura, e nel soma utilizzando la fluorescenza caspasi-dipendente del colorante CellEvent giornalista nucleare, ma sono stati riscontrati a causa di foto-tossicità difficoltà, anche se la morte cellulare è stata ritardata fino a dopo l'eliminazione della colonna vertebrale. ¹⁹ Pertanto, sono necessari nuovi biosensori caspasi per rilevare e tenere traccia delle cellule con l'attività delle caspasi basale in vivo.

Per superare queste difficoltà, abbiamo generato un romanzo a due biosensore colore caspasi, designato CaspaseTracker. Questa strategia combina una versione modificata del Drosophila caspasi-sensitive Apoliner biosensore ²⁸ con la Drosophila G-TRACE sistema FRT ricombinasi ³⁴ per etichettare definitivamente e monitorare le cellule in vivo. ^{35 Il sistema G-TRACE GAL4-attivato permette di livelli molto bassi di caspasi per attivare CaspaseTracker, con conseguente espressione RFP nel citoplasma e l'espressione GFP nucleare mirata permanente in una cella che ha mai sperimentato l'attività delle caspasi. 35 Questo sistema può etichettare cellule per tutta la vita in animali interi utilizzando Drosophila melanogaster, un sistema modello trattabili e ampiamente utilizzati per lo studio delle caspasi e morte cellulare. 36-38}

Protocollo

1. Preparazione di mosche CaspaseTracker

1. Per preparare CaspaseTracker (DQVD) vola per esperimenti, eseguire questa croce: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Arresto> GFP-NLS), trasferendo 7-10 femmina vergine (o maschio) mosche trasportano il substrato caspasi biosensore mCD8-DIAP1-GAL4 guidato dal promotore dell'ubiquitina ³⁵ insieme con lo stesso numero di maschio (o femmina) linea G-TRACE, che hanno la seconda bilanciatore cromosoma cyo per evitare letalità della combinazione omozigote di G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi> Arresto> GFP-NLS) ^34. Inserire vola in un flaconcino alimento fresco con pasta di lievito fresco come fonte proteica.
2. Incubare i file a 18 ° C per 5 a 7 giorni (massimo 2 settimane) e quindi rimuovere il genitore aria dal flacone per evitare il sovraffollamento con la nuova progenie, e per impostare nuove fiale di allevamento.
3. Continuare incubazione a 18 ° C fino a quando progenie vola Eclose. Selezionare la non cyo [non-cURLy ala] progenie della corretta genotipo di CaspaseTracker, che sono transgenici per CaspaseTracker e ^G-35 oligoelementi.
4. Allo stesso tempo, generare controllo parentale mosche W118 non transgenici e caspasi-insensitive (DQVA) vola in parallelo per verificare specifiche RFP CaspaseTracker e GFP fluorescenza.
5. Eseguire la PCR genotipizzazione per confermare i file con CaspaseTracker utilizzando i primer: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producendo un prodotto di 3.897 bp. Per la genotipizzazione loci G-Trace, utilizzare i seguenti primer per GFP (474 ​​bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; per RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e per Flpase (655 bp), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TCT TTG CTG TCA C. Per la genotipizzazione GAL4 nel vettore pUWR (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA.

2. Preparazione del tessuto, colorazione e montaggio

1. Per dissezioni mosca, evitare tessuti dissezionati di attaccarsi alle punte di plastica per pipette e provette da centrifuga, consigli cappotto e tubi con albumina 1% di siero bovino (BSA) disciolti in acqua.
2. Dissect vola su un cuscinetto di silicone con pinze.
   1. Per evitare di danneggiare le punte delle pinze su una superficie dura quando si esegue la dissezione, eseguire la dissezione su una superficie di silicio. Per la realizzazione di lastre di dissezione silicone, sciogliere il silicio nel kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Materials List). Dopo la fusione il silicone, aggiungere 3 a 4 mL di un tessuto di diametro piatto di coltura 60mm. piatti di silicio possono essere riutilizzati.
   2. Anestetizzare una mosca con CO _2, e trasferirlo ad una piastra in silicone con 1 ml di PBS freddo. Introdurre la CO ₂ ad un flacone contenente il volo usando una cerbottana, e quindi trasferire al volo t anestetizzatoOA Pad che ha una fornitura di CO _2.
   3. Utilizzare un paio di pinze per tenere la testa mosca, ed una seconda coppia di pinze per tirare torace nella direzione opposta per scollegare la testa mosca dal corpo di rivestimento senza danneggiare la connessione tra la testa e foregut.
   4. Usare 2 paia di pinze per rimuovere le ali e le gambe dal torace.
   5. Utilizzare un paio di pinze per tenere il torace, e un altro paio di pinze per tirare l'addome per separarlo dal torace di nuovo senza danneggiare la connessione tra il foregut e midgut.
   6. Sezionare organi interni compreso il cervello, intestino, tubuli malpighiani e le ovaie, come precedentemente dimostrato. ^39-41
   7. Rimuovere tutti i pezzi della cuticola e gli organi di grasso con una pinza da questi tessuti producono forti autofluorescenza. La pazienza e la pratica sono tenuti a preparare un sistema di organi completo come mostrato.
3. Trasferimento tessuti sezionati a 1,5 ml provette da centrifuga, e fissare i tessuti with 0,5 mL di 4% paraformaldeide in PBS (tampone fosfato salino) a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti con rotazione al buio per evitare sbiancamento RFP e GFP nei tessuti. Evitare la fissazione prolungata che può compromettere le successive risultati di colorazione.
4. Rimuovere la paraformaldeide delicatamente pipettando e lavare 3 volte con 0,5 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) a RT.
5. Permeabilize i tessuti con 0,5 ml PBST a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento. incubazione più brevi possono causare permeabilizzazione e il compromesso di colorazione risultati incompleti.
   1. Se è necessario ridurre la colorazione di fondo, non incubando tessuti in 0,5 mL PBST con 1% BSA, invece di PBS.
6. Lavare i tessuti 3 volte con 0,5 mL PBST.
7. Per macchiare nuclei e filamentosa actina (F-actina), si applicano 0,5 ml PBST con 10 mg / mL di Hoechst 33342 blu colorante nucleare e 0,3 micron Alexa Fluor 633 falloidina F-actina macchia e incubare simultaneamente con i tessuti per 1 ora a RT with leggera rotazione nel buio. Evitare colorazione prolungata in quanto ciò aumenterà lo sfondo.
   1. Per immunocolorazione, incubare fisso e permeabilizzate tessuti con 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml di PBS notte a 4 ° C, macchia con diluizione 1: 100 di anticorpi anti-ELAV o con diluizione 1: 200 di anticorpi anti-caspasi-3 notte a 4 ° C (300 mL). Seguire dal corrispondente anticorpo secondario diluito 1: 100 e incubare per 1 a 3 ore a RT. Vedere Materiali Lista per specifiche informazioni di anticorpi.
8. Lavare i tessuti 3 volte, ognuna per 5 min in 0,5 mL PBST con rotazione dolce.
9. Con una pipetta, rimuovere tutti PBST, e poi aggiungere 200 microlitri anti-candeggina agente di montaggio (vedi materiali) per coprire completamente i tessuti per 1-3 ore a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la notte. tessuti ottimali che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio si depositano sul fondo della provetta.
10. Pre-pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70% e trasferire i tessuti con l'agente di montaggio per i glass slitta.
11. Posizionare con cura un vetrino di vetro sopra i tessuti. Applicare vaselina per il vetrino e la polizza di copertura per evitare di distruggere il tessuto da sovracompressione. Rimuovere l'agente di fissaggio in più con la carta velina.
12. Sigillare la polizza di copertura mediante l'applicazione di smalto lungo i bordi del vetrino per evitare la fuoriuscita di agenti di montaggio dai tessuti.

3. Microscopia confocale

1. Utilizzare un confocale epi-microscopio a fluorescenza invertito. Tuttavia, microscopi up-destra possono anche essere utilizzati. Per i tessuti di immagine utilizzando piastrelle, mantenere la temperatura ambiente stabile per evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy a causa della dilatazione termica e la contrazione dei componenti. sistemi di controllo ambientale e sistemi di compensazione attenzione deriva aiutano ad evitare questo problema a causa di perdita di termo-equilibrio del sistema microscopio.
2. Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Prendete un paio di immagini di prova con bassa risoluzione (125 x 125 pixel) unad determinare il numero appropriato di piastrelle necessarie per coprire l'intera regione di interesse (ROI).
3. Impostare il sistema di scansione microscopio per catturare immagini con risoluzione di scansione ad esempio 500 x 500 pixel. Selezionare l'obiettivo come un 20X NA 0.8 o un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 per analizzare i tessuti attraverso vetrino, in modo che ciascuna delle immagini (piastrelle) sovrapposizioni del 20% su tutti i lati.
4. Impostare la sequenza di immagini da più lungo al più breve lunghezze d'onda di eccitazione, come la luce di lunghezza d'onda lunga provoca inferiore fotometabolismo. La sequenza dalla più lunga alla più corta lunghezza d'onda di eccitazione è: (i) 633 nm per falloidina F-actina e per gli anticorpi caspasi attivate, (ii) 561 nm per RFP, (iii) 488 nm per GFP, e (iv) 405 nm per Hoechst macchia nucleare.
5. Durante l'imaging, minimizzare l'esposizione delle cellule alla eccitazione laser fluorescente durante il processo di imaging per evitare fotometabolismo riducendo l'intensità del laser per ottenere immagini di alta qualità di tessuti.
6. Dopo iomaghi sono raccolti, l'unione delle immagini utilizzando il software microscopio.

Risultati

Ci sono due componenti fondamentali che permettono CaspaseTracker per rilevare l'attività delle caspasi nelle cellule sane normali (Figura 1A). Il primo di questi è un 146 aminoacidi polipeptide caspasi-cleavable modello della caspasi biosensore Apoliner (Figura 1b). ²⁸ Questo polipeptide è derivato da DIAP1 (Drosophila inibitore di apoptosi) contenente un singolo sito caspasi naturale che è scisso durante l'apoptosi tipic...

Discussione

Qui illustriamo la costruzione e funzionamento interno di CaspaseTracker che facilitano il rilevamento di una diffusa attività di caspasi basale nei tessuti sani. I passaggi critici per rilevare l'attività della caspasi non apoptotica in vivo sono: 1) la generazione di mosche con il transgene biosensore, 2) verificare la funzione giornalista specifiche caspasi con opportuni controlli, 3) praticando tecniche di dissezione di osservare tutti i sistemi di organi interni di adulti Drosophila, e 4) at...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Reagents
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W	AmScope	WBM99316	Light source