In - vivo - Biosensor - Spuren Non-apoptotischen Caspase - Aktivität in Drosophila

Zusammenfassung

Um gesunde Zellen in ganzen Tieren erkennen , die geringe Mengen an Caspase - Aktivität enthalten, die hochempfindliche Biosensor bezeichnet CaspaseTracker wurde für Drosophila erzeugt. Caspase-abhängigen Biosensor-Aktivität wird in langlebigen gesunden Zellen in den inneren Organen der erwachsenen Tiere aufgezogen unter optimierten Bedingungen in Abwesenheit von Tod Stimuli detektiert.

Zusammenfassung

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

Einleitung

Caspasen sind Cystein-Proteasen, die durch Spaltung von vielen intrazellulären Proteinen nach Schlüssel Aspartatresten apoptotischen Zelltod vermitteln. Zum Beispiel aktivieren Initiator Caspasen Effektorcaspasen, dereprimieren DNA Nukleasen spalten Zytoskelett - Komponenten und die Lipidzusammensetzung von Zellmembranen verändern , um schnell Zellen abzubauen und ihre Anerkennung und engulfment stimulieren durch benachbarte Zellen , die der Zelle Leichen zu entsorgen. ^1-4 Es wird geschätzt, dass Milliarden Zellen pro Tag in den menschlichen Körper sterben und Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus der chemotherapieinduzierter Tumorzelltodes. ⁵ Eine andere Gruppe von Caspasen Zelltod durch verschiedene nicht-apoptotischen Prozesse führen können angeborene Immunität zu stimulieren. ⁶ Deshalb die meisten Untersuchungen auf Caspasen hat auf ihrer pro-Tod Funktionen konzentriert.

Interessanterweise ergab erste Hinweise auf dem Gebiet, dass die gleichen Caspasen verantwortlich für die Förderung der Zelltod auch nicht den Tod f habenSalbungen. Pionierstudien haben gezeigt , daß Caspasen in diverse zelluläre Funktionen in gesunden Zellen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Zellproliferation und Migration während der Embryogenese. ^7-9 Caspasen erforderlich sind für spermatid Individualisierung in Drosophila ^10,11, für eine alternative necroptotic Zelltod blockiert bei Mäusen ^12,13 und für microRNA Verarbeitung in C. elegans. ^14,15 In vielleicht die langlebigste Zellen, Neuronen, Caspasen und andere apoptotische Maschinen sind an der Regulation neuronaler Aktivität verwickelt durch synaptischen Endungen Beschneidung, ein Prozess vermutlich wesentlich sein , andere Synapsen für Lernen und Gedächtnis zu stärken. ^{16- 18} Es ist möglich , dass Caspasen synaptic pruning durch eine Art Mini-Apoptose von neuronalen winzigen Vorsprünge ohne ganze Zelltod erleichtern. ¹⁹ jedoch Caspasen alternative Funktionen haben in keinem Zusammenhang mit der Apoptose-ähnlichen Ereignissen. ^20,21 Dual - Rolles im Leben und Tod sind nicht einzigartig für Caspasen; BCL-2 - Familie Proteine und Cytochrom c haben Rollen in zelluläre Energetik in gesunden Zellen , sondern sind auch Teil des Kerns apoptotischen Weg, der von vielen Arten von Zellstress aktiviert. ^22-25 Obwohl nicht bewiesen ist , scheint es logisch , dass die Evolution Tag verknüpft hat -Jobs zu Tode-Arbeitsplätze innerhalb der gleichen Moleküle rechtzeitige Beseitigung von untauglich oder unerwünschte Zellen zu gewährleisten.

Gegenwärtig sind die molekularen Mechanismen von nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität nicht verstanden, und das Ausmaß der nicht-apoptotischen Caspase-Aktivität während der embryonalen Entwicklung und in erwachsenen Geweben ist auch nicht bekannt. Eine große Herausforderung ist die Schwierigkeit, Tag-Jobs aus dem Tod Jobs von Caspasen zu unterscheiden. Im Gegensatz zur Apoptose und pyroptosis, als Caspase-Aktivität durch eine proteolytische Kaskade verstärkt wird, werden die Tag-Jobs von Caspasen erwartet bei wesentlich geringeren Mengen an enzymatischer Aktivität auftreten, wahrscheinlich unter der Nachweis von vielen verfügbaren technologien.

Vor der vorliegenden Arbeit entwickelt andere eine Vielzahl von Caspase Biosensoren für verschiedene Zwecke. Die SCAT Biosensoren (zB ECFP-DEVD-Venus) schnell in Echtzeit Caspase - Aktivität in kultivierten Zellen und tierischen Geweben erkennen FRET verwenden. ^26,27 Nach Caspase - Spaltung, die Kern gezielte GFP - Einheit von Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) erfährt subzellulärer Relokalisation innerhalb von Minuten , wenn seine Plasmamembran-Haltegurt durch Caspasen gespalten wird. ²⁸ in ähnlicher Weise ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relokalisiert aus dem Cytosol in den Zellkern auf Caspase - Spaltung. ^29,30 Mehr Vor kurzem wurde das Chromophor in iCasper geschickt entwickelt , wenn sie von Caspasen gespalten zu fluoreszieren, ermöglicht Detektion von Biosensor - Aktivität in Echtzeit in Neuronen von Drosophila - Embryonen, sondern in erster Linie in Verbindung mit Entwicklungs Zelltod. ³¹ Caspase-abhängigen Tod von olfaktorischen Neuronen während alterte demonstbewertet durch Immundetektion der Caspase-gespaltenen Form von CPV Biosensoren (beispielsweise mCD8-PARP-Venus). ^32,33 Wichtig ist , dass die aktivierte Form von Caspase-3 in Abwesenheit von Zelltod durch sensitive immunostain in Stacheln detektierter kultivierten Neuronen und im Soma die Caspase-abhängigen Fluoreszenz des Kern CellEvent Reporterfarbstoff verwenden, aber Schwierigkeiten aufgrund Phototoxizität angetroffen wurden, obwohl Zelltod erst nach spine Eliminierung verzögert. ¹⁹ Somit werden neue Caspase Biosensoren erforderlich nachzuweisen und verfolgen Zellen mit basalen Caspase - Aktivität in vivo.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir einen einen neuen Dual Farbe Caspase Biosensor bezeichnet CaspaseTracker. Diese Strategie kombiniert eine modifizierte Version der Drosophila Caspase-sensitive Apoliner Biosensors ²⁸ mit dem Drosophila G-TRACE FRT - Rekombinase - System ³⁴ permanent zu markieren und die Zellen in vivo zu verfolgen. ^{35 Die Gal4-aktivierte G-TRACE - System ermöglicht ein sehr niedriges Niveau von Caspasen CaspaseTracker zu aktivieren, was zu RFP Expression im Zytoplasma und permanent kern gezielte GFP - Expression in einer beliebigen Zelle , die je Caspase - Aktivität erfahren hat. 35 Dieses System kann etikettieren Zellen im Laufe des Lebens in ganzen Tieren unter Verwendung von Drosophila melanogaster, ein lenkbar und am weitesten verbreiteten Modellsystem für die Untersuchung von Caspasen und Zelltod. 36-38}

Protokoll

1. Herstellung von CaspaseTracker Flies

1. Zur Vorbereitung CaspaseTracker (DQVD) fliegt für Experimente, führen Sie diese Quer: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi> Stop> GFP-nls), durch die Übertragung von 7-10 jungfräulichen Weibchen (oder männlich) die Caspase Biosensor Substrat mCD8-DIAP1-Gal4 durch den Ubiquitin - Promotor ³⁵ zusammen mit der gleichen Anzahl von männlichen (bzw. weiblichen) angetrieben G-TRACE Fliegen, die das zweite Chromosom cyo Ausgleicher haben zu vermeiden Letalität der homozygoten Kombination von G- Fliegen Trage TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP und Ubi> Stop> GFP-nls) ^34. Platz fliegt in einem frischen Lebensmittel Fläschchen mit frischer Hefe-Paste als Proteinquelle.
2. Inkubieren Dateien bei 18 ° C für 5 bis 7 Tage (maximal 2 Wochen) und entfernen Sie dann die Eltern aus dem Fläschchen fliegt mit neuen Nachkommen zu vermeiden, Überfüllung und neue Zucht Fläschchen einzurichten.
3. Weiter Inkubation bei 18 ° C bis Nachkommen eclose fliegt. Wählen Sie das nicht Cyo [non-curly Flügel] Nachkommen des korrekten Genotyp von CaspaseTracker, die ³⁵ für CaspaseTracker und G-TRACE Elemente transgen sind.
4. Gleichzeitig erzeugen Kontrolle der Eltern nicht-transgenen W118 Fliegen und Caspase-unempfindlich (DQVA) fliegt parallel spezifischen CaspaseTracker RFP und GFP-Fluoreszenz zu überprüfen.
5. Führen Sie die PCR-Genotypisierung, um zu bestätigen Dateien mit CaspaseTracker unter Verwendung der Primer: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, ein 3897-bp-Produkt zu erzeugen. Für die Genotypisierung die G-Trace-Loci, verwenden Sie die folgenden Primer, die für GFP (474 ​​bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; für RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; und für Flpase (655 bp), 5 'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Für die Genotypisierung Gal4 im pUWR Vektor (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Gewebepräparation, Färbung und Montage

1. Für Fliegen Dissektionen verhindern seziert Gewebe zu Kunststoff-Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen kleben, beschichten Spitzen und Rohre mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Wasser gelöst.
2. Dissect fliegt auf einem Silikonkissen mit einer Pinzette.
   1. Schäden an den Spitzen der Zange auf eine harte Oberfläche zu vermeiden, wenn das Gewebe Dissektion durchführen, führen Präparation auf einer Siliziumoberfläche. Für Silikon-Dissektion Platten machen, schmelzen das Silizium im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialliste). Nach dem Silikon schmelzen, fügen Sie 3 bis 4 ml zu einem Durchmesser von 60 mm Gewebekulturschale. Silicon Geschirr kann wiederverwendet werden.
   2. Anesthetize eine Fliege mit CO _2, und übertragen sie mit 1 ml kaltem PBS auf eine Silikonplatte. Führen Sie das CO ₂ in ein Fläschchen , die Fliege mit einem Blasrohr enthält, und dann übertragen Sie die narkotisiert fly toa Pad , die eine CO ₂ Versorgung.
   3. Verwenden Sie eine Zange, die Fliege Kopf, und ein zweites Paar von Zange zu halten, den Brustkorb in die entgegengesetzte Richtung zu ziehen, die Fliege Kopf vom Körper zu trennen abdeckt, ohne dass die Verbindung zwischen dem Kopf und foregut zu beschädigen.
   4. Verwenden Sie 2 Paar Zangen, die Flügel und Beine aus dem Thorax zu entfernen.
   5. Verwenden Sie ein Paar Zangen des Thorax zu halten, und ein anderes Paar von Zange den Bauch ziehen Sie sie vom Thorax wieder zu trennen, ohne die Verbindung zwischen dem Vorderdarm und Mitteldarm zu beschädigen.
   6. Präparieren inneren Organe einschließlich Gehirn, Darm, Malpighischen Gefäße und der Ovarien , wie zuvor unter Beweis gestellt. ^39-41
   7. Entfernen Sie alle Stücke der Kutikula und die Fettkörper mit einer Pinzette, da diese Gewebe starke Autofluoreszenz produzieren. Geduld und Übung erforderlich, um eine vollständige Organsystem vorzubereiten, wie dargestellt.
3. Übertragen Sie seziert Gewebe zu 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und reparieren Gewebe with 0,5 ml 4% Paraformaldehyd in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) bei RT für 20 bis 30 min mit der Drehung in der Dunkelheit Bleich RFP und GFP in den Geweben zu vermeiden. Vermeiden Sie längere Fixierung, die nachfolgende Färbung Ergebnisse beeinträchtigen können.
4. Entfernen des Paraformaldehyds durch vorsichtiges Pipettieren und wäscht 3 mal mit 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bei RT.
5. Permeabilisieren die Gewebe mit 0,5 ml PBST bei 4 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. Kürzere Inkubationszeiten unvollständige Permeabilisierung und des Kompromisses Färbung Ergebnisse verursachen.
   1. Wenn es notwendig ist, die Hintergrundfärbung zu reduzieren, sollten Gewebe in 0,5 ml PBST mit 1% BSA anstelle von PBS inkubiert.
6. Waschen Sie die Gewebe 3-mal mit 0,5 ml PBST.
7. Beflecken Kerne und filamentöse Aktin (F-Aktin), gelten 0,5 ml PBST mit 10 ug / ml Hoechst 33342 blau Kern Farbstoff und 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-Actin-Färbung und Inkubation gleichzeitig mit Geweben für 1 h bei RT with sanfte Rotation im Dunkeln. Vermeiden Sie längere Färbung, da dies den Hintergrund zu erhöhen.
   1. Für die Immunfärbung, inkubieren fixiert und permeabilisiert Gewebe mit 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS über Nacht bei 4 ° C, Fleck mit 1: 100-Verdünnung von anti-ELAV Antikörper oder mit 1: 200-Verdünnung von Anti-Caspase-3 Nacht bei 4 ° C (300 ul). Folgen durch den entsprechenden Sekundärantikörpers, verdünnt 1: 100 und Inkubation für 1 bis 3 h bei RT. Siehe Materialliste für spezifische Antikörper Informationen.
8. Waschen Sie die Tücher 3 mal für jeweils 5 min in 0,5 ml PBST mit sanfter Drehung.
9. Mit einer Pipette, entfernen Sie alle PBST und dann 200 ul hinzufügen Antibleichbefestigungsmittel (siehe Materialien) vollständig Gewebe für 1-3 h bei RT abdecken oder 4 ° über Nacht C. Optimale Gewebe, die die Montagemittel vollständig aufgenommen haben, wird auf dem Boden des Röhrchens sinken.
10. Vorreinigung der Glasobjektträger mit Wasser oder 70% Ethanol und das Gewebe mit Befestigungsmittel auf die Glas übertragenRutsche.
11. Vorsichtig ein Deckglas über dem Gewebe. Vaseline auf dem Glasobjektträger und Deckglas zu vermeiden, um das Gewebe durch Überkompression zu zerstören. Entfernen Sie die zusätzlichen Befestigungsmittel mit Seidenpapier.
12. Verschließen Sie die Deckglas durch Anwendung Nagellack alle entlang der Ränder des Deckglases zu vermeiden Leckage von Mitteln aus den Geweben Montage.

3. konfokale Mikroskopie

1. Verwenden eines invertierten konfokalen Epi-Fluoreszenzmikroskop. Jedoch oben rechts Mikroskope verwendet werden kann. Um das Bild zu Geweben tiling Verwendung aufrechtzuerhalten stabile Raumtemperaturdrift des Fokus und der Verschiebung der xy-Ebene zu vermeiden, aufgrund der thermischen Expansion und Kontraktion der Komponenten. Umweltkontrollsysteme und Fokusdrift-Kompensationssysteme helfen, dieses Problem durch den Verlust von thermo-Gleichgewicht des Mikroskopsystems zu vermeiden.
2. Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Mikroskops. Nehmen Sie ein paar Testbilder mit geringer Auflösung (125 x 125 Pixel) eind die entsprechende Anzahl der Kacheln bestimmen erforderlich, um die gesamte Region von Interesse (ROI) zu decken.
3. Stellen Sie das Mikroskop Scansystem zum Erfassen von Bildern mit Scan-Auflösung wie 500 x 500 Pixel. Wählen Sie das Ziel wie ein 20X NA 0,8 oder einem 63X NA 1.4 Plan-Apochromat Ziel für Gewebe durch Glasplättchen zu analysieren, so dass jedes der Bilder (Fliesen) überlappt um 20% auf allen Seiten.
4. Stellen Sie die Bildsequenz von längste bis Anregungswellenlängen kürzesten, als die langwellige Licht niedriger Photobleaching verursacht. Die Sequenz von längste Anregungswellenlänge kürzeste: (i) 633 nm für Phalloidin F-Actin und auf Antikörper gegen aktivierte Caspasen, (ii) 561 nm für RFP, (iii) 488 nm für GFP und (iv) 405 nm Hoechst Kernfärbung.
5. Während der Bilderzeugung minimieren Exposition von Zellen mit Fluoreszenzlaseranregung während des Prozesses Bildgebung Photobleaching zu vermeiden, indem die Laserintensität zu reduzieren qualitativ hochwertige Bilder von Gewebe zu erhalten.
6. Nachdem ichMagiern werden gesammelt, die Bilder mit Mikroskop-Software zusammenführen.

Ergebnisse

Es gibt zwei wichtige Komponenten , die CaspaseTracker erlauben, Caspase - Aktivität in normalen , gesunden Zellen (Abbildung 1a) zu erkennen. Die erste davon ist ein 146 Aminosäure-Caspase-spaltbare Polypeptid nach der Caspase modellierten Biosensor Apoliner (Abbildung 1b). ²⁸ Das Polypeptid aus DIAP1 (Drosophila Inhibitor der Apoptose) abgeleitet ist , eine einzelne natürlich vorkommenden Caspase - Stelle enthält , die typischer...

Diskussion

Hier zeigen wir die Konstruktion und Funktionsweise von CaspaseTracker, die Erkennung von weit verbreiteten basalen Caspase-Aktivität in gesunden Geweben erleichtern. Die kritischen Schritte zum Detektieren nicht-apoptotischen Caspase - Aktivität in vivo sind: 1) Fliegen mit dem Biosensor - Transgen zu erzeugen, 2) Caspase-spezifische Reporterfunktion mit geeigneten Kontrollen Verifizieren, 3) Praktizieren Techniken dissection alle inneren Organsysteme adulter Drosophila zu beobachten, und 4) Scheidu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and Reagents
Vectashield	Vector Products	H-1000	Mounting medium
Forceps	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides	Fisher Scientific	12-565B	Glass slides
Hoechst 33342	Molecular Probes	H1399	DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Antibody Registry ID:  AB_528218	Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond Antifade Mountant	Life Technologies	P36961	to preserve fluorophores
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	Product code: 0001023934	for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W	AmScope	WBM99316	Light source