Modelo In Vivo para Pruebas Efecto de la hipoxia sobre la metástasis tumoral

Resumen

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Resumen

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Introducción

El sarcoma de Ewing (ES) es una neoplasia agresiva que afecta a niños y adolescentes. ¹ Los tumores se desarrollan en los tejidos blandos y huesos, comúnmente en las extremidades. Mientras que la presencia de metástasis es el factor pronóstico adverso más poderosa para los pacientes ES, los mecanismos subyacentes a su desarrollo siguen sin estar claros. ² Tumor hipoxia es uno de los pocos factores implicados en la progresión de la ES. En pacientes ES, la presencia de áreas no perfundido dentro del tejido tumoral está asociada con mal pronóstico. ³ In vitro, la hipoxia aumenta la invasividad de las células madre embrionarias y desencadena la expresión de genes pro-metastásicos. ^4-6 Sin embargo, a pesar de estas líneas de evidencia, no existe una prueba directa para ES hipoxia inducida por la progresión y diseminación. Por otra parte, los mecanismos por los que la hipoxia ejerce tales efectos son, en la actualidad, desconocidos. Por lo tanto, hemos creado un modelo in vivo para llenar la brecha entre los existentes en datos in vitro y obser clínicavaciones. Este sistema modelo permite la prueba directa de los efectos de la hipoxia en tumores que se producen en su entorno natural, el uso de imágenes de resonancia magnética (MRI) para seguir la progresión tumoral y la metástasis in vivo en combinación con ex vivo análisis patológicos y moleculares (Figura 1).

Puesto que ningún modelo transgénico establecida de ES está disponible actualmente, los estudios in vivo en las propiedades metastásicas de estos tumores dependen de inyecciones de células humanas en ratones inmunocomprometidos. Mientras que el uso de animales inmunológicamente con discapacidad puede subestimar el impacto del sistema inmune en la progresión de la enfermedad, la capacidad de utilizar células humanas aumenta traducibilidad de tales estudios. Entre los diferentes modelos de xenoinjertos, inyecciones sistémicas en vena de la cola son los más fáciles de realizar, sin embargo, que omiten los pasos iniciales de intravasación de células tumorales y se escapan del sitio primario de crecimiento. ^7-12 Por otro lado, orthoto xenoinjertos pic, que implica la inyección de células tumorales en los huesos (fémur, las costillas o los músculos), es más difícil técnicamente, pero también más biológicamente relevante para el cáncer humano. ^13-16 Sin embargo, en el pasado, la alta morbilidad asociada con el rápido crecimiento de los tumores primarios se ha hecho necesario a menudo la eutanasia de los animales antes del desarrollo de metástasis. En este estudio, hemos empleado un modelo previamente establecido de inyecciones de células en el músculo gastrocnemio, seguido de la escisión del tumor primario resultante combinada con la monitorización longitudinal de la progresión metastásica por MRI. ^17,18 Tales inyecciones en el músculo gastrocnemio en las proximidades de la tibia permiten el crecimiento del tumor en dos entornos naturales ES - músculos y huesos - y dan lugar a metástasis distantes a lugares típicamente afectadas en los seres humanos. ¹⁸ De este modo, este modelo recapitula con precisión los procesos que ocurren en pacientes metastásicos ES durante la progresión de la enfermedad.

tienda "> La localización de los tumores primarios en el miembro posterior inferior también facilita el control preciso del suministro de sangre al tejido tumoral. ligadura de la arteria femoral (FAL) es una técnica bien establecida utilizado en la investigación de la angiogénesis para bloquear el flujo de sangre a las regiones distales de la pierna e investigar la vascularización del tejido en respuesta a la isquemia. ^19,20 importante destacar que la caída inicial en el flujo sanguíneo es seguido por la apertura de los vasos colaterales y la reperfusión del tejido observado aproximadamente 3 días después de FAL. ²⁰ por lo tanto, cuando se realiza en un miembro portador de un tumor, este modelo recrea eventos hipoxia / reperfusión que se producen de forma natural en los tumores que crecen rápidamente y permite el escape de las células tumorales metastásicas debido a la restauración de la perfusión de la extremidad posterior inferior a través de los vasos colaterales de reciente apertura. ²¹ es importante destacar que este procedimiento debe realizarse cuando el tamaño del tumor es lo suficientemente pequeño para evitar la hipoxia excesivo en los tumores de control (típicamente en el portador de un tumor de ternera volUME: 150 - 250 mm ^3), asegurando diferencias significativas en los niveles de hipoxia tumoral entre el control y los grupos tratados con el FAL.

Además de la monitorización longitudinal de los efectos de la hipoxia en es la latencia y la frecuencia de metástasis, este modelo también permite la recogida de tejidos y el desarrollo de nuevas líneas de células de los tumores primarios y metástasis. Es importante destacar que, el trabajo previo estableció que las líneas celulares metástasis derivados exhiben una mayor potencial metastásico a reintroducción a los animales, lo que indica que la difusión de tumores se asocia con cambios permanentes en el fenotipo de las células tumorales, y la validación de este modo el uso de estas líneas celulares de descifrar los procesos metastásicos. ¹⁸ En conjunto, estos modelos se pueden utilizar ahora para los análisis genéticos y moleculares requeridos para la identificación de vías metastásicas hipoxia inducida.

A medida que la hipoxia es un factor pro-metastásico mejora de la malignidad de diversos tumors, nuestro modelo puede ser utilizado como una plataforma para investigar el papel de la hipoxia en otros tipos de tumores que se desarrollan de forma natural en las extremidades, tales como osteosarcoma y rabdomiosarcoma. ^21-23 Además, un enfoque similar se puede aplicar a tumores malignos que crecen en otras localizaciones anatómicas con una ruta bien definida de suministro de sangre. En última instancia, el modelo puede ser modificado y su utilidad extiende más lejos, dependiendo de las necesidades individuales de investigación.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.

1. Preparación de células para ortotópico Inyecciones

1. células madre embrionarias humanas Cultura en condiciones estándar. Use aproximadamente una placa de cultivo celular de 15 cm que no exceda el 70% de confluencia para la inyección de 5 ratones.
   NOTA: Para este estudio, las células SK-ES1 se cultivaron en medio 5A de McCoy con suero bovino fetal al 15% (FBS) en placas recubiertas de colágeno y las células TC71 se cultivaron en RPMI con 10% de FBS y 1% 4- (2-hidroxietil ) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES). Ambos medios se suplementaron con antibióticos - penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml) y Fungizone (1 mg / ml).
2. Lavar las células ES con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y trypsinize a 70% de confluencia con ácido 0,25% de tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 min.
3. Retire las células madre embrionarias a partir de la placa de cultivo celular con media, centrifugar durante 5 min a 200 xg a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células ES en 10 ml de PBS frío y luego contar el número de células.
4. Las células madre embrionarias centrífuga durante 5 minutos a 200 x g a temperatura ambiente, y luego volver a suspender las células en 10 ⁷ (TC71) por ml en PBS frío 2 x 10 ⁷ (SK-ES1) o. Mantener la suspensión celular final en el hielo en el desempeño de las inyecciones.

2. La inyección ortotópico de células ES en músculo gastrocnemio

1. Utilice 4-6 semanas de edad SCID hembra / ratones de color beige.
2. Para inyectar células madre embrionarias, coloque un lado del ratón y estabilizar su pierna izquierda entre los dedos cuarto y quinto, dejando al descubierto el lado medial de la extremidad posterior inferior.
3. Usando una aguja 28 G ½, inyectar 0,1 ml de la suspensión celular previamente preparada que contiene o bien 2 x 10 ⁶ (SK-ES1) o 10 ⁶ células (TC71) ES en el músculo gastrocnemio (Figura 2A).
   NOTA: Aunque el volumen máximo para inj intramuscularreflexiones es típicamente 0,05 ml, para este procedimiento particular, el aumento de volumen de 0,1 ml es necesaria debido al número de células de alta inyectada. Este procedimiento ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.
   1. Insertar la aguja en el músculo gemelo anterior en aproximadamente un 30 - ángulo de 45 grados en la dirección de la cresta tibial / tuberosidad.
   2. Ligeramente retirar la aguja una vez que toca la cresta tibial / tuberosidad. inyectar lentamente la solución de suspensión celular, retirando poco a poco la aguja para liberar la presión.
4. Monitorear los ratones inyectados durante las próximas 24 horas para detectar signos de angustia.
   NOTA: Los investigadores con menos experiencia en el manejo animal debe considerar los ratones para inyecciones de células tumorales que anestesia. Algunas instituciones pueden requerir anestesia por razones de seguridad.

3. Monitoreo de crecimiento del tumor primario

1. Controlar el crecimiento de los tumores primarios daily hasta que el tamaño del tumor alcanza el volumen deseado.
   NOTA: En el estudio actual, se utilizó un volumen de ternera de 250 mm ³ como punto de partida del experimento (Figura 2B). Normalmente, se tarda aproximadamente 1 - 2 semanas para que los tumores para llegar a este tamaño.
   1. Medir el tamaño de ternera al día con calibradores digitales a través de sus longitudes-medial lateral y anterior-posterior.
   2. Determinar el volumen de ternero por la fórmula (D xd ^2/6) x 3,14, en donde D es el diámetro más largo y d es el diámetro más corto de la extremidad posterior inferior portadores de tumores.
      NOTA: El tamaño de la pantorrilla normal de ratón adulto es de aproximadamente 40 - 50 mm ^3. Su volumen se incrementará debido al crecimiento del tumor y en las etapas posteriores de la pantorrilla se compone principalmente de tejido tumoral.

4. La ligadura de la arteria femoral (FAL) para inducir la hipoxia en el miembro posterior portadores del tumor

1. Preparar los instrumentos quirúrgicos necesarios para esta operación: curVed o unas pinzas finas puntas, señalaron fórceps, tijeras quirúrgicas y un soporte de aguja. Esterilizar estas herramientas antes de la cirugía utilizando un autoclave o esterilizador-grano caliente. Además, tienen hisopos de algodón finos listos para esta cirugía.
   NOTA: Se recomienda que las herramientas pueden volver a esterilizarse en las puntas, según sea necesario durante el procedimiento.
2. Inyectar agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg) por vía subcutánea (SQ). Para detectar y confirmar la hipoxia, inyectar hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 mg / kg).
   NOTA: Esta dosis equivale a 1,5 mg por ratón y se consigue mediante la inyección de 0,1 ml de solución hypoxyprobe ml / 15 mg en PBS por vía intraperitoneal (IP). El hypoxyprobe es entonces postmortem detectable en los tejidos animales por inmunohistoquímica.
3. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia que contiene 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 1 L / min.
4. Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la induction cámara. Colocar el animal en posición supina sobre un campo estéril colocada sobre una almohadilla de calentamiento en la superficie de funcionamiento. Use un cono de la nariz para conectarlo a un flujo continuo de 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100% a un caudal de 0,8 L / min.
   1. Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril para cada ojo para evitar el secado de la córnea. Para depilar completamente el área quirúrgica, aplique crema de eliminación de cabello, dejándolo sobre la piel durante no más de 10 segundos. A continuación, limpie la crema de depilación utilizando una almohadilla de etanol de preparación.
5. Extender y asegurar la extremidad posterior con un trozo de cinta de aproximadamente 45 grados con respecto a la línea media del ratón. Una vez que el miembro posterior es seguro, limpie la piel expuesta con 10% hisopo de povidona / yodo / solución, seguido de etanol, repitiendo dos veces más cada uno. Para el resto del procedimiento quirúrgico, usar un microscopio estéreo para obtener una vista ampliada de la región de las extremidades posteriores.
6. Con unas pinzas de punta y tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de la sken, aproximadamente 1 cm de longitud, desde la mitad del muslo hacia la región inguinal. El uso de hisopos de algodón fino humedecido con solución salina, cepille suavemente distancia tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo.
7. Con cuidado revelar la arteria femoral subyacente mediante disección roma a través del tejido graso subcutáneo. Estabilizar la herida y campo quirúrgico para exponer la vasculatura de media-superior del músculo aductor.
8. Con unas pinzas finas, suavemente perforar a través de la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular. El uso de un conjunto limpio de unas pinzas finas, diseccionar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la posición proximal cerca de la ingle, distal al ligamento inguinal. Tenga cuidado para evitar la perforación de la pared de la vena femoral.
9. Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda 6-0 por debajo de la arteria femoral y distal a la rama de la arteria circunfleja femoral lateral (LCFA). Ocluir la arteria femoral utilizando los nudos dobles (Figura 3).
10. Cerrar la incisión mediante suturas de polipropileno 6-0. Después de cerrar la incisión, SQ inyectar 0,5 ml de solución salina tibia para la terapia de equilibrio de líquidos. Colocar el animal en la parte superior de una almohadilla caliente envuelto en la jaula de recuperación y supervisar continuamente hasta que despierta.
11. Monitorear los animales durante los primeros 6 horas después de la cirugía e inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) cada día durante 3 días. Retirar las suturas 10 días después de la cirugía con unas tijeras estériles.

5. primaria de extirpación de tumores por amputación de pierna

NOTA: amputar la extremidad posterior inferior portadores de tumor cuando el tamaño de la pantorrilla alcanza 250 mm ³ para el grupo de control o 3 días después de FAL para el grupo hipóxica.

1. Afeitado pelo de la extremidad portador de un tumor de la tibia distal a la región pélvica con cortar el pelo mientras sostiene suavemente el animal. Inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) antes del procedimiento.
2. Coloque el ratón en un ch inducción de la anestesiaámbar que contiene 3-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de flujo de 1 L / min. Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la cámara de inducción.
3. Colocar el animal en decúbito lateral derecho en un campo estéril se coloca sobre una almohadilla de calentamiento en la superficie de trabajo. Use un cono de la nariz para conectarlo a un flujo continuo de isoflurano 1-3% en 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 0,8 L / min. Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril para cada ojo para evitar el secado de la córnea
4. Preparar el sitio quirúrgico usando 10% hisopo / solución de povidona / yodo, seguido de etanol, repetir 3 veces. Aplicar una gasa estéril (por ejemplo, paño quirúrgico) sobre el ratón para obtener un campo quirúrgico estéril.
5. Haga una incisión circunferencial femoral media de la piel, seguido de disección roma y retracción de la piel proximal. Exponer el pedículo neurovascular femoral medial en el lado medio de la pierna, y luego ligarcerca del ligamento inguinal usando 4-0 (poliglactina 910) material de sutura absorbible recubierto.
6. Realizar una transección mediados de femoral de grupos musculares con tijeras, seguido de disección roma de los tejidos blandos de la articulación coxofemoral. El uso de un cortador de hueso, realizar una osteotomía mid-femoral. El uso de un hisopo de algodón fino estéril o una esponja de gelatina absorbible, presione suavemente el lugar de la osteotomía para minimizar y prevenir el sangrado.
7. Cierre la piel que lo recubre con clips de la herida quirúrgica e inyectar 0,5 ml de solución salina tibia SQ para la terapia del balance de fluidos. Colocar el animal en la parte superior de una almohadilla caliente envuelto en la jaula de recuperación y supervisar continuamente hasta que despierta.
8. Tras la cirugía, recoger muestras de tejidos de tumores primarios de ARN, ADN o proteína aislada, congelamiento rápido en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Para el cultivo de células primarias, recolectar muestras de tejido en esta etapa, como se describe en la sección 9 a continuación. Fijar el tejido de la extremidad que queda en el 10% de formalina tamponada neutra para la histología y immunochemistratar, incluyendo la detección hypoxyprobe-1.
9. Monitorear los animales para la locomoción, el dolor y el consumo de alimentos durante las primeras 6 horas después de la cirugía, a continuación, todos los días durante 3 días. Inyectar el agente analgésico (carprofeno 5 mg / kg, SQ) al día durante 3 días. Retire las grapas para heridas 10 días después de la amputación con un extractor de clip de la herida.

6. Los ratones control de la presencia de metástasis

1. Observar los ratones diariamente y evaluar si presentan signos clínicos de la metástasis al menos dos veces a la semana.
   1. Observar a los animales para detectar la presencia de macrometástasis presentan como masas que se desarrollan en varios lugares, por lo general hombros, piernas contralateral y las mandíbulas. Con este fin, se palpa cuidadosamente cabeza, el cuello y las regiones axilares, y miembro posterior contralateral. Compruebe si hay metástasis de órganos internos a través de la distensión abdominal, junto con la RM.
   2. Verificar la presencia de metástasis pulmonares pulsando el proceso xifoides (el extremo inferior del esternón) con index dedo. ²⁴
      NOTA: Esta presión disminuye la capacidad de la respiración diafragmática. Los ratones con metástasis pulmonares avanzadas muestran signos de dificultad respiratoria que se manifiesta por la respiración laboriosa.
   3. Observar a los animales para los síntomas neurológicos, como la parálisis de las piernas y la ataxia sugiriendo metástasis en el sistema nervioso central.
   4. Monitorear los ratones al menos una vez por semana para la pérdida de peso, como una indicación del potencial de progresión de la enfermedad. pérdida de peso corporal superior a 15% del peso de pre-procedimiento se considera un criterio de valoración humana.

7. Imagen de Resonancia Magnética (MRI) para la detección de metástasis

1. Realizar la IRM para detectar metástasis en puntos de tiempo deseados. ¹⁸
   NOTA: En el presente estudio, se utilizó un espectrómetro horizontal 7-Tesla. La RM se realizó en los días 15 y 35 después de la amputación de las células SK-ES1 y el día 15 para TC71 células.
2. Coloque el ratón en un chambe inducción de la anestesiar que contiene 1-3% de isoflurano en una mezcla gaseosa de 30% de oxígeno y óxido nitroso 70%.
3. Deje el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire al animal de la cámara de inducción.
4. Transferir el ratón anestesiado en un soporte estereotáxico con la respiración y la monitorización de la temperatura con la administración continua de 1,5% de isoflurano y óxido nitroso 30%. Aplique una pomada oftálmica no medicado estéril a cada ojo para prevenir la sequedad de la córnea. La imagen del animal, ya sea en un Bruker volumen bobina del ratón 40 o 23 mm para el cuerpo entero o de imágenes del cerebro, respectivamente.
5. Utilice una de dos dimensiones, la secuencia ponderada en T2 RARE: TR = 3000 ms, TE = 24 ms, matriz = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, grosor de corte = 0,5 mm, el factor de RARE = 4 y promedios = 4. ¹⁸
6. Colocar el animal en una jaula de recuperación de calor y controlar continuamente hasta que despierta.
   NOTA: Los ratones se recuperará rápidamente desde que se utiliza un plano superficial de la anestesia.
7. Monitorear los animales durante las primeras 6 horas después de la impresión para asegurarse de que no hay efectos adversos de la anestesia.

8. La eutanasia y necropsia

1. La eutanasia a los ratones una vez que los animales se presentan con metástasis detectables por resonancia magnética y / o síntomas clínicos de la progresión de la enfermedad.
   NOTA: En el presente estudio, los ratones fueron sacrificados a los 50 días y 25 después de la amputación de animales portadores de SK-ES1 y TC71 xenoinjertos, respectivamente. En algunos casos, la eutanasia anterior era necesario debido a una alta carga metástasis.
2. La eutanasia a los ratones por exposición a CO ₂ en 1,5 L / min (CO ₂ al 10 a 30% de la cámara de eutanasia vol / min). Para asegurar la muerte del animal, realice dislocación cervical después de la exposición al CO _2.
3. Pulverizar todo el ratón con un 70% de etanol y colocarlo en la campana de flujo laminar. Recoger la sangre por punción en el corazón usando una aguja de 25 G ½ con una jeringa de 1 ml y la transferencia a una colección de sangre tuser que contiene 2 mg de EDTA.
4. Recoge los siguientes tejidos: bazo, las glándulas suprarrenales, los ovarios, los riñones, el hígado, los pulmones, el cerebro, la pierna derecha, la médula ósea de ambos húmeros y la columna vertebral, así como metástasis macroscópicas presentes en otros lugares. ^25,26
5. Fijar medio de cada tejido en 10% de formalina tamponada neutra para histología e inmunoquímica, incluyendo la detección hypoxyprobe-1. Snap congelar la otra mitad en nitrógeno líquido, a continuación, almacenar a -80 ° C para el ARN, ADN o proteína aislada. ^25,26 Para el cultivo de células primarias, recolectar muestras de tejido como se describe en la sección 9 a continuación.

9. cultivo de células primarias

1. Para llevar a cabo el cultivo primario, diseccionar los tejidos de la extremidad amputada (apartado 5 anterior) o durante la necropsia (sección 8 supra) en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
2. Preparar los medios de cultivo celular apropiado para la línea celular utilizada para inyecciones ortotópico, complementado con penicilina (200 unidades / ml),estreptomicina (200 mg / ml), Fungizone (1 mg / ml), y 0,2% micoplasma antibiótico profiláctico. Colocar 2,5 ml del medio de cultivo principal en una placa de cultivo celular de 6 cm.
3. Seleccionar las áreas de tejido tumoral viable a partir de tumores primarios o metástasis, y luego aislar dos o tres segmentos de 2-3 mm cada uno con unas tijeras estériles.
   NOTA: tejido tumoral viable se encuentra generalmente en los bordes del tumor y puede ser discriminado de necrosis por su color rosáceo o rojizo, lustre significativo y apariencia húmeda general. En contraste, el tejido necrótico se ve comúnmente en el centro del tumor y presenta como una masa color blanquecino / crema con una apariencia opaca, caseoso. ²⁷
4. La transferencia de los segmentos aislados a una placa de cultivo celular de 6 cm que contiene medio de cultivo primario descrito en el paso 9.2.
5. células de cultivo bajo condiciones estándar, como se describe en la sección 1 (NOTA) y 9.2. ^18,28 Comprobar la cultura de excrecencia celular derivada de las piezas de tejido, WHICH debe observarse dentro de unos pocos días. Una vez que las células alcanzan la confluencia, trypsinize y propagar de acuerdo con técnicas de cultivo celular estándar.
   NOTA: El cultivo de células primarias se puede utilizar posteriormente para evaluar el crecimiento y las propiedades metastásicas de las células derivadas de los tumores de control y de hipoxia, así como de sus características moleculares, como se describe anteriormente. ¹⁸

Resultados

Después de la inyección de las células ES en el músculo gastrocnemio, los tumores primarios se les permite crecer a un tamaño de ternera de 250 mm ³ (Figura 1, 2). El tiempo necesario para que los tumores para alcanzar este volumen varía típicamente de 10 - 15 días para TC71 a 20-25 días para xenoinjertos SK-ES1, respectivamente. Los tumores en un volumen de ternera de 250 mm ³ exhiben un nivel relativamente bajo de la hipoxia endógeno (ap...

Discusión

Nuestro modelo implica la comparación de la metástasis en dos grupos experimentales - un grupo de control, donde se permite a los tumores a desarrollar en el miembro posterior seguida de amputación al llegar a un volumen de ternera de 250 mm ^3, y un grupo hipoxia expuesto, en el que el tumor- teniendo los miembros posteriores se somete a FAL en el mismo volumen, seguido de la amputación 3 días más tarde. A pesar de que en estos experimentos, los tumores tratados con FAL se amputan con un ligero retraso,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4