Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Riepilogo

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

Abstract

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Introduzione

Le cellule eucariotiche senso e si muovono verso la maggiore concentrazione all'interno di un gradiente chemiotattico, un processo cellulare indicato come chemiotassi. Chemiotassi gioca un ruolo critico in molti processi fisiologici, come l'embriogenesi ^1, neurone patterning ^2, le metastasi delle cellule tumorali ^3, il reclutamento dei neutrofili a siti di infiammazione ^4, e lo sviluppo del modello di organismo Dictyostelium discoideum ^5. In generale, le cellule eucariotiche senso chemoattractants utilizzando G-proteine ​​recettori accoppiati ^5. L'impegno di chemiotattici con questi recettori promuove la dissociazione delle proteine ​​G eterotrimeriche Gα e Gβγ, che a loro volta attivano vie di trasduzione del segnale a valle che infine regolano l'organizzazione spazio-temporale del citoscheletro actina di guidare la migrazione delle cellule ^5-9.

biologi cellulari stanno sviluppando e migliorando la chemiotassiè metodi per esaminare come recettori accoppiati a proteine ​​g (GPCR) di segnalazione media la migrazione delle cellule dirette. Il saggio della camera o la migrazione transwell Boyden è stato sviluppato nel 1960 da Boyden ^10. Il test funziona creando un gradiente di composti chemotattiche tra due pozzetti separati da una membrana microporosa. La sua semplicità e facilità d'uso rendono il saggio chemiotassi più usato fino ad oggi. Tuttavia, il test non consente al processo di migrazione delle cellule da visualizzare. La camera di Zigmond è il primo dispositivo a microfluidi visivo che permette l'imaging chiaro di migrazione delle cellule su un vetrino in una costrizione stretto verso una fonte chemoattrattante ^11. Dunn ¹² e ¹³ Insall modificati e migliorati ad alta risoluzione e la capacità di imaging a lungo termine del test chemiotassi camera di Zigmond. A causa delle caratteristiche, altamente prevedibili di diffusione dominante di flusso del fluido, microfluidica è stata fornitura di soluzioni per il prossimo-Generatisu analisi chemiotattica come EZ-TAXIScan (un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule).

Con la stabilità del gradiente assicurato, il dispositivo consente sei chemiotassi test da effettuare contemporaneamente (Figura 1A). In contrasto con i gradienti direzionalmente fissi generati nei vari saggi camera sopra, il saggio ago o micropipetta sviluppato da Guenther Gerisch genera un gradiente con una sorgente mobile ^14. Nel saggio, chemiotattico viene rilasciato da una micropipetta mobile per generare un gradiente stabile. Con questo test l'ago, i ricercatori hanno scoperto che le cellule diverse generano pseudopodi con caratteristiche fondamentalmente diverse. L'applicazione di microscopia a fluorescenza, siamo stati in grado di visualizzare il gradiente per facilitare la sua misurazione quantitativa tutto ^15. In questo studio, descriviamo metodi dettagliati per la preparazione chemiotattica HL60 (leucemia promielocitica umana), le cellule, il monitoraggio contemporaneamente più assa chemiotassiys con il dispositivo di analisi della mobilità delle cellule, e la visualizzazione dei GPCR-mediata dinamiche spazio-temporali di molecole di segnalazione come la proteina chinasi D1 in singole cellule vive in risposta a stimoli visibili, chemotattiche spatiotemporally controllabili. I nostri metodi di imaging avanzati possono essere applicati a studi generali chemiotassi, e sono particolarmente adatti per sistemi cellulari di mammifero.

Protocollo

1. La cultura e la differenziazione dei neutrofili umano-come le cellule HL60

1. Preparare RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 coltura contenente RPMI 1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 0,1 mM di sodio piruvato, e 25 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1 L'acido -piperazineethanesulfonic). Riscaldare il terreno di coltura RPMI 1640 a 37 ° C.
2. Utilizzando un emocitometro determinare la densità cellulare delle cellule HL60 per assicurarsi che le cellule sono in fase di crescita log-fase.
   NOTA: Le cellule sono di solito in fase logaritmica il terzo giorno dopo passaging. La densità delle cellule log-fase è generalmente 6-8 x 10 ⁵ cellule / ml. La densità cellulare necessaria per iniziare una nuova coltura è di circa 1,5 x 10 ⁵ cellule / ml.
   NOTA: per esempio, per un 10 ml nuova cultura in un pallone piatta T-75, se la densità cellulare di cellule log-fase è di 6 x 10 ⁵ cellule / ml, poi 2,5 ml di cellule log-fase (6 x 10 ⁵ ) viene diluita al 1.5 x 10 ⁵ cellule / ml in 10 ml nuova cultura. Per fare un volume finale di 10 ml coltura, 7,5 ml di RPMI 1640 medium coltura viene aggiunto.
3. Posizionare il volume calcolato di caldo RPMI 1640 terreno di coltura in un pallone piatta. Per un piatto cultura matraccio T-75, il volume totale della coltura cellulare è di 10 ml.
4. Aggiungere il volume calcolato di log-fase di crescita le cellule HL60 nel pallone piatta per raggiungere una densità cellulare di 1,5 x 10 ⁵ cellule / ml.
5. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO _2.
   NOTA: Il tempo di raddoppio di HL60 è quasi 24 ore.
6. Passage le cellule con RPMI 1640 medium coltura ogni 2-3 giorni. È importante che la densità cellulare delle cellule HL60 non supera 1,5 x 10 ⁶ cellule / ml e il passaggio di cellule non più di 2 mesi dura.
7. Differenziare le cellule HL60 5 giorni prima degli esperimenti.
   NOTA: RPMI 1640 medium differenziazione contiene terreno RPMI 1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 0,1 mM di sodio piruvato, 25 mM HEPES, e 1,3% dimetilsolfossido (DMSO). In altre parole, è 1,3% DMSO in RPMI 1640 medium coltura.
   1. Per differenziare le cellule HL60, pre-riscaldare il mezzo di coltura RPMI 1640 a 37 ° C. Aggiungere la calda RPMI 1640 medium coltura in un pallone piatta.
   2. Per 10 ml di coltura differenziazione HL60, aggiungere 130 ul DMSO direttamente al mezzo di coltura RPMI 1640 nel pallone piatta mentre vorticoso pallone in modo che il DMSO è rapidamente diluito dal mezzo di coltura RPMI 1640.
   3. Aggiungere cellule HL60 log-fase ad una densità cellulare finale di 1,5 x 10 ⁵ cellule / ml in 10 ml di RPMI 1640 medium finale differenziazione. Culture cellule HL60 in RPMI 1640 medium differenziazione a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO ₂ per 5 giorni.

2. rivestimento della superficie di vetro coperchio della camera 4well

1. Prendete la bottiglia del 2% soluzione di gelatina magazzino dal frigorifero, pulirlo con il 70% di etanolo, e posizionarlo nella cappa. TAke 1 ml 2% di gelatina soluzione madre e restituire il restante soluzione di gelatina magazzino al frigorifero immediatamente.
2. Lasciare la soluzione di gelatina per liquefare completamente a 37 ° C e pipetta accuratamente. Diluire la soluzione di gelatina magazzino 2% con una soluzione salina bilanciata 9 ml di pre-riscaldato 1x Hanks '(HBSS) tampone ad una concentrazione finale di 0,2% di gelatina.
3. Aggiungere 0,5 ml o 2 ml 0,2% di gelatina in HBSS ai due pozzetti centrali di una camera 4 pozzetti o una camera 1-bene con un vetro di copertura sul fondo, rispettivamente. Inclinare le piastre in diverse direzioni in modo che il liquido copre l'intera superficie.
4. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °. Le piastre saranno pronte per l'uso in 1 ora. Possono essere utilizzati per 5 giorni. Appena prima della semina cellule, rimuovere la soluzione di gelatina dalle 4 e 1 o pozzetti camere.

3. Chemiotassi Assay Utilizzando Cell Analisi Mobilità Dispositivo

1. Preparare e riscaldare RPMI 1640 medium morendo di fame, che è RPMImezzo contenente 0,1 mM piruvato di sodio (opzionale) e 25 mM HEPES.
2. Preparare 100 ml di 100 Nm fMLP (N-formylmethionyl-leucil-fenilalanina) in RPMI 1640 affamato di media.
3. Preparare 3 ml di 1% di albumina sierica bovina (BSA) / RPMI 1640 medium contenente 1% BSA in RPMI 1640 fame medie e 10 ml di 0,1% BSA / RPMI 1640 medium.
4. Coat un coprioggetto quadrata 22 mm e una mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi 5 micron con appena preparato 1% BSA / RPMI 1640 medium per 1 ora a RT.
5. Montare il supporto mediante la seguente procedura:
   1. Posizionare la base porta con le leve in posizione verticale in modo che le leve possono inclinare verso l'utente. Applicare la soluzione di etanolo al 70% alla superficie del vetro 41 mm. Pulire accuratamente le superfici con un wipe, facendo attenzione a non graffiare loro.
   2. Inserire il vetro 41 millimetri nella base titolare. Mettere il BSA-rivestito 22 millimetri coprioggetto quadrato sulla parte superiore del vetro 41 mm di base supporto.
      NOTA: La rivestito piazza coverslip tra il vetro 41 millimetri e il chip permette chemiotassi a verificarsi sul substrato della superficie del rivestimento.
   3. Inserire l'O-ring (piccola) nel fondo del contenitore wafer, e montare l'alloggiamento wafer nella base supporto con il foro ellittico sul retro. Estrarre il livello interna della base porta avanti in posizione orizzontale per bloccare l'alloggiamento wafer in posizione.
   4. Soffiare la polvere dall'interno dell'alloggiamento wafer con una bomboletta di aria. Aggiungere 4 ml di 0,1% BSA / RPMI 1640 medium nell'alloggiamento wafer.
   5. Montare chip del dispositivo di analisi della mobilità cellulare BSA rivestite al centro dell'alloggiamento cialda con faccia strutturale verso il basso in contatto con il vetro.
      NOTA: che il chip deve essere inserito con il marchio di posizionamento (il foro nella parte superiore del chip) sul retro.
   6. Fissare la guarnizione di gomma alla parte inferiore del morsetto fetta inserendo le due sporgenze sulla guarnizione di gomma nei fori.
   7. Montare l'O-ring (grande) sula parte superiore della custodia wafer. Montare il morsetto wafer con il foro sensore sul retro. Tirare la leva esterna della base dell'alloggiamento in avanti in posizione orizzontale per bloccare il morsetto wafer in posizione.
   8. Dopo il montaggio del supporto, posizionare la parte inferiore del supporto sulla scatola luminosa per confermare l'assenza di bolle d'aria nei pozzetti. Se vengono rilevate bolle d'aria, rimuoverli con la siringa in plastica fornito dotato di una punta di caricamento del campione.
   9. Rimuovere il coperchio e mettere il gruppo sulla lamiera superiore dell'unità periferica analisi della mobilità cellulare. Fissare il blocco sensore al titolare.
6. Preparare cellule HL60 per Chemiotassi saggio:
   1. Calcolare la densità cellulare delle cellule HL60 differenziate con un emocitometro. Dopo 5 giorni di differenziazione, la densità cellulare è di circa 1.0 x 10 ⁶ cellule / ml.
   2. Calcolare il volume finale di cellule HL60 ad una densità cellulare finale di 2 x 10 ⁶ cellule / ml. Ad esempio, se la densità cellulare dellacellule HL60 differenziate è 1,0 x 10 ⁶ cellule / ml, poi 10 ml di cellule HL60 differenziate saranno risospese con 5 ml di 0,1% BSA / RPMI 1640 medium raggiungere 2 x 10 ⁶ cellule / ml.
   3. Centrifuga differenziato cellule HL60 a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con il volume calcolato di 0,1% BSA / RPMI 1640 medium al punto 3.6.2) ad una densità cellulare finale di 2 x 10 ⁶ cellule / ml.
7. Avviare l'unità dispositivo di analisi della mobilità cellulare e PC per l'acquisizione delle immagini. Collegare l'unità al PC. Accendere il dispositivo di analisi della mobilità delle cellule. Accendere il PC.
8. Avviare la cella analisi della mobilità Device Software.
   1. Osservare 5 pannelli di controllo: le immagini della fotocamera, di riscaldamento, di ripresa, appunto, e la macchina fotografica.
   2. Sul pannello di controllo della telecamera, usare "linea orizzontale" o "linea verticale" per regolare la posizione di titolare / vista in tempo reale per centrare la telecamera nel pannello della telecamera.
   3. Sul pannello di controllo della fotocamera, selezionare CH1 a CH6 per spostare la telecamera al canale definito. Per centrare i campi Veduta di un canale, fai clic su "Sposta L" o "Move R" per regolare la coordinata X della fotocamera e centrare la posizione della fotocamera in senso orizzontale.
   4. Regolare la coordinata Y della telecamera ruotando la manopola di posizione sul pannello frontale dell'unità periferica analisi della mobilità delle cellule per regolare verticalmente l'immagine per centrare lo schermo.
   5. Sul pannello di controllo di riscaldamento, impostare il "temp titolare" a 37,0 ° C e la "temperatura piatto" a 39 ° C. Fai clic su "Heat" per iniziare il riscaldamento. Inoltre cliccare "supporto" per il controllo della temperatura mediante il sensore termico collegato al supporto.
   6. Sul pannello di tiro, immettere "15 sec" in "Interval" e "30 min" a "Time" per gli intervalli e la durata del test chemiotassi. Controllare "riscaldatore fuori alla fine delle riprese" per motivi di sicurezza. Designare un destination per le immagini memorizzate.
   7. Sul pannello promemoria, le specifiche di ingresso degli esperimenti, come la linea di cellule utilizzate, anche se non è stato applicato il trattamento, e la concentrazione di chemio-attrattivi applicate.
   8. Conferma la posizione centrale di tutti i canali che verranno utilizzati negli esperimenti, e ripetere la regolazione di tutti i canali, se necessario.
9. Iniettare e allineare le celle come segue:
   1. Rimuovere il buffer dal supporto, ed estrarre 8 ml di tampone dal terzo pozzo dall'alto per ciascun canale.
   2. Utilizzare una siringa per iniettare 2 ml di cellule nel secondo pozzo nello stesso canale durante il monitoraggio schermo in tempo reale per controllare il numero di cellule e di flusso durante l'iniezione. Dopo che le cellule sono ben allineati, aggiungere immediatamente le 8 ml di tampone indietro. Ripetere la stessa procedura per gli altri canali (Figura 1B).
10. Aggiungere 2 ml di tampone di nuovo al titolare, e aggiungere 1 ml 100 nM fMLP al terzo pozzo dall'alto. Avviare l'acquisizione delle immagini e salvare i dati. Analizzare i dati ottenuti utilizzando un'immagine di ricalco software ⁹ (figura 2).

4. trasfezione con elettroporazione

1. Differenziare le cellule HL60 5 giorni prima dell'esperimento, come descritto nella Sezione 1. Coat 4 e 1 o pozzetti camere come indicato nella Sezione 2.
2. Preparare e caldo RPMI 1640 medium recupero elettroporazione, contenente RPMI 1640, 20% (v / v) di FBS, 0,1 mM di sodio piruvato, e 25 mM HEPES, a 37 ° C.
3. Poco prima di iniziare l'esperimento transfezione, aggiungere o 300 ml o 3 ml di RPMI 1640 terreno di coltura nei pozzetti dei 4 pozzetti o 1-e camere di pre-rivestiti, rispettivamente.
4. Incubare le camere in un umidificata 37 ° C incubatore con 5% di CO _2. Utilizzare queste camere immediatamente o conservare in incubatrice per un utilizzo futuro (due settimane).
5. Conta la densità cellulare della HL6 differenziata0 cellule con un emocitometro.
   NOTA: La densità cellulare raggiunge spesso circa 1.0 x 10 ⁶ cellule / ml. Densità cellulare maggiore di cellule 3,0 x 10 ⁶ / ml di solito dà indesiderabile efficienza di trasfezione. Come le cellule HL60 sono cellule in sospensione, non è necessaria alcuna risospensione.
6. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere 2 x 10 ⁶ cellule HL60 in 100 ml di reagente di trasfezione.
7. Aggiungere 4 mg di GFP-PKD1 plasmide ⁹ nella miscela 100 microlitri di cellule e reagenti di trasfezione e mescolare delicatamente e accuratamente. Aggiungere il composto nella cuvetta fornito.
8. Selezionare il programma di pre-set del produttore per la linea cellulare dei leucociti umani ed eseguire l'elettroporazione.
   NOTA: Ulteriori informazioni sono disponibili sul sito web del produttore.
9. Dopo l'elettroporazione, immediatamente e delicatamente aggiungere preriscaldata 500 microlitri RPMI 6140 medie recupero elettroporazione alle cellule, etrasferire delicatamente le cellule dalla cuvetta ad un tubo 1.6ml con le pipette di plastica forniti.
10. Incubare le cellule per 30 min in un umidificata 37 ° C incubatore con 5% di CO _2. Seme 100 microlitri o 500 ml di cellule in un pozzetto di una 4-pozzo o una camera 1 be rispettivamente.
11. Aggiungere RPMI 1640 medium coltura ad un volume finale di 1 ml o 4 ml per quello stesso pozzetto di una 4-pozzo o una camera 1 be rispettivamente. Incubare le cellule in un umidificata 37 ° C incubatore con 5% di CO ₂ per 3 ore. Pre-caldo RPMI 1640 medium di fame a 37 ° C.
12. Usando una pipetta 1 ml, rimuovere delicatamente 0,8 ml o 3 ml di RPMI media 1.640 cultura dal pozzo di una camera a 4 pozzo o una camera 1-bene, rispettivamente. Sii gentile ed evitare di succhiare via le cellule HL60 aderenti.
    NOTA: cellule HL60 crescono e si differenziano nei mezzi di sospensione. Dopo essere differenziate o con alcuni trattamenti, le cellule HL60 aderire al substrato rivestito con polilisina, collagene, gelatina, o fibronectin.
13. Aggiungere 0,8 ml o 3 ml di RPMI 1640 affamati media nel pozzo di un 4-bene o 1-bene da camera rispettivamente. Attendere 1 ora.
    NOTA: A questo punto le cellule sono pronte per esperimenti di imaging ^9.

5. Monitoraggio GPCR-mediata membrana traslocazione di PKD1 da Multi-channel fluorescente Microscopia

1. Preparare una miscela fresca di 100 nm fMLP e 1 mg / ml di Alexa 594 in RPMI 1640 affamato di media come stimoli.
   NOTA: La miscela di FMLP e Alexa 594 ha bisogno di essere preparato per garantire la massima efficacia.
2. Montare una camera 4-bene seminati con cellule più di una lente di olio 40X.
3. Impostare il microscopio a fluorescenza in configurazione multicanale come segue:
   1. Impostare il canale verde di emissione (500-530 nm) per la GFP-tagged PKD1, canale di emissione rossa (580-620 nm) per chemiotattico fMLP (Alexa 594), e il canale luce trasmessa per identificare le cellule HL60 aderenti.
   2. Inizia acquisizione "in diretta" eottimizzare le condizioni di acquisizione dei tre canali:
   3. Fine-tune tra intensità e potenza laser per tutti i tre canali per minimizzare photobleach per un periodo più lungo di imaging.
   4. Se necessario, in media ogni 2 a 4 fotogrammi per diminuire il rumore di fondo per una migliore qualità delle immagini. Utilizzare un intervallo di 1 sec.
4. Ricerca di aderire cellule che esprimono una forte PKD1-GFP nella visualizzazione del canale GFP e DIC (interferenza differenziale contrasto). cellule aderenti sono morfologicamente piatta e non si muovono rapidamente.
5. Dopo aver identificato le cellule aderenti HL60 che altamente espresso GFP-PKD1, ottimizzare la condizione acquisizione abbassando la potenza del laser, aumentando il guadagno del rivelatore per ciascun canale per diminuire il photobleach per l'imaging a lungo termine (Figura 3A).
6. Raccogliere 100 ml di fMLP / Alexa 594 microlitri soluzione con un pipetter 200 e mettere da parte. Selezionare l'opzione "acquisizione time-lapse" e impostare gli intervalli di2 sec e il numero di fotogrammi di acquisire a 100.
   NOTA: gli intervalli e il numero di fotogrammi da acquisire dipendono dallo scopo degli esperimenti. 1-2 intervalli sec e 100 telai sono spesso utilizzati per esperimenti di imaging, come nella figura 3. Per la migrazione di cellule lentamente, intervalli più lunghi sono necessari per l'imaging a lungo termine. Al contrario, per la rapida migrazione delle cellule, intervalli più brevi sono necessari per osservare i dettagli continue della migrazione cellulare.
7. prendere cautela il coperchio di una camera 4-bene in modo che la posizione della camera non viene modificato. Inizia acquisizione immediatamente e acquisire 3-5 immagini delle cellule non stimolate, mentre il posizionamento del pipetter 200 microlitri direttamente sopra le cellule utilizzando il punto di luce laser come guida.
8. Pipetta il 594 miscela fMLP / Alexa sulle celle di essere ripreso con un rapido e anche il flusso e terminare il set completo di acquisizione time-lapse. Nome e salvare i dati che saranno oggetto di ulteriori analisi dei dati.

6. Le cellule Imaging Chemotaxing di stimoli visibili e controllabili Chemo-attrattivo

1. Utilizzando un 10 consigli micropipetter e iniezione microlitri, recupero informazioni una micropipetta con 30 microlitri preparati al momento miscela di fMLP e Alexa594.
2. Fissare la micropipetta al titolare micropipetta montato su di un palco microscopio e collegare il tubo per l'unità di alimentazione di pressione, un apparato che fornisce una pressione costante per rilasciare soluzione fMLP / Alexa594 dalla micropipetta per generare un gradiente costante.
3. Accendere l'alimentazione di pressione e regolare la pressione di compensazione (Pc) a 70 hPa.
4. Montare un vetrino 1-bene a camera seminati con cellule HL60 che esprimono GFP-PKD1 su una lente di olio 40X su un microscopio confocale o il suo microscopio a fluorescenza equivalente.
5. Situato acquisizione in modo canale nella seguente configurazione: canale verde (500-530 nm) per PKD1 GFP-tagged; canale rosso (580-620 nm) per chemiotattico fMLP (Alexa594); e transsentato canale di luce per l'identificazione di cellule HL60 aderenti.
6. Inizia acquisizione "live" e ottimizzare le condizioni di acquisizione per i tre canali: regolare l'intensità di ciascun canale per l'analisi quantitativa dei dati di imaging; perfezionare tra intensità e la potenza del laser per tutti e tre i canali di ottenere immagini con la migliore qualità e minimizzare la foto-candeggina. Se necessario, in media ogni 2 o 4 fotogrammi per una migliore qualità dell'immagine. Noi di solito utilizzare un intervallo di 1 sec.
7. Inizia acquisizione "live" e la ricerca di aderire cellule che esprimono una forte PKD1-GFP in vista della GFP e canali luce trasmessa. Utilizzando ottica in campo chiaro, centro micropipette nel centro campo di vista (Figura 4A) per visualizzare il gradiente fMLP e le cellule HL60 aderenti esprimono PKD1-GFP.
8. Selezionare acquisizione time-lapse e impostare gli intervalli a intervalli di 2 sec e il numero di fotogrammi da acquisire per 100.
   NOTA: Dopo aver raccolto ogni tSerie ime-lapse, nome e salvare i dati che saranno oggetto di ulteriori analisi dei dati.

Risultati

l'imaging simultaneo di chemiotassi di più celle HL60 con dispositivo di analisi della mobilità delle cellule

Sulla base del principio di microfluidica ^16, il costruttore ha fornito profili simulati dei gradienti: un gradiente viene generato entro 1 minuto, stabilizzata entro 5 minuti, e mantenuta oltre 2 ore. I profili altamente prevedibili dei gradienti stabili generati da microfluidica consentono a più chemiotassi test da effettuare contemporaneamente. In questo studio, abbiamo osservato tre analisi chemiotattica simultanee (Figura 2a e Movie 1). Abbiamo scoperto che le cellule HL60 iniziato chemotaxing subito dopo il chemiotattico è stato iniettato nel pozzo del chemiotattico, e tenuto chemotaxing in un percorso rettilineo per i seguenti 60 minuti, in linea con i risultati della simulazione per la stabilità del gradiente. Tracciare il percorso di viaggio e la morfologiadelle celle consente misurazioni quantitative e successivo confronto dei comportamenti chemiotassi utilizzando un indice di chemiotassi che include la lunghezza totale del percorso, velocità, direzionalità e morbidezza delle cellule (Figura 2B). Lunghezza totale percorso è la somma delle lunghezze dei segmenti di linea che collegano i centroidi di percorso. Velocità si ottiene dividendo la lunghezza totale percorso dal tempo. Direzionalità è misurata verso l'alto ed è definito come: (coordinata Y della fine del percorso meno coordinata Y d'inizio) diviso per totale lunghezza del percorso. Questo dà 1.0 per un oggetto in movimento direttamente verso l'alto. La rotondità della cella è una misura (in percentuale) di quanto efficientemente una data quantità di perimetro racchiude l'area. Un cerchio ha la più ampia per un dato perimetro e ha un parametro di rotondità del 100%. Una linea retta racchiude nessuna area e ha un parametro rotondità 0%. Mostriamo il comportamento chemiotassi quantitativamente misurato come descritto dai parametri selezionati chemiotassi(Figura 2C).

Monitoraggio PKD localizzazione subcellulare in cellule HL60 sotto un spatiotemporally visibile e controllabile stimolo fMLP

Si tratta di un grande progresso tecnico ai fini fluorescente e stimolo chemiotattico controllabile ad un sistema sperimentale. Storicamente, abbiamo applicato sia omogeneo stimolazione (chiamato anche uniforme) o stimolazione gradiente di osservare la risposta delle cellule e comportamenti. Tuttavia, la stimolazione "alla cieca" non solo non fornisce alcuna informazione spazio-temporale su come lo stimolo raggiunge le cellule, ma getta anche in dubbio eventuali osservazioni "anormali" di risposta cellulare alla stimolazione, semplicemente perché non vediamo lo stimolo. Abbiamo precedentemente dimostrato che colorante fluorescente (Alexa594) può essere applicato con chemiotattico per stabilire una relazione lineare tra la concentrazione chemiotattico e mintensità colorante fluorescente onitored ^15. Con una configurazione di acquisizione della proteina fluorescente verde (GFP), una emissione rossa di colorante fluorescente (Alexa594), e la luce trasmessa, siamo in grado di monitorare le cellule aderenti, l'applicazione dello stimolo, e la risposta cellulare allo stimolo (Figura 3A). La proteina chinasi D è una famiglia di serina / treonina chinasi che svolgono ruoli essenziali nella migrazione delle cellule diretto ^9,17. In risposta a uniformemente applicata la stimolazione fMLP (rosso), le cellule HL60 mediare una robusta membrana traslocazione di GFP-tagged proteina chinasi D1 (verde) (Figura 3B e Movie 2). In un gradiente fMLP (rosso) (Figura 4A), cellule HL60 reclutano attivamente PKD1 al bordo anteriore (Figura 4B e film 3). Un confronto attento della localizzazione subcellulare di GFP in sporgenza del bordo anteriore indica che PKD1 localizza nella parte posteriore del bordo anteriore (Figura 4C).

Figura 1. cellulare mobilità analizzatore consente fino a 6 analisi chemiotattica simultanee. (A) Schema mostra la progettazione di un chip di dispositivo di analisi della mobilità cellulare per il monitoraggio simultaneo di 6 analisi chemiotattica indipendenti. spettacoli Red chemiotattico aggiunti ai pozzetti. (B) Introduzione di cellule HL60 ai pozzi di cellule, mentre il fattore chemiotattico diffonde per stabilire una pendenza costante fMLP. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. il monitoraggio simultaneo di molteplici analisi chemiotattica con le cellule HL60. (A ) Montaggio mostra le immagini della mobilità delle cellule saggio dispositivo di analisi chemiotassi per esaminare gli effetti inibitori degli inibitori PKD-specifici sulla chemiotassi nei momenti di 0 e 12 min dopo l'applicazione del gradiente. cellule chemiotattica HL60 sono stati pre-trattati con inibitori PKD 1 micron CID755673 per 30 min. cellule HL60 con o senza il trattamento di inibitore PKD sono stati autorizzati a chemiotassi sia RPMI1640 medio morire di fame o 100 gradienti nM FMLP per 12 min. (B) Schema mostra la lunghezza del percorso di viaggio e la morfologia delle cellule HL60 tracciate. (C) Quantificazione dei chemiotassi la lunghezza totale del percorso, la velocità, la direzionalità, e rotondità. Media ± SD è mostrato; n = 10, 12, o 11 per nessuna sfumatura, fMLP pendenza senza trattamento CID755673, e il trattamento fMLP con il trattamento CID755673, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. GPCR-mediata robusta traslocazione della membrana di PKD1 in risposta a stimoli applicati omogeneamente FMLP. (A) monitoraggio multicanale di PKD1-GFP (green), chemiotattico (1 micron fMLP mescolato con 0,1 mg / ml colorante fluorescente Alexa 594, rosso) e DIC (differenziale contrasto interferenziale) per identificare le cellule HL60 aderenti in un pozzetto di una camera di 4well rivestito con 0,2% di gelatina in RPMI 1640 medium. Barra di scala = 10 micron. (B) Montaggio mostra che uniformemente applicata fMLP (rosso) induce robusta traslocazione della membrana di PKD1-GFP (green). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figure 4. principale bordo localizzazione PKD1 in chemotaxing cellule HL60. configurazione acquisizione modalità (A) Canale facilita la visualizzazione del gradiente fMLP e le dinamiche spazio-temporali di PKD1. In A - C, le cellule HL60 transitoriamente espressi PKD1 GFP-tagged; visualizzare il gradiente fMLP generato da una micropipetta (DIC), 100 nM fMLP (rosso) è stato miscelato con 0,1 ug colorante fluorescente / ml Alexa 594. (B) localizzazione Arricchito di PKD1 all'avanguardia della cella chemotaxing. Barra di scala = 10 micron. (C) fusione di immagini mostrano che PKD1 localizza nella parte posteriore del bordo d'attacco in cellule HL60. Verde mostra PKD1 localizzazione cellulare, e l'immagine DIC mostra la zona sporgente del bordo di attacco. Scala bar = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Nel presente studio, mostriamo due esempi di analisi chemiotattica: in primo luogo, il monitoraggio simultaneo di molteplici analisi chemiotattica dal dispositivo di analisi della mobilità delle cellule; e in secondo luogo, la visualizzazione del gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali degli eventi nelle stesse celle in tempo reale di segnalazione.

dispositivo di analisi della mobilità cellulare per più analisi chemiotattica simultanei

Nel presente studio, abbiamo introdotto un protocollo dettagliato per eseguire più analisi chemiotattica simultanea utilizzando un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule. Questo dispositivo permette di osservare il comportamento chemiotassi cellulare con una lente obiettivo 10X in osservazione in campo chiaro convenzionale. A causa delle caratteristiche di diffusione dominante del flusso di fluido, il dispositivo di analisi della mobilità cellulare genera altamente prevedibili, gradienti stabili e consente fino a sei analisi chemiotattica essere effettuate simultaneamente. I passaggi critici del protocollo sonoavere gradienti affidabili e allineare le celle nella riga terrazza. L'utente deve seguire rigorosamente le istruzioni del produttore per il montaggio titolare e l'iniezione di fattori chemiotattici e cellule. Istruzioni dettagliate sono disponibili anche online. Rispetto ai metodi alternativi chemiotassi ^11-13,15, questo dispositivo migliora notevolmente l'affidabilità e l'efficienza di analisi chemiotattica. Quattro formati di mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi in dimensioni di 4, 5, 6, e 8 micron sono disponibili per ospitare diversi tipi e dimensioni di cellule. Abbiamo scoperto che una mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi 4 o 5 micron è adatto per l'HL60 e D. cellule discoideum, che sono circa il 10-15 micron di diametro. Tuttavia, una limitazione è che questo dispositivo non è adatto per tutti i tipi di cellule. Abbiamo avuto poco successo con il saggio chemiotassi dispositivo di analisi della mobilità delle cellule con le cellule Raw267.4. La ragione può essere che le cellule migrano Raw267.4 troppo lentamente. Il tempo necessario per Che efficientemotaxis di cellule Raw267.4 potrebbe essere molto più lungo del tempo di un gradiente viene mantenuta dal dispositivo. Invece, un test di migrazione transwell ha funzionato bene per le cellule Raw267.4 ^9. Un'altra limitazione è che l'osservazione fluorescente non è possibile con il dispositivo corrente. Una direzione futura è quello di monitorare l'imaging a fluorescenza con ingrandimento maggiore. Questo è possibile con il dispositivo perfezionato analisi della mobilità cellulare, che è dotato di rilevazione fluorescente ed una lente obiettivo 100X. Inoltre, il numero di saggi simultanee è anche aumentata a 12. Tutti questi miglioramenti facilitano la maggiore throughput analisi chemiotattica e l'osservazione delle dinamiche subcellulari nella migrazione delle cellule.

Elevata efficienza di trasfezione di cellule HL60 per esprimere la proteina proteina fluorescente-tag

cellule HL60 sono una linea cellulare di leucemia dividendo attivamente e crescono in sospensione. Come precedentemente riportato ^18-20, cellule HL60 sono resistenti gtrasferimento ene. Sia lipidi e il trasferimento genico elettroporazione sono stati testati, e una maggiore efficienza di trasfezione è stato ottenuto con elettroporazione, come descritto in dettaglio nel capitolo 4. Recupero alta vitalità dopo l'elettroporazione è fondamentale per l'ottenimento di alta efficienza di trasfezione a causa del grave danno che deriva dalla elettroporazione. Successivamente, la gestione accurata e delicata delle cellule sono necessari, soprattutto dopo l'elettroporazione. Tutti i supporti devono essere pre-riscaldato e delicatamente aggiunto alle cellule in tutte le misure dopo l'elettroporazione. È anche fondamentale ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule alla reagente elettroporazione. Per evitare la morte delle cellule, dopo l'elettroporazione, RPMI 1640 medium recupero elettroporazione deve essere aggiunto alle cellule immediatamente. Abbiamo scoperto che il 20% FBS a medio recupero dà un tasso di recupero delle cellule molto superiore al 10% FBS. Dopo l'elettroporazione, incubazione in RPMI medio recupero 1640 elettroporazione per 30 minuti è fondamentale per una maggiore vitalità e trasfezioneefficienza. Per aumentare ulteriormente l'efficienza di trasfezione, abbiamo usato anche 4 mg plasmide DNA per trasfezione, che è quasi la quantità doppia di plasmide consigliato dal produttore.

Ci sono due principali limitazioni su elettroporazione trasfezione: la transitorietà della espressione della proteina e il limite di numero di cellule (2 x 10 ⁶ cellule per trasfezione). In cellule indifferenziate, espressione è rilevabile solo durante il primo paio di divisioni cellulari, poiché il vettore plasmidico è diluito metà dopo ogni divisione cellulare. Per Il HL60 differenziate cellule sopravvivono non più di 48 ore. Come risultato, ogni esperimento richiede trasfezioni freschi 6 ore prima dell'esperimento. Il numero di cellule per una elettroporazione solo soddisfa il requisito minimo per tutti i saggi biochimici. Ai fini di uso ripetitivo o grande quantità, si raccomanda vivamente che si stabilisca una linea di cellule HL60 indifferenziata che stabilmente esprime la proteina di interesse WHIch è stato etichettato con una proteina fluorescente da un vettore virale, se un vettore virale è disponibile o può essere costruito.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Medium GlutaMAX	Life technologies	61870-036
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scietific	11360-070
Fetal bovine serum	Gemini Bio-Products	100-106
1M HEPES sterile solution, pH7.3	Quality Biological Inc.	A611-J848-06
Penicillin streptomycin solution	Fisher Scientific	15140122
NucleofectorTM 2b	Lonza	AAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes	Lonza	VCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass	Nalge Nunc International Inc	155383
2 % Gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution)	Life technologies	14025-076
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3803
Single well Lab-Tek II coverglass chambers	Nalge Nunc International Inc	155361
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers	Nalge Nunc International Inc	155383
Alexa 594	Thermo Fisher Scientific	A-10438
fMLP	Sigma -Aldrich	F3506-5MG
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm	Corning	2855-22
EZ-TAXIScan	Effector Cell Institute, Inc.	MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm)	Effector Cell Institute, Inc.	EZT-F01-5
1701RN 10ul syringe	Hamilton	80030
Femtotips II Injection tips	Eppendorf	5242956003
Femtotips II	Eppendorf	930000043
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.	Eppendorf	5188900056
DIAS software	Solltech Inc.
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens	Carl Zeiss