In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Resumo

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

Resumo

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Introdução

As caspases são proteases de cisteína que medeiam a morte celular por apoptose por clivagem de muitas proteínas intracelulares após resíduos aspartato-chave. Por exemplo, caspases iniciadoras activar as caspases efectoras, as nucleases de ADN desreprimir, componentes do citoesqueleto e clivam alterar a composição lipídica das membranas celulares para desmantelar rapidamente as células e estimular o seu reconhecimento por células e imersão que eliminam os cadáveres célula vizinha. Estima-se ^4/1 que milhares de milhões de células morrem por dia no corpo humano, e a apoptose é um importante mecanismo de morte de células tumorais induzida por quimioterapia. ⁵ um conjunto diferente de caspases podem causar morte celular por processos não apoptóticas distintas para estimular a imunidade inata. ⁶ Portanto, maioria das pesquisas sobre caspases tem se concentrado em suas funções pró-extermínio.

Curiosamente, os primeiros indícios no campo revelou que os mesmos caspases responsáveis ​​pela morte celular promovendo também têm não-morte funções. Estudos pioneiros demonstraram que as caspases estão envolvidas em diversas funções celulares em células saudáveis, incluindo a regulação da proliferação e migração celular durante o desenvolvimento embrionário. ^7-9 As caspases são necessários para a individualização espermátide em Drosophila ^10,11, para o bloqueio de uma via de morte celular alternativa necroptotic em ratinhos ^12,13, e para o processamento de microARN em C. elegans. ^14,15 Em talvez o mais longevo células, neurônios, caspases e outra maquinaria apoptótica estão implicados na regulação da actividade neuronal pela poda terminações sinápticas, um processo que se acredita ser essencial reforçar outras sinapses de aprendizagem e memória. ^{16- 18} é possível que as caspases facilitar poda sináptica por um tipo de mini-apoptose de pequenas projecções neuronais sem morte de células inteiras. ¹⁹ No entanto, as caspases podem ter funções alternativas não relacionados com acontecimentos de apoptose semelhante. ^20,21 papel duplos na vida e morte não são exclusivos para caspases; BCL-2 proteínas da família e citocromo c têm papéis em energetics celulares em células saudáveis, mas também são parte da via apoptótica núcleo que é ativado por muitos tipos de stress celular. ^22-25 Embora não esteja provado, parece lógico que a evolução tem ligado dia -jobs to death-empregos dentro das mesmas moléculas para assegurar a eliminação atempada das células impróprias ou indesejáveis.

Actualmente, os mecanismos moleculares da actividade de caspase não apoptóticas não são compreendidas, e o grau de actividade de caspase não apoptótica, durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos, também não é conhecido. Um grande desafio é a dificuldade em distinguir dia-empregos da morte-empregos de caspases. Em contraste com a apoptose e pyroptosis, quando a actividade de caspase é amplificada por uma cascata proteolítica, é esperado que os trabalhos de dia-caspases para ocorrer a níveis muito mais baixos de actividade enzimática, provavelmente abaixo de detecção disponível por muitos Technologies.

Antes do trabalho aqui apresentado, outros desenvolveram uma variedade de biossensores de caspase para fins diferentes. Os biossensores SCAT (por exemplo, ECFP-DEVD-Vénus) detectar rapidamente a actividade da caspase em tempo real e em células em cultura de tecidos animais usando FRET ^26,27. Após a clivagem de caspase, a porção da GFP dirigido ao núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sofre relocalização subcelular em poucos minutos quando o seu plasma membrana de tirante é clivada por caspases. ²⁸ do mesmo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes a partir do citosol para o núcleo por clivagem de caspase. ^29,30 Mais recentemente, o cromóforo em iCasper foi habilmente manipulada para fluorescência quando clivada por caspases, que permite a detecção da actividade de biossensor em tempo real, nos neurónios de embriões de Drosophila, mas principalmente em associação com o desenvolvimento da morte celular. morte ^{31 de} caspase-dependente de neurónios olfactivos durante o envelhecimento estava demonstavaliado por imuno-detecção da forma clivada da caspase-biossensores de CPV (por exemplo, mCD8-PARP-Vénus). ^32,33 modo importante, a forma activada da caspase-3 foi detectada na ausência de morte celular por imunocoloração sensível nas espinhas de neurónios em cultura, e no soma utilizar a fluorescência dependente da caspase do corante repórter CellEvent nuclear, mas foram encontradas dificuldades devido a foto-toxicidade, embora a morte celular foi atrasada até depois da eliminação da coluna. ¹⁹ Assim, novos biossensores caspases são necessários para detectar e rastrear células com atividade caspase basal in vivo.

Para superar essas dificuldades, geramos um romance dupla biossensor cor caspase, designado CaspaseTracker. Esta estratégia combina uma versão modificada da Drosophila sensível caspase-Apoliner biossensor ²⁸ de Drosophila com o G-rastreio do sistema de recombinase FRT ³⁴ para etiquetar de forma permanente e acompanhar as células in vivo. ^{35 O sistema G-TRACE Gal4-activado permite níveis muito baixos de caspases para ativar CaspaseTracker, resultando na expressão RFP no citoplasma e permanente expressão GFP nuclear-alvo em qualquer célula que já experimentou a atividade da caspase 35 Este sistema pode rotular. células ao longo da vida em animais inteiros utilizando Drosophila melanogaster, um sistema modelo tratável e amplamente usados para o estudo de caspases e morte celular 36-38.}

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Protocolo

1. Preparação de Moscas CaspaseTracker

1. Para preparar CaspaseTracker (DQVD) voa para experimentos, executar esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Parar> GFP-NLS), através da transferência de 7-10 fêmea virgem (ou masculino) moscas que transporta o substrato da caspase-biossensor mCD8 DIAP1-Gal4 dirigido pelo promotor de ubiquitina ^{de 35} em conjunto com o mesmo número do macho (ou fêmea) G-moscas de rastreio, que têm o segundo equilibrador cromossoma CYO para evitar letalidade da combinação homozigótica do G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi> Parar> GFP-NLS) ^34. Lugar voa num frasco de alimentos frescos com pasta de fermento fresco como fonte de proteína.
2. Incubar arquivos a 18 ° C durante 5 a 7 dias (máximo de 2 semanas) e em seguida, remover o pai voa a partir do frasco para evitar a superlotação com a nova descendência, e para configurar novos frascos de melhoramento.
3. Continuar a incubação a 18 ° C até que a descendência voa eclose. Seleccione a não-CYO [não cURLy asa] progênie do genótipo correto de CaspaseTracker, que são transgénicos para CaspaseTracker e ^G-35 oligoelementos.
4. Ao mesmo tempo, gerar controlo parental moscas W118 não-transgênicas e caspase-insensitive (DQVA) voa em paralelo para verificar a RFP CaspaseTracker específico e fluorescência da GFP.
5. Realizar genotipagem por PCR para confirmar os ficheiros com CaspaseTracker utilizando os primers: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produzindo um produto de 3897 pb. Para genotipagem do loci G-Trace, use os seguintes primers para GFP (474 ​​pb), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; para RFP (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e para Flpase (655 pb), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Para genotipagem Gal4 no vector pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA.

2. Preparação de tecidos, Coloração e montagem

1. Para dissecções mosca, evitar tecidos dissecados de degola para pontas de plástico para pipetas e tubos de centrífuga, dicas revestimento e tubos com albumina 1% de soro bovino (BSA) dissolvidos na água.
2. Dissecar voa sobre uma almofada de silicone usando uma pinça.
   1. Para evitar danificar as pontas de pinça sobre uma superfície rígida quando se realiza a dissecção de tecidos, realizar dissecção sobre uma superfície de silício. Para fazer placas de silicone de dissecação, derreta o silício no kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (lista de materiais). Depois de derreter o silicone, adicionar 3 a 4 ml de uma cultura de tecido de diâmetro prato de 60 mm. pratos de silício pode ser reutilizado.
   2. Anestesiar uma mosca com CO _2, e transferi-lo para uma placa de silicone com 1 ml de PBS frio. Introduzir o CO ₂ para um frasco contendo a mosca usando uma zarabatana, e depois transferir a mosca anestesiados toa Pad que tem uma fonte de CO _2.
   3. Utilizar um par de pinças para segurar a cabeça da mosca, e um segundo par de fórceps para puxar o tórax na direcção oposta para desligar a cabeça mosca do corpo de cobertura, sem danificar a ligação entre a cabeça e o intestino anterior.
   4. Use 2 pares de pinças para remover as asas e pernas do tórax.
   5. Utilizar um par de pinças para segurar o tórax, e um outro par de fórceps para puxar o abdómen para separá-lo do tórax de novo sem danificar a ligação entre o intestino anterior e do intestino médio.
   6. Dissecar órgãos internos incluindo cérebro, intestino, túbulos de Malpighi e os ovários como demonstrado anteriormente. ^39-41
   7. Remova todas as peças do cutícula e os corpos gordos com uma pinça como estes tecidos produzir forte autofluorescência. Paciência e prática são necessários para preparar um sistema de órgão completo, como mostrado.
3. Transferir tecidos dissecados para 1,5 tubos de centrífuga ml e corrigir tecidos with 0,5 ml de paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato), à TA, durante 20 a 30 minutos com rotação no escuro para evitar RFP e GFP de branqueamento em tecidos. Evite fixação prolongada que pode comprometer os resultados da coloração subsequentes.
4. Remover o paraformaldeído por pipetagem suave e lavagem 3 vezes com 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à TA.
5. Permeabilizar as tecidos com 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante a noite com agitação suave. incubações mais curtos pode causar incompletos permeabilização e coloração compromisso resultados.
   1. Se é necessário para reduzir a coloração de fundo, considere incubando tecidos em 0,5 ml de PBST com 1% de BSA, em vez de PBS.
6. Lavar os tecidos por 3 vezes com 0,5 ml de PBST.
7. Para corar núcleos e actina filamentosa (F-actina), aplicam-se 0,5 ml de PBST com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante azul nuclear e 0,3 uM Alexa Fluor 633 faloidina F-actina mancha e incubar em simultâneo com os tecidos durante 1 h, à RT wom rotação suave no escuro. Evitar manchar prolongado como este vai aumentar o fundo.
   1. Para a imunocoloração, incubar fixadas e permeabilizadas tecidos com 0,1% de Triton X-100 em 0,5 mL de PBS durante a noite a 4 ° C, mancha com diluição 1: 100 de anticorpo anti-elav ou com diluição 1: 200 de anti-caspase-3 durante a noite a 4 ° C (300 mL). Seguir por o anticorpo secundário correspondente diluída 1: 100 e incubar durante 1 a 3 h à TA. Veja Lista de Materiais para obter informações anticorpo específico.
8. Lavar os tecidos 3 vezes, cada uma durante 5 minutos em 0,5 ml de PBST com rotação suave.
9. Com uma pipeta, remover todos PBST, e, em seguida adicionar 200 uL de montagem agente anti-branqueador (ver materiais) para cobrir completamente os tecidos durante 1-3 h à TA ou a 4 ° C durante a noite. tecidos que têm óptimas totalmente absorvidas o agente de montagem irá afundar para o fundo do tubo.
10. Pré-limpar a lâmina de vidro com água ou com etanol a 70% e transferir os tecidos com agente de montagem para os Glass slide.
11. Com cuidado, coloque uma lamela de vidro sobre os tecidos. Aplique vaselina para a lâmina de vidro ea tampa de deslizamento para evitar a destruição do tecido por overcompression. Remover agente de montagem extra com papel de seda.
12. Selar a lamela, aplicando unha polonês ao longo das bordas da lamínula para evitar vazamento de agentes de montagem dos tecidos.

3. Microscopia Confocal

1. Use um confocal epi-fluorescência microscópio invertido. No entanto, microscópios up-direito pode ser também utilizado. Para tecidos de imagem usando ladrilhos, manter a temperatura ambiente estável para evitar desvio de foco e deslocamento do plano xy devido à expansão e contração térmica dos componentes. sistemas de controle ambiental e sistemas de compensação foco deriva ajudar a evitar esse problema devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio.
2. Coloque o slide no palco do microscópio. Tome algumas imagens de teste utilizando baixa resolução (125 x 125 pixels) de umd determinar o número apropriado de peças necessárias para cobrir toda a região de interesse (ROI).
3. Definir o sistema de digitalização microscópio para capturar imagens com resolução de digitalização, como 500 x 500 pixels. Selecione o objetivo, como um 20X NA 0.8 ou 63X NA 1.4 objetivo Plan-Apochromat para analisar tecidos através de lamelas de vidro, de modo que cada uma das imagens (telhas) sobrepõe-se em 20% de todos os lados.
4. Configurar a sequência de imagens de maior para o menor comprimento de onda de excitação, como a luz de comprimento de onda provoca menor de foto-branqueamento. A sequência de maior para o menor comprimento de onda de excitação é: (i) 633 nm para faloidina F-actina e para anticorpos para as caspases activadas, (ii) 561 nm para RFP, (III) a 488 nm para GFP, e (iv) a 405 nm durante mancha nuclear Hoechst.
5. Durante a gravação, minimizar a exposição das células à excitação laser fluorescente durante o processo de imagiologia para evitar a foto-branqueamento, reduzindo a intensidade do laser para obter imagens de alta qualidade dos tecidos.
6. Depois que eumagos são recolhidas, fundir as imagens usando o software microscópio.

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Resultados

Existem dois componentes principais que permitem CaspaseTracker para detectar a actividade da caspase em células saudáveis normais (Figura 1A). O primeiro deles é um polipéptido de caspase-clivável 146 aminoácidos modelada após a caspase biossensor Apoliner (Figura 1b) ²⁸ Este polipéptido é derivado de DIAP1 (inibidor de Drosophila de apoptose), contendo um único local de caspase de ocorrência natural que é clivado durante...

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Discussão

Aqui ilustramos da construção e interiores funcionamento do CaspaseTracker que facilitam a detecção de atividade de caspase basal generalizada nos tecidos saudáveis. Os passos críticos para detectar a actividade de caspase não apoptótica in vivo são os seguintes: 1) a geração de moscas com o transgene biossensor, 2) verificar a função repórter específicos da caspase com controlos adequados, 3) praticando técnicas de dissecação para observar todos os sistemas de órgãos internos de adulto ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Reagents
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W	AmScope	WBM99316	Light source