Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Resumen

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Resumen

En general, la adhesión de las células T es un componente crítico de la función, contribuyendo a los distintos procesos de reclutamiento celular a los sitios de inflamación y la interacción con las células presentadoras de antígeno (APC) en la formación de sinapsis inmunológicas. Estos dos contextos de adhesión de las células T se diferencian en que las interacciones célula T-APC pueden considerarse estática, mientras que las interacciones de los vasos de la sangre por células T son desafiados por el esfuerzo cortante generada por la circulación en sí. interacciones de células T de APC se clasifican como estática en que los dos socios celulares son estáticos con relación al otro. Por lo general, esta interacción se produce dentro de los ganglios linfáticos. Como una célula T interactúa con la pared del vaso sanguíneo, las células detienen y deben resistir el esfuerzo cortante generado. ^1,2 Estas diferencias ponen de manifiesto la necesidad de comprender mejor adherencia estática y la adherencia en condiciones de flujo como dos procesos distintos reguladores. La regulación de la adhesión de las células T se puede describir sucintamente como concurricán el estado afinidad de la integrina moléculas expresadas en la superficie celular, y regulando de este modo la interacción de las integrinas con los ligandos de moléculas de adhesión expresadas sobre la superficie de la célula que interactúan. Nuestra comprensión actual de la regulación de los estados de afinidad proviene de la integrina menudo simplista en sistemas modelo in vitro. El ensayo de adhesión usando condiciones de flujo descrito aquí permite la visualización y la cuantificación exacta de las interacciones de células de células epiteliales T en tiempo real después de un estímulo. Una adhesión bajo ensayo de flujo se puede aplicar a los estudios de adhesión de señalización dentro de las células T después de tratamiento con sustancias inhibidoras o estimulantes. Además, este ensayo se puede ampliar más allá de la señalización de las células T a cualquier población de leucocitos adhesivo y cualquier par molécula de integrina adherencia.

Introducción

La adhesión de linfocitos T media una serie de procesos diferentes en un sistema inmunológico saludable, ³ juega un papel crítico en el tráfico de células T y la presentación de antígenos. Ya sea durante la vigilancia inmune o una respuesta inmune activa estas dos amplias funciones para la adhesión son críticos. ⁴ Los eventos de señalización fisiológicos de las interacciones de células de células endoteliales T son distintos de células T antígeno que presenta la célula (APC) interacciones, y por lo tanto requieren métodos distintos de estudio para entender mejor las cascadas de señalización implicadas. La adhesión firme de una célula T a una pared del vaso sanguíneo durante la extravasación de linfocitos requiere la activación rápida y dinámica de la integrina. La interacción estrecha entre un activo de moléculas de integrina y de adhesión del estado a lo largo del endotelio conduce a resistente al flujo de la sangre de adhesión, permitiendo que las células T para rastrear a lo largo de la superficie en busca de una zona propicia para el paso de la célula. ⁵ El rastreo de un bi células T -directionally Alonga pared del vaso sanguíneo es dependiente sobre la adhesión polarizado, con un extremo frontal adhesiva distinta de la célula T. ⁶ es más importante, la adhesión firme y la transmigración requieren resistencia a la fuerza de cizallamiento generada mediante la circulación de flujo sanguíneo.

En el diseño de experimentos para estudiar la adhesión de linfocitos, se debe prestar atención al estímulo específico de interés. Mientras activación de la integrina es un componente común y crítico de todas las formas de la adhesión de células T, las cascadas de activación es probable que ser único aguas abajo de los receptores individuales y co-receptores. Del mismo modo, los pares de integrina y la molécula de adhesión funcionan en microambientes especializados y en subpoblaciones específicas. De esta manera, estos pares pueden ser regulados de manera muy diferente. El modelo que aquí se presenta es ideal para el estudio de las cascadas que conducen a la activación de la integrina que tiene lugar bajo condiciones de estrés de cizalla de señalización. ⁷ Estas interacciones no pueden entenderse adecuadamente en un ADHESI estáticaen el sistema debido al impacto de estas fuerzas han demostrado tener directamente en el comportamiento de células T. ⁸ Aunque aquí se presenta con las células T y las células CHO (ovario de hámster chino) ingeniería genética para expresar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1 El sistema puede ser fácilmente modificado para estudiar diferentes poblaciones de leucocitos o moléculas de adhesión.

Este ensayo proporciona un método para cuantificar la adhesividad de las células T y activación de la integrina usando tensión de corte, proporcionando un modelo para la etapa de la adhesión firme de la extravasación de leucocitos. A través del uso de las células CHO-ICAM la afinidad de LFA-1 para su ligando en células vivas se puede examinar en tiempo real en respuesta a diversos estímulos de interés. Esta técnica requiere obtiene fácilmente, cámaras de micro-de flujo disponible comercialmente en combinación con una bomba de jeringa, simplificando en gran medida el equipo necesario para modelar el flujo de sangre y el estrés de cizalladura en comparación con otros modelos. ⁹ Otra ventaja importante de este ensayo es que la señalización específicacascadas y el estado de activación resultante de las integrinas individuales pueden ser estudiados limpiamente a través de la utilización de células CHO que expresan moléculas de adhesión de ingeniería humanos de interés. Además, la combinación de los datos cuantitativos con imágenes de células vivas es una ventaja significativa de este método. En general, mientras que una serie de ensayos de adhesión de células T estática que se han descrito muy bien modelar las interacciones de las células T de APC, estos modelos son insuficientes para captar el proceso dinámico de la adhesión célula epitelial T. Por esta razón, la hora de elegir un ensayo de adhesión del estímulo en cuestión debe ser considerada.

Protocolo

1. Revestimiento las células CHO-ICAM

Nota: El objetivo de este paso es la placa de las células CHO-ICAM en las cámaras de flujo para el crecimiento durante la noche con el objetivo de generar una monocapa confluente.

1. Mantener las células CHO-ICAM en 10 cm tratado de cultivo de tejidos placas de cultivo en 10 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM medio de cultivo completo) a 37 ° C con 5% CO _2.
2. Para recoger las células, añadir 1 ml 0,5% de tripsina-EDTA y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min con agitación suave. Neutralizar la tripsina con 4 ml de medios de comunicación.
3. Contar las células CHO-ICAM utilizando un hemocitómetro y calcular 0,75 x 10 ⁵ células por cámara. Nota: En este experimento: se necesitarán 2,25 x 10 ⁵ células para sembrar 3 cámaras.
4. Centrífuga de 0,75 x 10 ⁵ células CHO-ICAM por cámara durante 5 minutos a 500 x g, temperatura ambiente y volver a suspender el sedimento celular en 30 l por cámara de CHO-ICAM Medio de cultivo completo.
   Nota: En este experimento se necesitarán 90 l para sembrar 3 cámaras.
5. Añadir lentamente las células en un depósito de la cámara de flujo. Permitir que las células se asienten durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° con 5% de _CO2.
6. Añadir 200 l de medio de cultivo completo a través de los dos depósitos de cada cámara. adiciones alternar entre los dos para evitar el movimiento de las células ya que el sistema se equilibra.
7. Se incuban las células durante la noche en el interior de una incubadora a 37 ° con 5% de CO _2.

2. Preparación de las células T

Nota: Este ensayo puede realizarse con células T humanas primarias o una línea de células T. Un protocolo de aislamiento de células T de la sangre se ha descrito previamente. ¹⁰ Si se utilizan células T humanas primarias usan células recién aisladas para obtener los mejores resultados. Si se utiliza una línea de células T, seguir el protocolo de cultivo especificado por la fuente de las células. Con el fin de detectar las células en una microsco fluorescentepe las células T se marcaron con éster de succinimidilo fluoresceína carboxi (CFSE).

1. Contar las células T usando un hemocitómetro y calcular 2 x 10 ⁶ células por cámara. Nota: En este experimento, se necesitarán 6 x 10 ⁶ células por 3 cámaras.
2. Centrifugar 2 x 10 ⁶ células T por cámara de 5 min a 500 xg, a temperatura ambiente y volver a suspender las células en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de glucosa o 2% de FBS.
3. Añadir CFSE a escala 1: 1000 dilución (acciones hecha a 5 mm). Cubrir de la luz y se incuba durante 8 minutos a temperatura ambiente
4. Girar a 500 xg durante 5 min, RT.
5. sedimento celular se vuelve a suspender con 240 l por condición (Ver Sección 4 "Nota") de suero carente de medios RPMI. En este experimento, resuspender el sedimento celular en 720 l de llanura RPMI. Dividir las células en tubos de 1,5 ml vacíos etiquetados para cada cámara, 240 l por tubo. Mantener las células en un bloque de calor 37 ° C hasta su uso.

3. La creación de THe Input / Output Tubos Flexibles y bomba de jeringa

1. Se calienta la cámara de imágenes en vivo microscopio para 37 ° C.
2. Preparar la manguera de entrada:
   1. Llene una botella de vidrio de 500 ml con agua y hacer 2 agujeros en la tapa. Etiquetar los agujeros "en" y "fuera". Esto actuará como un baño de agua de calefacción para los medios de entrada.
   2. Ejecutar la entrada de una manguera a través de los agujeros en la tapa y en el baño de agua. Asegúrese de que el lado de la manguera que se conecta a la jeringa viene a través de la "en" agujero y la parte que se conectará al depósito de entrada viene a través del agujero "fuera".
   3. Enjuague la entrada de una manguera con 60 ml de agua para eliminar el aire del sistema.
   4. Primer la entrada de una manguera de medio RPMI que carece de suero calentado a 37 ° C. Llene una jeringa 60 ml y empujar a través de los medios de comunicación hasta que la manguera es completamente imprimada y carente de cualquier burbuja de aire.
      Nota: Dependiendo de la length de tubo utilizado el volumen necesario para cebar variará.
      1. Calcular el volumen de los medios necesarios para el experimento multiplicando la velocidad de flujo (en este caso 0,3 ml / min) por el número de minutos (5 min) por el número de cámaras en el experimento (en este caso 3); en este experimento, el uso de 4,5 ml de medio. Nota: Se recomienda tener 5 ml de volumen extra (en este caso por un total de 9,5 ml) que queda en la jeringa después de la preparación.
   5. Coloque toda la configuración de entrada en el recinto de imágenes en vivo del microscopio para mantener 37 ° C. Ejecutar la manguera y jeringa fuera del recinto y cargar la jeringa en la bomba de jeringa.
3. Preparar la manguera de salida:
   1. Hacer un agujero en la tapa de una botella de 250 ml para su uso como residuos de salida.
   2. Ejecutar el tubo de salida a través del agujero y en la botella. Fije sin apretar la tapa, no se cierra hasta el final.
   3. Coloque la configuración de salida en el recinto de imágenes en vivo de la microscope.
4. Calcular la velocidad de flujo (ml / min) necesaria para generar la tensión de corte deseada (dyn / cm ^2). esfuerzo de corte varía en diferentes compartimentos vasculares, por lo tanto, tener en cuenta el modelo global que incluye los tipos de células que han de estudiarse y tratamientos al decidir sobre un nivel de tensión de corte.
   Nota: Estos experimentos se llevan a cabo en el 0,4 dyn / ^cm2 para imitar un entorno vena pequeña.
   1. Tome las dimensiones de la cámara en el cálculo de la tensión de cizallamiento. Utilice la siguiente fórmula (proporcionado por el fabricante ¹¹⁾ para las cámaras de flujo utilizadas aquí (Véase la Tabla de Materiales): T = η * 176,1 * ø donde la tensión T = esfuerzo cortante, η = viscosidad dinámica, ø = caudal. Nota: La viscosidad dinámica del medio RPMI a 37 ° C es 0,007.

4. Carga de las Cámaras de flujo y la estimulación de las células

Nota: Con el fin de iniciar la adhesión,Las células T deben ser estimuladas. En el siguiente experimento, las células podría mantenerse sin estimular o se estimularon con SDF-1α ¹² o acetato de forbol miristato (PMA; control positivo) ^13. Para la presentación adecuada de quimioquinas a las células T, las células CHO-ICAM se preincuban con SDF-1α (seguido de lavados de serie), lo que permite la presentación en la superficie celular. PMA es un éster de forbol que es estructuralmente similar a la de glicerol segundo mensajero de diacilo (DAG); Aquí se usa como un control positivo. Las células T se tratan directamente con PMA antes de cargar en la cámara de flujo.

1. Colocar el portaobjetos cámara de flujo en el microscopio y establecer el plano focal de la monocapa de células CHO-ICAM utilizando el objetivo 20X.
2. Mantener las células T teñidas con CFSE para todas las otras condiciones en el bloque de calor 37 ° C. Preparar las células CHO-ICAM o T como sigue inmediatamente antes del ensayo para esa condición:
   1. Para la condición de no estimulada (cámara 1), mantenga una ch / tubo de flujoámbar sin tratar, para servir como control negativo para la estimulación.
   2. Para la estimulación con PMA (cámara 2), estimular un tubo de células T con PMA (10 ng / ml) para servir como control positivo; tratar inmediatamente antes de cargarlos en la cámara de flujo.
   3. Para la estimulación SDF-1α, (cámara 3), estimular la tercera cámara de flujo con SDF-1α (100 ng / ml) mediante la eliminación de 70 l a la vez 3 veces desde el depósito superior (depósito de salida) y luego la adición de 70 l de SDF -1α (100 ng / ml) en la parte baja del depósito (depósito de entrada). Incubar durante 5 min.
3. Retire y deseche 70 l a la vez 3 veces desde el depósito de salida de una cámara.
4. Añadir 70 l de suspensión de células T pre-tratada (según sea el caso) en el depósito de entrada 3 veces. Esperar 5 minutos para permitir que las células se mueven desde la entrada de la cámara ( "In"), y para llegar a la salida proximal ( "Out") de la cámara.
5. Durante este tiempo, la imagen 5campos de las células T teñidas con CFSE. Elige campos que se dispersan por todo el centro de la cámara (Figura 1). Utilice las siguientes condiciones de excitación / emisión: excitación láser de longitud de onda: 488 nm; Filtro de emisiones colección: 500 - 540 nm. Estas imágenes servirán como los recuentos de células pre-flujo.
6. Conecte el tubo de entrada y salida al mismo tiempo a los depósitos de la cámara de flujo.
   Nota: Colocación de la tubería al mismo tiempo es crítico a fin de no introducir burbujas de aire en la cámara y el mantenimiento del equilibrio global dentro de la cámara.
7. Comience flujo a 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm ^2), mientras que la visualización de las células T teñidas con CFSE. Cuando comienza el flujo, especialmente con la primera cámara, a menudo hay un retraso entre el inicio de flujo y la observación de la rodadura de las células T, por lo tanto comenzar la sincronización 5 min en el inicio de movimiento de las células T.
8. Terminar el flujo después de 5 minutos, y la imagen 5 campos en el canal CFSE. Elija los campos dispersos aleatoriamente excelentes referenciasughout el centro de la cámara de flujo (Figura 1). Estas imágenes servirán como los recuentos de células post-flujo.

5. La determinación del porcentaje de células adherentes

Nota: Determinación del número de las células en las imágenes adquiridas se hace objetivamente con software automatizado. Para nuestros estudios se utilizó la Volocity software (versión 6.2.1), pero otros programas como ImageJ (versión 1.48V) también son aplicables.

1. Determinar el número de células por campo pre-flujo para cada condición. El promedio de los 5 campos es el "recuento medio de células pre-flujo." ⁷
2. Determinar el número de células por campo de post-flujo para cada condición. El promedio de los 5 campos es el "recuento medio de células de flujo posterior." ⁷
3. Calcular el porcentaje de células adherentes utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de células adherentes = (post-flujo de recuento de células promedio) / (pre-flujo recuento medio de células) x 100%.

Resultados

Los resultados representativos se muestran desde el ensayo de adhesión de flujo usando Jurkat y células T CD3 ⁺ humanas primarias, como se indica, se estimularon con SDF-1α. Los controles negativos en todos los experimentos se muestran en las células no estimuladas. Un porcentaje umbral basal adhesión de las células no estimuladas está entre 5 - 10%; Adherencia baja notablemente por encima de este rango indica un experimento problemática y sugiere la población inicial...

Discusión

Con el fin de analizar adecuadamente la adhesión de células T, el estimulante que se incluirán en el estudio deben ser considerados al momento de elegir un método in vitro. Si bien hay varios ensayos para estudiar las señales que conducen a LFA-1 de activación y ICAM-1 de unión a todos los métodos no son intercambiables. Un ensayo de adhesión estática ¹⁰ es el más adecuado para estudiar las interacciones de las células T de APC; Alternativamente, el método de la tensión de cizallamiento...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950