細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

要約

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

要約

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

概要

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation^1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls^2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron^2,11,12, muscle¹³, and bone^3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials^14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.

Self-assembly including colloid lithography¹⁶ and polymer demixing¹⁷ can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes¹⁸. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements^19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography²² and a roll-to-roll nanoimprinting lithography²³ have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques.

Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)²⁴ and focused ion beam lithography²⁵ can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm²⁶. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research²⁷. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.

We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold²⁸. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

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プロトコル

EBLモールドからPDMS金型の1レプリケーション

1. シリコン型^29を製作
   1. スピンコートは、200μlのポリメチルメタクリレート（PMMA）、1分間2,500 rpmで1×1cmのシリコン（Si）基板上に溶液が薄膜を形成します。
   2. 2分間180℃でSi基板上にPMMA膜を焼きます。
   3. 300μC/ cm ²の面積の用量で集束電子ビームを用いて、PMMAフィルム上に設計されたナノパターンを書きます。
   4. 80秒間現像液中でのPMMAナノパターンを開発します。
   5. 10 kVで、0.5 mAで放出電流及び0.5オングストローム/秒の蒸着速度の出力電圧で電子ビーム蒸発器を使用して、厚さ50nmのニッケル層とPMMAのナノパターンを堆積させます。
   6. 80℃で20分間20ミリリットルリムーバーでPMMA部分を持ち上げ。
   7. 反応性イオンエッチング（RIE）Si基板にナノパターンを所望の深さのシリコンモールドを取得します。
      注：のTetRのガス混合物afluoromethane（CF _4）、150 W、400 WとRIE電力の誘導結合プラズマ（ICP）電源投入時/酸素（O _{2）（90％/} 10％）は、560ナノメートルの深さにSi基板をエッチングするために使用されます。
2. SilanizeのSiモールド
   1. 100ミリメートルPSペトリ皿にカバーガラスとSiモールドを入れて、換気フード内に配置ガラスデシケーターでそれらを転送します。
   2. カバースリップ上に10μlの1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneをドロップします。
      注意：1H、1H、2H、2H-Perfluorooctyltrichlorosilaneは皮膚腐食性および重篤な眼の損傷を引き起こす可能性があります。適切な個人保護具（PPE）を着用してください。
   3. 部分的にペトリ皿をカバーしています。
   4. シリコン金型のシラン化を完了するために、ドラフト内で5時間、真空下でデシケーターを保管してください。
3. PDMSプレポリマーを準備
   1. 使い捨ての計量ボートに10gのPDMS樹脂1.05グラムの硬化剤を秤量します。
   2. プラスチック製のスプーンを使って徹底的にPDMSプレポリマーを混ぜます。
   3. 透明な混合物が観察されるまで約20分間真空下でプラスチック製デシケーター中でPDMSプレポリマーを脱気。
4. PDMS金型を複製します
   1. 60ミリメートルペトリ皿にシラン化したSiモールドを置きます。
   2. ペトリ皿中のSiモールドにPDMSプレポリマーを注ぎます。
   3. すべての気泡が消えるまで約10分間プラスチック製デシケーターと脱ガスにペトリ皿を置きます。
   4. ホットプレートにペトリ皿を移し、4時間70℃でPDMSプレポリマーを硬化させます。
   5. 慎重にピンセットを用いて、シリコンモールドからPDMSモールドをはがし。
      注：PDMS型は最大1週間、周囲条件で保存することができます。硬化後、PDMS金型³⁰の一部の未架橋のPDMS樹脂分子と残留硬化剤があります。低分子量の分子が徐々に外に拡散し、時間の経過とともに表面に蓄積します。これは、PDMS表面³¹の地形学的および機械的特性に影響を与えます。 DIF融合は、1週間以内に重要ではありません。

大型、シングルモールドにPDMS金型の2ステッチ

1. ステップ1.4を繰り返して、複数のPDMS金型を準備します。
   注：PDMS混合物の同じ量、同じ厚さのPDMSモールドを得るたびに秤量します。
2. 光学顕微鏡下で、このようなnanogratingsなどの異方性のPDMSナノパターンの向きを決定し、マーカーペンでPDMSモールドの裏面にマークします。
   注：それはそのようなナノピラー等方性ナノトポグラフィの向きをマークする必要はありません。
3. ドラフト内でエタノールとSi基板をきれいにし、圧縮空気で乾燥させました。
4. ブレードで各PDMSモールドのパターン化されていない部分を切り落とします。
   注：ステッチ金型の周囲に配置されますPDMS金型については、他の人と接触している唯一のパターン化されていない領域がトリミングされるべきです。
5. 上のナノフェイスダウンでトリミングPDMSモールドを配置その後、ミラーSi基板の側との近くに他の金型を揃えるが、周囲の金型（複数可）には触れていません。
6. PDMS接着剤層を調製します
   1. 厚さ0.5mmの層を形成するために清浄なガラススライドインチ（2.5cm×7.5センチ）の1gをPDMSプレポリマー（1.05：10 PDMS樹脂と硬化剤の比率）を脱気キャスト。
   2. 3-5分間ホットプレート上で100℃でPDMS層焼きます。層をタッチして、層が部分的にではなく、完全に硬化されることを保証するために針を使用してください。
      注：部分的に硬化したPDMSは、未硬化PDMSプレポリマーのように流れることができないが、それは硬化PDMSと比較して粘着性です。
7. 整列PDMSモールドの裏面にPDMS層を配置し、すぐにこのアセンブリを反転し、ホットプレートに移します。
8. PDMS接着剤層とPDMSモールドの裏面との間の良好な接触を確実にし、1時間100℃でPDMS接着剤層を硬化させるために、アセンブリの上に金属ブロックを用いて、圧縮力（5キロパスカル）を適用します。
   注：慎重にアセンブリの傾きを避けるために、金属ブロックの位置を調整します。
9. 金属ブロックを削除し、Si基板からのシングル、ステッチPDMSモールドを剥がします。

PS基板上のマスターモールドの3世代

注：スライドガラス上に固定化されたステッチPDMSモールドは、PS版や作業ナノ基材を製造することが可能なPS薄膜上にマスターモールドを生成するために使用することができます。

1. PS版上のマスターモールドを生成します
   1. PS版を準備
      1. 二日間80℃の真空オーブン中でPSペレットを乾燥させます。
      2. 230℃でプレス機を予熱。
      3. 下から上へ順に、アルミニウム板、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）シートとアルミニウムスペーサーを組み立てます。
      4. 3センチメートル（L）×3センチメートル（W）×0.3センチメートル（H）の正方形の開口部を有するアルミニウムスペーサーで負荷3.5グラムのPSペレット。
         注：スペーサーがほぼ0です。1 PDMSモールドよりも厚くcmであり、従って、最終的なナノPSは、基板は、約0.1センチメートルの厚さです。
      5. アルミスペーサー上の別のPTFEシートとし、別のアルミニウム板を置きます。
      6. プレス機械にアセンブリを配置します。
      7. 30分間230℃でPSペレットを予熱。
      8. 5分間のアセンブリ上の圧縮圧力（0.1MPaに）適用します。
      9. 圧力を解放した後、アセンブリ上に圧力0.5MPaの圧縮圧力を再適用します。
      10. 1.5 MPaでの望ましい圧力まで圧力0.5MPaの増加に伴って繰り返しステップ3.1.1.9に到達します。
      11. プレス機のヒーターの電源をオフにして、1.5 MPaでの一定の圧力で70℃以下に冷却します。
      12. アセンブリを取り出し、PS版を再入力から水分を防ぐために、80℃の真空オーブン中でPS版を保存します。
   2. PS版へのナノインプリントステッチPDMSモールド
      1. アルミスペーサーでPS版を置き3インチのSiウェハ上に設定。
         注：スペーサの内側の寸法は、PS版と同じであるので、PS版は、右スペーサに収まります。
      2. 30分間250℃でホットプレート上でPS版を加熱します。
      3. 溶融したPS版上のナノパターンのフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
         注：PDMSモールドの片側は最初のPS版の表面と接触して置かれ、他方は、界面での気泡の形成を回避するために、PSの表面に接触して徐々に低下します。
         注意：ホットプレートの表面が高温になっています。ナノインプリントプロセス中thermoglovesを着用してください。
      4. ステッチPDMSモールドのスライドガラス上にアルミ板を置きます。
      5. アルミ板上に金属ブロックを使用して圧縮圧力（12.5キロパスカル）を適用し、3分間待ちます。
         注：アルミニウム板が傾いていないことを確認してください。
      6. 持ち上げて、アルミ板から金属ブロックを交換し、私25キロパスカルに圧縮圧力をncrease。
      7. 圧力とを繰り返し、ステップ3.1.2.6は50キロパスカルまで上昇しました。
         注：この手順は、PDMSモールドとPSプレートとの間に閉じ込められた空気を除去することです。
      8. 15分間、50 kPaでの一貫した圧力下240と250℃の間のホットプレートの温度を維持します。
      9. ホットプレートの電源をオフにして、全体のセットアップをクールダウン。
         注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。
      10. PS版からステッチPDMSモールドを剥がし慎重に温度が50℃以下になった後の金属ブロックを削除し、。
          注：PS基板が逆ナノパターンを有し、作業PDMS基板を製造するためにマスターモールドとして使用することができます。
2. PS薄膜上にマスターモールドを生成します
   1. PS薄膜を作製
      1. ドラフト内で10ミリリットルのトルエン中の1グラムPSを溶解させます。
         注意：トルエンは皮膚を引き起こす可能性がありますirritationおよび重篤な眼の損傷、および長期または反復暴露による臓器の障害を引き起こす可能性があります。適切なPPEを着用してください。
      2. 1分間2500 rpmでのウエハ2で上にスピンコート1ミリリットルのPS溶液を、〜1μmの厚さのPS薄膜を形成しました。
      3. 3日間、ドラフトのSiウェハ上のPSフィルムを設定することにより、膜からトルエンを蒸発させます。
      4. 一晩80℃の真空オーブン中でPS薄膜をアニールします。
   2. ナノインプリントPS薄膜上にPDMSモールド
      1. ホットプレート上で設定されているPS薄膜、上のナノトポグラフィフェースダウンで縫製PDMSモールドを置きます。
      2. PDMSモールドのガラス側の金属ブロックを使用して、PDMSモールドに12キロパスカルの圧縮圧力を適用します。
      3. 180℃にホットプレートの温度を上昇させ、15分間それを維持します。
         注意：溶融PSフィルムは、潤滑剤として機能することができます。滑り落ちるから金属ブロックを防ぐために注意を払います。
      4. ホットプレートの電源を切り全体のセットアップをクールダウン。
         注：ファンは、冷却プロセスを促進するために使用することができます。
      5. 温度が50℃以下に低下した後、金属ブロックを外し、慎重にPSフィルムからステッチPDMSモールドを剥がします。
         注：ナノPSフィルムは、作業PDMS基板を製造するためのマスター型として機能します。

細胞の挙動の4 Nanotopographical変調

注：ヒト上皮細胞は、細胞拡散のnanotopographical変調を実証するために、代表nanotopographies上で培養されます。

1. 用途に応じて、ステップ3.1または3.2のいずれかから生成されたマスターモールドからPDMS作業基板をキャストします。
2. 中空鋼アーチパンチを使用して、特定のマルチウェルプレート（ 例えば 、24ウェルプレート）の構成に合わせてディスクにナノPDMS基板をカット。
3. OウェルにPDMSディスクを配置するためにピンセットを使用して、FAマルチウェルプレート。
4. 、30分間毎に70％エタノール、次いで、UV露光を使用してPDMS基板を滅菌します。
5. 1X滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で3回PDMS基板を洗浄します。
6. コート室温で30分間、細胞外マトリックスタンパク質（ すなわち 、20 / mlのフィブロネクチン）を有するPDMS基板。
7. 5分間PDMS基板を滅菌PBSで3回、それぞれを洗い流します。
8. 10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中で、ヒト肺癌細胞A549を中断し、血球計数器を用いて細胞を数えます。
9. 一日、5％CO _2を含む加湿雰囲気中、37℃でPDMS基板と培養それらを2,000細胞/ cm ²の播種密度で細胞をプレート。
10. PBSで細胞を3回洗浄します。
11. 4時間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドの混合物中の細胞を固定し、CO ₂の重要なPOを用いて細胞を脱水電子顕微鏡観察^29を走査^するため^の int型乾燥機。
    注意：パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドは、重篤な皮膚の薬傷・眼の損傷を引き起こす可能性があります。化学フード内で動作し、適切なPPEを着用してください。

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結果

ステッチ技術は、高い忠実度でナノ基板の大面積を生成することができます。 図1aは、それぞれ、Si基板上のPS版とPS薄膜に縫い付けPDMS型から転送ナノ大きな領域を表示1B。元EBL-書かれた金型（ 図1c）と、最終的なPDMS作業基板（ 図1D）との比較は、EBL-書かれたナノパターンを忠実に作業基板に転写することがで?...

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ディスカッション

我々は、ナノパターン基板の大面積を生成するために、簡単な手頃な価格の、まだ汎用性の高い方法を提示します。忠実に非常に定義されたナノパターンを展開するには、細心の注意は、いくつかの重要なステップに支払われるべきです。第1は、複数のPDMS金型をトリミングすることです。 PDMSモールドのパターン化されていない領域を除去する必要があります。また、金型の側壁には、金型...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
JEOL field emission SEM	JEOL	JSM-7600F	EBL
E-beam evaporator	Kurt J. Lesker	Model: LAB 18 e-beam evaporator	nickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIE	Trion technology	Model: Minilock-phantom III
Press machine	PHI Hydraulic Press	Molde: SQ-230H
Spin coater	Laurell Technologies	Modle: WS-400A-6NPP-LITE
CO2 critical dryer	Tousimis	Modle: Autosamdri-815
Silicon wafer	University Wafer	1080
Aluminum plates	McMaster-carr	9057K123
Teflon sheets	McMaster-carr	8711K92
100 mm Petri dish	FALCON	353003
60 mm Petri dish	FALCON	353004
Glass coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Glass slide	Fisher Scientific	12-550-34
Disposable weighing boats	Fisher Scientific	13-735-743
Glass desiccator	Fisher Scientific	02-913-360
Plastic desiccator	Bel-Art Products	F42025-000
Hotplate	Fisher Scientific	1110049SH
Tweezer	Ted Pella, inc.	5726
Blade	Fisher Scientific	S17302
Metal blocks	McMaster-carr
Punch	Brettuns Village Leather Craft Supplies	Arch punch
Poly(methyl methacrylate)	MicroChem	495 PMMA A4
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit
Polystyrene	Dow Chemical	Styron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane	Oakwood Chemical	7142
Developer	MicroChem	MIBK/IPA at 1: 3 ratio
Remover	MicroChem	Remover PG
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Toluene	Fisher Scientific	T324-500
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco’s modified eagle medium	Sigma Aldrich	D5796
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11550
Paraformaldehyde	Electron Microsopy Science	15712-S
Glutaraldehyde	Fisher Chemical	G151-1
Fibronectin	Corning	356008
A549 cells	ATCC	ATCC CCL-185