In Vivo Biocapteur Tracks apoptotique non-activité Caspase chez la drosophile

Résumé

Pour détecter les cellules saines chez des animaux entiers qui contiennent de faibles niveaux d'activité de la caspase, le biocapteur très sensible désigné CaspaseTracker a été générée pour la drosophile. Biocapteur activité caspase-dépendante est détectée dans les cellules saines longue durée de vie à travers les organes internes des animaux adultes élevés dans des conditions optimisées en l'absence de stimuli de mort.

Résumé

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Introduction

Les caspases sont des protéases cystéines qui médient la mort cellulaire par apoptose par clivage de nombreuses protéines intracellulaires après les résidus aspartate clés. Par exemple, les caspases initiatrices activent les caspases effectrices, des nucléases d'ADN déréprimer, les composants du cytosquelette cliver et modifient la composition lipidique des membranes cellulaires à démonter rapidement les cellules et stimuler leur reconnaissance et phagocytose par les cellules qui se débarrassent des corps cellulaires voisins. ^1-4 On estime que des milliards de cellules meurent par jour dans le corps humain, et l' apoptose est un mécanisme important de la mort des cellules tumorales induite par la chimiothérapie. ⁵ un ensemble différent de caspases peut provoquer la mort cellulaire par des procédés non-apoptotiques distincts pour stimuler l' immunité innée. ⁶ par conséquent, la plupart des recherches sur les caspases a mis l'accent sur leurs fonctions pro-mort.

Fait intéressant, la preuve précoce dans le domaine a révélé que les mêmes caspases responsables de la promotion de la mort cellulaire ont aussi non-mort fonctions. Des études pionnières ont démontré que les caspases sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires dans les cellules saines, y compris la régulation de la prolifération cellulaire et la migration au cours de l' embryogenèse. ^7-9 caspases sont nécessaires pour individualiser spermatid chez la drosophile ^10,11, pour bloquer une voie de mort cellulaire nécroptose alternatif chez les souris ^12,13, et pour le traitement des microARN en C. . elegans ^14,15 Dans peut-être les plus longue durée de vie des cellules, les neurones, les caspases et d' autres machines apoptotique sont impliqués dans la régulation de l' activité neuronale par la taille des terminaisons synaptiques, un processus considéré comme essentiel pour renforcer d' autres synapses pour l' apprentissage et la mémoire ^{16-. 18} Il est possible que les caspases faciliter l' élagage synaptique par un type de mini-apoptose neuronale de petites saillies , sans mort cellulaire entier. ¹⁹ Cependant, les caspases peuvent avoir d' autres fonctions sans rapport avec les événements de l' apoptose analogue. ^20,21 double rôles dans la vie et la mort ne sont pas uniques à caspases; BCL-2 protéines de la famille et du cytochrome c ont des rôles en energetique cellulaires dans les cellules saines , mais font également partie de la voie apoptotique de base qui est activé par de nombreux types de stress cellulaire. ^22-25 Bien que pas prouvé, il semble logique que l' évolution a lié jour -jobs à mort-emplois dans les mêmes molécules pour assurer l'élimination rapide des cellules impropres ou indésirables.

À l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires de l'activité de la caspase non apoptotiques ne sont pas comprises, et le degré d'activité de la caspase non apoptotique pendant le développement embryonnaire et dans les tissus adultes sont également inconnus. Un défi majeur est la difficulté de distinguer jour-emploi de mort-emploi de caspases. Contrairement à l'apoptose et pyroptosis, lorsque l'activité de la caspase est amplifié par une cascade protéolytique, le jour-emploi de caspases devraient se produire beaucoup plus faibles niveaux d'activité enzymatique, probablement ci-dessous la détection par beaucoup techn disponibleslogies.

Avant le travail présenté ici, d'autres ont développé une variété de biocapteurs de caspases à des fins différentes. Les biocapteurs SCAT (par exemple, ECFP-DEVD-Vénus) détectent rapidement l' activité de la caspase en temps réel dans des cellules cultivées et les tissus animaux en utilisant FRET. ^26,27 Sur caspase clivage, la GFP fraction nucléaire ciblée de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subit une re - localisation subcellulaire quelques minutes lorsque sa membrane plasmique attache est clivée par les caspases. ²⁸ de même, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-SLN) relocalise du cytosol vers le noyau lors de la caspase clivage. ^29,30 Plus récemment, le chromophore dans iCasper est habilement conçu pour émettre une fluorescence lorsqu'il est clivé par des caspases, ce qui permet la détection de l' activité de biodétecteur en temps réel dans les neurones d'embryons de Drosophila, mais surtout en association avec la mort cellulaire développementale. mort ³¹ caspase-dépendante des neurones olfactifs au cours du vieillissement était demonstévalué par immuno-détection de la forme de biocapteurs CPV (par exemple, mCD8-PARP-Vénus) caspase-clivée. ^32,33 Surtout, la forme activée de la caspase-3 a été détectée en l'absence de mort cellulaire par immunocoloration sensible dans les épines de neurones en culture, et dans le soma en utilisant la fluorescence de la caspase-dépendante du nucléaire colorant CellEvent rapporteur, mais des difficultés ont été rencontrées en raison de photo-toxicité, bien que la mort cellulaire a été retardée jusqu'à ce que la colonne vertébrale élimination. ¹⁹ Ainsi, de nouveaux biocapteurs de caspases sont nécessaires pour détecter et de suivre les cellules ayant une activité caspase basale in vivo.

Pour surmonter ces difficultés, nous avons généré un roman à double biocapteur couleur de caspase, désigné CaspaseTracker. Cette stratégie combine une version modifiée de la drosophile sensible à la caspase Apoliner biocapteur ²⁸ avec la drosophile G-TRACE système de recombinase ³⁴ FRT pour marquer de manière permanente et le suivi des cellules in vivo. ^{35 Le système G-TRACE Gal4 activé permet de très faibles niveaux de caspases pour activer CaspaseTracker, résultant dans l' expression de la DP dans le cytoplasme et l' expression permanente de la GFP nucléaire ciblée dans une cellule qui a jamais connu l' activité de la caspase 35 Ce système peut étiqueter. cellules tout au long de la vie chez les animaux entiers à l' aide de Drosophila melanogaster, un système modèle traitable et largement utilisé pour l'étude des caspases et la mort cellulaire. 36-38}

Protocole

1. Préparation des mouches CaspaseTracker

1. Pour préparer CaspaseTracker (DQVD) mouches pour des expériences, effectuer cette croix: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-DP; UAS-FLP; UBI> Stop> GFP-NLS), en transférant 7-10 femelle vierge (ou masculin) les mouches portant le substrat de caspase biocapteur mCD8-DIAP1-Gal4 dirigé par le promoteur de l' ubiquitine ³⁵ avec le même nombre de mâle (ou femelle) G-TRACE mouches, qui ont le deuxième équilibreur chromosome CYO pour éviter la létalité de la combinaison homozygote G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP et UBI> Stop> GFP-NLS) ^34. Placer les mouches dans un flacon de nourriture fraîche avec de la pâte de levure fraîche comme une source de protéines.
2. Incuber fichiers à 18 ° C pendant 5 à 7 jours (maximum 2 semaines) puis retirez le parent vole du flacon pour éviter la surpopulation avec une nouvelle progéniture, et de mettre en place de nouveaux flacons d'élevage.
3. Continuer l'incubation à 18 ° C jusqu'à ce que la progéniture mouches éclosent. Sélectionnez le non-CYO [non-cURLy aile] progéniture du génotype correct de CaspaseTracker, qui sont transgéniques pour CaspaseTracker et G-TRACE éléments ^35.
4. En même temps, générer contrôle parental mouches W118 non transgéniques et caspase-insensible (DQVA) vole en parallèle pour vérifier RFP CaspaseTracker spécifique et fluorescence de la GFP.
5. Effectuer le génotypage par PCR pour confirmer les fichiers avec CaspaseTracker en utilisant les amorces: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produisant un produit 3.897 pb. Pour le génotypage du locus G-Trace, utilisez les amorces suivantes pour la GFP (474 ​​pb), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; pour RFP (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; et Flpase (655 pb), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Pour génotypage Gal4 dans le vecteur pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CCG, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Préparation des tissus, Coloration et montage

1. Pour les dissections de mouches, de prévenir les tissus disséqués de coller aux pointes de pipette en plastique et des tubes de centrifugation, des conseils de manteau et des tubes avec de l'albumine 1% de sérum bovin (BSA) dissous dans l'eau.
2. Disséquer vole sur un coussin de silicone en utilisant une pince.
   1. Pour éviter d'endommager les pointes des pinces sur une surface dure lors de l'exécution de la dissection des tissus, effectuer la dissection sur une surface de silicium. Pour la fabrication de plaques de silicone de dissection, faire fondre le silicium dans le kit commercial selon les instructions du fabricant (Liste des matériaux). Après la fonte de la silicone, ajouter 3 à 4 ml d'une boîte de culture tissulaire de 60 mm de diamètre. plats de silicium peuvent être réutilisés.
   2. Anesthésier une mouche avec du CO _2, et le transférer sur une plaque de silicone avec 1 ml de PBS froid. Introduire le CO ₂ à un flacon contenant la volée en utilisant une sarbacane, puis transférer la mouche anesthésiés toa Pad qui a une alimentation de CO _2.
   3. Utilisez une paire de pinces pour tenir la tête de mouche, et une seconde paire de pinces pour tirer le thorax dans la direction opposée à déconnecter la tête de la mouche du corps couvrant sans endommager la connexion entre la tête et foregut.
   4. Utiliser 2 paires de pinces pour enlever les ailes et les pattes du thorax.
   5. Utilisez une paire de pinces pour tenir le thorax, et une autre paire de pinces pour tirer l'abdomen pour le séparer du thorax à nouveau sans endommager la connexion entre l'intestin antérieur et l'intestin moyen.
   6. Disséquer organes internes y compris le cerveau, l' intestin, les tubules de Malpighi et des ovaires comme démontré précédemment. ^39-41
   7. Retirez tous les morceaux de la cuticule et les corps gras avec une pince que ces tissus produisent une forte autofluorescence. La patience et la pratique sont nécessaires pour préparer un système d'organe complet comme indiqué.
3. Transfert des tissus disséqués à 1,5 tubes à centrifuger ml, et fixer les tissus wie 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) à température ambiante pendant 20 à 30 minutes avec rotation dans l'obscurité pour éviter le blanchiment DP et GFP dans les tissus. Éviter la fixation prolongée qui peut compromettre les résultats de coloration ultérieures.
4. Retirez le paraformaldéhyde par pipetage doux et laver 3 fois avec 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à la température ambiante.
5. Perméabiliser les tissus avec 0,5 ml de PBST à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce. incubations plus courts peuvent provoquer perméabilisation et de compromis coloration des résultats incomplets.
   1. Si cela est nécessaire pour réduire la coloration de fond, envisager l'incubation de tissus dans 0,5 ml de PBST contenant 1% de BSA, au lieu de PBS.
6. Laver les tissus 3 fois avec 0,5 ml de PBST.
7. Pour colorer les noyaux et l'actine filamenteuse (F-actine), appliquer 0,5 mL PBST avec 10 pg / ml de colorant Hoechst 33342 nucléaire bleu et 0,3 uM Alexa Fluor tache 633 phalloïdine F-actine et incuber simultanément avec les tissus pendant 1 h à température ambiante wvec une légère rotation dans l'obscurité. Évitez coloration prolongée car cela va augmenter l'arrière-plan.
   1. Pour une immunocoloration, incuber fixées et perméabilisées tissus avec 0,1% de Triton X-100 dans 0,5 ml de PBS pendant une nuit à 4 ° C, la tache avec dilution 1: 100 d'anticorps anti-ELAV ou dilution 1: 200 d'anticorps anti-caspase-3 pendant une nuit à 4 ° C (300 pi). Suivi par l'anticorps secondaire correspondant dilué à 1: 100 et on incube pendant 1 à 3 h à température ambiante. Voir la liste des matériaux d'information anticorps spécifique.
8. Laver les tissus 3 fois, chacune pendant 5 min dans 0,5 ml PBST avec une légère rotation.
9. Avec une pipette, enlever tous les PBST, puis ajouter 200 ul anti-eau de Javel agent de montage (voir matériaux) pour couvrir complètement les tissus pour les 1-3 h à température ambiante, ou 4 ° C pendant la nuit. tissus optimales qui ont entièrement absorbé l'agent de montage va couler au fond du tube.
10. Pré-nettoyer la lame de verre avec de l'eau ou de 70% d'éthanol et de transférer les tissus avec un agent de fixation aux glass diapositive.
11. Placez délicatement une lamelle de verre sur les tissus. Appliquer de la vaseline sur la lame de verre et la lamelle pour éviter de détruire le tissu par surcompression. Retirer l'agent de montage supplémentaire avec du papier de soie.
12. Sceller la lamelle en appliquant le vernis à ongles tout le long des bords de la lamelle pour éviter les fuites d'agents de fixation des tissus.

3. Microscopie confocale

1. Utilisez un confocal épi-fluorescence microscope inversé. Cependant, les microscopes en haut à droite peuvent être également utilisés. Pour les tissus d'image en utilisant le carrelage, de maintenir stable la température ambiante pour éviter toute dérive de focalisation et le déplacement du plan xy en raison de l'expansion et la contraction thermique des composants. systèmes de contrôle de l'environnement et des systèmes de compensation de la dérive de mise au point permettent d'éviter ce problème en raison de la perte de thermo-équilibre du système de microscope.
2. Placer la lame sur la platine du microscope. Prenez quelques images de test en utilisant une faible résolution (125 x 125 pixels) d'uned déterminer le nombre approprié de tuiles nécessaires pour couvrir l'ensemble de la région d'intérêt (ROI).
3. Régler le système de balayage du microscope pour capturer des images avec une résolution telle que 500 x 500 pixels à balayage. Sélectionnez l'objectif tel qu'un 20X NA 0,8 ou un objectif 63X NA 1.4 Plan-Apochromat pour analyser les tissus grâce à des lamelles de verre, de sorte que chacune des images (tuiles) recouvre de 20% sur tous les côtés.
4. Mettre en place la séquence d'images de la plus longue à la plus courte longueur d'onde d'excitation, comme la lumière de longue longueur d'onde provoque inférieure photo-blanchiment. La séquence du plus long au plus court d'onde d'excitation est la suivante: (i) 633 nm pour la phalloïdine F-actine et des anticorps dirigés contre les caspases activées, (ii) 561 nm pour DP, (iii) 488 nm pour la GFP, et (iv) 405 nm pour Hoechst tache nucléaire.
5. Au cours de l'imagerie, de minimiser l'exposition des cellules à fluorescence excitation laser au cours du processus d'imagerie afin d'éviter la photo-blanchiment en réduisant l'intensité du laser pour obtenir des images de haute qualité des tissus.
6. Après jemages sont collectées, fusionner les images en utilisant le logiciel de microscope.

Résultats

Il y a deux éléments clés qui permettent CaspaseTracker de détecter l' activité des caspases dans les cellules saines normales (Figure 1a). Le premier d' entre eux est un polypeptide de la caspase-clivable 146 acides aminés calquée sur la caspase biocapteur Apoliner (figure 1b) ²⁸ Ce polypeptide est dérivé d'DIAP1 (inhibiteur de Drosophila de l' apoptose) contenant un seul site de la caspase d' origine nat...

Discussion

Ici, nous illustrons la construction et le fonctionnement interne de CaspaseTracker qui facilitent la détection de l'activité de la caspase base largement répandue dans les tissus sains. Les étapes essentielles pour détecter l' activité de la caspase non-apoptotique in vivo sont: 1) la génération de mouches avec le transgène biocapteur, 2) la vérification de la fonction de rapporteur spécifique-caspase avec des contrôles appropriés, 3) la pratique des techniques de dissection pour observer ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Reagents
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W	AmScope	WBM99316	Light source