Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Resumen

Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.

Resumen

La imagen fluorescente de los componentes celulares es una herramienta eficaz para investigar las interacciones huésped-patógeno. Los patógenos pueden afectar muchas características diferentes de las células infectadas, incluyendo ultraestructura de organelos, organización de la red del citoesqueleto, así como procesos celulares como la formación de gránulos de estrés (SG). La caracterización de cómo los patógenos subvertir procesos de acogida es una parte importante e integral del campo de la patogénesis. Mientras que los fenotipos variables pueden ser fácilmente visibles, el análisis preciso de las diferencias cualitativas y cuantitativas en las estructuras celulares inducidas por el desafío del patógeno es esencial para definir diferencias estadísticamente significativas entre muestras experimentales y de control. La formación de SG es una respuesta de estrés evolutivamente conservada que conduce a respuestas antivirales y se ha investigado durante mucho tiempo utilizando infecciones virales ¹ . La formación de SG también afecta a las cascadas de señalización y puede tener otras consecuencias aún desconocidas² . La caracterización de esta respuesta de estrés a patógenos distintos de los virus, como los patógenos bacterianos, es actualmente un área de investigación emergente ³ . Por ahora, el análisis cuantitativo y cualitativo de la formación de SG aún no se utiliza rutinariamente, incluso en los sistemas virales. Aquí describimos un método sencillo para inducir y caracterizar la formación de SG en células no infectadas y en células infectadas con un patógeno bacteriano citosólico, lo que afecta a la formación de SGs en respuesta a diversas tensiones exógenas. El análisis de la formación y composición de SG se logra utilizando un número de diferentes marcadores SG y el detector de puntos del plug-in ICY, una herramienta de análisis de imágenes de código abierto.

Introducción

La visualización de las interacciones huésped-patógeno a nivel celular es un método poderoso para obtener información sobre las estrategias patógenas y para identificar las vías celulares clave. De hecho, los patógenos pueden utilizarse como herramientas para identificar objetivos o estructuras celulares importantes, ya que los patógenos han evolucionado para subvertir los procesos celulares centrales como una estrategia para su propia supervivencia o propagación. La visualización de componentes celulares puede conseguirse mediante la expresión recombinante de proteínas huésped marcadas fluorescentemente. Aunque esto permite el análisis en tiempo real, la generación de líneas celulares con proteínas huésped marcadas específicamente es muy laboriosa y puede dar lugar a efectos secundarios indeseables. Más conveniente es la detección de factores celulares utilizando anticuerpos específicos, porque múltiples factores del huésped pueden ser analizados simultáneamente y uno no se limita a un tipo de célula particular. Un inconveniente es que sólo se puede captar una vista estática, ya que el análisis de inmunofluorescencia requiere un fijador de células huéspedion. Sin embargo, una ventaja importante de la inmunofluorescencia es que se presta fácilmente al análisis cualitativo y cuantitativo. Esto, a su vez, puede utilizarse para obtener diferencias estadísticamente significativas para proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones huésped-patógeno.

Los programas de análisis de imágenes fluorescentes son poderosas herramientas analíticas para realizar análisis 3D y 4D. Sin embargo, el alto costo del software y su mantenimiento hacen que los métodos basados ​​en software libre libre sean más atractivos. El análisis cuidadoso de la imagen usando el software del bio-análisis es valioso como substancia el análisis visual y, al asignar significados estadísticos, aumenta confianza en la exactitud de un fenotipo dado. Anteriormente, las SG se analizaron utilizando el software gratuito ImageJ, que requiere la identificación manual de cada SG ⁴ . Aquí se proporciona un protocolo para la inducción y el análisis de la formación de SG celular en el contexto de bacUtilizando el software gratuito de análisis de bioimágenes de código abierto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). El software de análisis de imágenes biológicas tiene un programa de detección de manchas integrado que es muy adecuado para el análisis de SG. Permite el ajuste fino del proceso de detección automatizado en regiones de interés especificadas (ROIs). Esto supera la necesidad de un análisis manual de SG individuales y elimina el sesgo de muestreo.

Muchas tensiones ambientales inducen la formación de SGs, que son estructuras citosólicas, no membranosas, de densidad de fase de 0,2 - 5 μm de diámetro ^5,6 . Esta respuesta celular se conserva evolutivamente en levaduras, plantas y mamíferos y ocurre cuando se inhibe la traducción global de proteínas. Implica la agregación de complejos de iniciación de traducción estancados en SGs, que se consideran lugares de retención para mRNAs translacionalmente inactivos, permitiendo la traducción selectiva de un subconjunto de mRNAs celulares.Tras la eliminación del estrés, los SG se disuelven y se reanudan las tasas globales de síntesis de proteínas. Las SG se componen de factores de iniciación de la elongación de la traducción, proteínas implicadas en el metabolismo del ARN, proteínas de unión a ARN, así como proteínas de andamio y factores implicados en la señalización de células hospedadoras ² , aunque la composición exacta puede variar dependiendo de la tensión aplicada. Los factores ambientales que inducen la formación de SG incluyen la inanición de aminoácidos, la irradiación UV, el choque térmico, el choque osmótico, el estrés del retículo endoplásmico, la hipoxia y la infección viral ^{2 , 7 , 8} . Se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo los virus inducir y también subvertir la formación de SG, mientras que todavía poco se sabe acerca de cómo otros patógenos, como patógenos bacterianos, hongos o protozoarios, afectan a esta respuesta al estrés celular ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri es un patógeno citosólico facultativo gramnegativo de los seres humanos y el agente causante de la diarrea o shigelosis severa. La shigelosis es una importante carga de salud pública y causa 28.000 muertes anuales en niños menores de 5 años ^{9 , 10} . S. flexneri infecta el epitelio del colon y se extiende célula a célula mediante el secuestro de los componentes del citoesqueleto del huésped [ ^{11 , 12]} . La infección del epitelio apoya la replicación de S. flexneri dentro del citosol, pero los macrófagos infectados mueren a través de un proceso inflamatorio de muerte celular llamado piroptosis. La infección conduce a un reclutamiento masivo de neutrófilos e inflamación severa que es acompañada por calor, estrés oxidativo y destrucción de tejidos. De este modo, mientras que las células infectadas están sujetas a tensiones internas inducidas por la infección, tales como la interrupción de Golgi, estrés genotóxico y reordenamiento citoesqueléticoS, las células infectadas también están sometidas a tensiones ambientales debidas al proceso inflamatorio.

Caracterización del efecto de la infección por S. flexneri sobre la capacidad de las células para responder a las tensiones ambientales utilizando un número de marcadores SG ha demostrado que la infección conduce a diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición SG ³ . Sin embargo, se sabe poco sobre otros patógenos bacterianos. Aquí se describe una metodología para la infección de las células huésped con el patógeno citosólico S. flexneri , el estresamiento de las células con diferentes tensiones ambientales, el etiquetado de los componentes SG y el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación y composición SG en el contexto de la infección Y células no infectadas. Este método es ampliamente aplicable a otros patógenos bacterianos. Además, el análisis de imagen de la formación de SG puede usarse para infecciones por virus u otros patógenos. Se puede utilizar para analizar SGFormación tras la infección o el efecto de la infección en la formación de SG en respuesta a tensiones exógenas.

Protocolo

1. Preparación de bacterias y células huésped

1. Transferir las tapas de cristal de 12 ó 14 mm en placas de 24 ó 12 pocillos, respectivamente, con pinzas estériles, contando un pocillo por condición experimental. Esterilizar estos por tratamiento UV en una campana de cultivo de tejidos durante 15 min.
   NOTA: Incluya pocillos de control para la estimulación bacteriana y para la inducción de SG por estrés exógeno.
2. Para una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de 12 mm, sembrar 1 x 105 células de mamífero ( por ejemplo, células HeLa) sobre cubreobjetos; Presione los cubreobjetos hacia abajo con una punta de pipeta estéril. Dejar que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO _{2 al} 5% en medio de cultivo apropiado para cada tipo de célula.
   NOTA: Las células de la placa de modo que la confluencia de las células está entre 40 - 60% al día siguiente.
   1. Para las células HeLa, incube en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con aminoácidos no esenciales (NEAA) y suero de ternera fetal (FCS) descompletado al 10%.Descomponga FCS calentando durante 30 min en un baño de agua a 56 ° C, remolino del suero una vez después de 15 min.
3. Para eliminar las bacterias, use una punta de pipeta estéril para extraer una pequeña cantidad de un stock de glicerol bacteriano (20% de glicerol) almacenado en un congelador de -80 ° C y colocarlo en una placa etiquetada. Utilice un bucle estéril para esparcir las bacterias sobre alrededor del 10% de la placa. Utilice un nuevo bucle estéril y arrástrelo a través del frotis para hacer 3 líneas paralelas, media placa de largo. Traza a través de estas líneas que cubren el resto de la placa. Incubar la placa O / N a 37 ° C.
   1. Seleccione una sola colonia bacteriana ( p. Ej., S. flexneri ) de la placa recién chapada. Evite trabajar con colonias bacterianas mayores de 1 semana.
   2. Para la cepa M90T de S. flexneri , inocular una colonia roja de una placa de agar rojo de agar de soja Tryptic de soja triturada recién listada en placa de agar rojo de Congo al 0,1% en 8 mL de caldo de soja tríptica en un tubo de 15 mL; Apriete la tapa e incube el agitación a 222 rpm O / N a 30ºC6; C.
      PRECAUCIÓN: No utilice grandes colonias blancas, ya que han perdido el plásmido de virulencia y no son infecciosas.

2. Desafío bacteriano de las células huésped

1. Prepare las bacterias para maximizar el potencial de infección.
   1. Para S. flexneri , subcultivo bacterias mediante la adición de 150 μ l de O / N de cultivo a 8 mL de triptoma de soja Agar e incubar agitando 222 rpm a 37 ° C a la fase exponencial tardía (~ 2 h) para inducir la virulencia de la expresión génica y mejorar la infección.
      1. Cuando el cultivo tiene una densidad óptica entre 0,6 y 0,9 (medida a 600 nm), transfiera 1 ml de cultivo en un tubo de 1,5 ml. Las bacterias de Pellet durante 2 min a 8.000 xg y resuspender en medio de infección (DMEM con NEAA, sin FCS) a OD ₆₀₀ = 1. Así, si la OD ₆₀₀ es de 0,85, resuspender en 850 μl.
         NOTA: Para S. flexneri, a OD ₆₀₀ = 1, habrá 8 x 10 ⁸ bacterias por ml cuandoCultivadas en 8 ml de medio. Una multiplicidad de infección (MOI) de 20 es apropiada. Para otros patógenos, el número de bacterias por ml a una DO ₆₀₀ y la MOI apropiada deben determinarse empíricamente.
   2. Para potenciar las interacciones bacteriano-huésped, cubra las bacterias con Poly-L-Lysine (PLL).
      NOTA: El tratamiento con PLL de S. flexneri no tuvo efecto sobre la dinámica SG. Otros patógenos necesitan ser evaluados por su facilidad para el tratamiento PLL.
      1. Para cubrir las bacterias con PLL, centrifugar 1 ml de cultivo bacteriano durante 2 min a 8.000 xg y luego resuspender el sedimento en 10 μg / ml de PLL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una DO ₆₀₀ = 1.
      2. Añadir la solución bacteriana a un plato pequeño, como un pocillo dentro de una placa de 12 pocillos, e incubar a RT (~ 20 ° C) durante 10 min con agitación suave en un agitador de placas.
      3. Las bacterias de pellets durante 2 min a 8.000 xg, eliminar el exceso de PLL. Resuspender el sedimento en 1 ml de PBS yD repetir este paso de lavado dos veces. Después del lavado final, resuspender en medio de infección a DO _ { ₆₀₀ } = 1.
         NOTA: Aquí, el medio de infección para S. flexneri es medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS.
2. Preparar las células para el desafío bacteriano.
   1. Eliminar el medio de las células HeLa de mamíferos utilizando una bomba de succión. Añadir 500 μl de medio de células RT HeLa para lavar las células, remover el medio con una bomba de succión y reemplazar con 500 μl de medio de infección apropiado para RT ( por ejemplo , medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS).
   2. NOTA: Para todos los pasos de lavado, trabaje rápidamente y procese sólo hasta 4 cubreobjetos a la vez para evitar el secado de las células.
3. Desafío preparado células HeLa con bacterias para infectar 20 - 50% de las células.
   NOTA: El tiempo apropiado y MOI necesitan ser determinados para cada especie bacteriana. Generalmente, un buen inicio es de 30 min a 37° C con una MOI de 10.
   1. Para S. flexneri, desafiar las células celulares HeLa utilizando uno de los dos métodos (paso 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
      1. Girar bacterias tratadas sin PLL (20 μL de DO ₆₀₀ = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) sobre células durante 10 min a 13000 x g.
      2. Añadir bacterias recubiertas de PLL (15 μL de DO ₆₀₀ = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) durante 15 minutos a RT para permitir que las bacterias se depositen en las células.
   2. Permita que la infección ocurra colocando las células con bacterias asentadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 30 min.
      NOTA: Durante períodos de tiempo cortos, sincronice la infección por S. flexneri colocando las placas en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min en lugar de en la incubadora de cultivo de tejidos.
4. Parar la infección lavando las células.
   1. Para lavar las células y eliminar el exceso de bacterias, retire el medio con una bomba de succión, agregue 1 mLMedio de cultivo HeLa recién calentado (37 ° C) (DMEM, FCS al 10%, NEAA). Remueva el medio, remueva y reemplace con un medio fresco. Repetir dos veces y dejar medio fresco en las células.
      1. Para S. flexneri , u otras bacterias intracelulares, después de la infección de las células HeLa y los lavados, reemplazar el medio con medio de cultivo tisular estándar que contiene 50 μg / ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares e impedir la invasión celular.
         NOTA: No agregue antibióticos en el medio para bacterias extracelulares.
5. Incubar las bacterias con las células durante la cantidad deseada de tiempo en una incubadora de cultivo de tejidos.
   NOTA: Para S. flexneri , la infección puede ser de hasta 6 h dependiendo del tipo de célula. Para las células HeLa, dejar que la infección continúe durante 1,5 - 2 h antes de añadir estrés exógenos para inducir la formación de SG. En el caso de las infecciones por Caco-2, en las que la Shigella se extiende célula a célula, se infecta durante 30 min a 6 h antes de añadir estrés exógeno. CeLls puede fijarse en este punto sin añadir estrés exógeno para evaluar la formación de SGs como resultado de la infección bacteriana (en ese caso, proceda a la sección 4).

3. La inducción de la formación de gránulos de estrés por la adición de estrógenos exógenos

1. Eliminar el medio de las células HeLa infectadas y no infectadas usando una bomba de succión, reemplazar el medio con 500 μl de medio apropiado con o sin el factor de estrés e incubar.
   NOTA: Las condiciones que inducen el estrés incluyen las siguientes (ver abajo). Para tratamientos adicionales véase Kedersha et al . ¹³ .
   1. Para el tratamiento de choque térmico, utilice un medio regular que contenga HEPES 20 mM y coloque la placa en un baño de agua a 44 ° C durante 30 min.
   2. Para el tratamiento con clotrimazol (induce estrés mitocondrial), use medio regular sin FCS con 20 μM de clotrimazol e incube en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de 20 mM de clotrimazol en dimetilsulfóxido (DMSO) a -20ºC durante hasta 4 meses. Use el vehículo DMSO para las células de control.
   3. Para el tratamiento con arsenito (induce estrés oxidativo), use medio regular con arsenito 0,5 μM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de arsenito de 0,5 mM a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
      PRECAUCIÓN: El clotrimazol y el arsenito son nocivos y peligrosos para el medio ambiente y deben ser eliminados de manera adecuada.
   4. Para el tratamiento con Des-Metil Des-Amino (DMDA) -pateamina (inhibe la iniciación de la traducción eucariótica), use medio regular con DMPA-pateamina de 50 - 200 nM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Guarde DMDA-pateamina a -80 ° C. Guarde los reactivos como pequeñas alícuotas para evitar la descongelación por congelación.

4. Análisis de fijación e inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés

NOTA: Procese el control yExperimental cubreobjetos al mismo tiempo para evitar la tinción de las diferencias que pueden afectar el análisis de imagen en pasos posteriores. Las muestras de control incluyen ninguna infección con y sin tratamiento de inducción de SG, y muestras infectadas con y sin tratamiento de inducción de SG.

1. Retire completamente el medio con una bomba de succión y fije las muestras añadiendo 0,5 mL RT paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Incubar durante 30 minutos a TA.
   PRECAUCIÓN: La PFA es perjudicial para el manipulador y el entorno. Tomar la medida adecuada para proteger el manipulador y eliminar con residuos químicos.
   NOTA: Alternativamente, fijar durante 15 minutos y luego reemplazar con metanol pre-enfriado a -20 ° C durante 10 minutos para retener más localización citoplasmática de los marcadores SG ¹³ .
2. Retire la PFA con una pipeta y deseche el líquido en un recipiente de residuos apropiado. Lavar la cubreobjetos con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 25 mM, pH 7,3, NaCl 15 mM). Incubar el cubreobjetos durante 2 min con agitación suaveEn un agitador de placas durante el lavado.
3. Quitar TBS completamente con una bomba de succión y añadir 500 μ l 0,3% Triton-X100 en TBS durante 10 minutos para permeabilizar las células.
4. Quitar la solución permeabilizante con una bomba de succión. Reemplazar con 1 mL de TBS, agitar suavemente la placa, eliminar TBS por succión y agregar 1 mL de solución de bloqueo (5% de FCS en TBS) durante 1 h a RT.
5. Preparar la solución de anticuerpo primario (dilución 1: 300) en FCS al 5% en TBS. Calcule 50 μl por cubreobjetos de 12 mm y haga suficiente para todos los cubreobjetos en un lote.
   NOTA: Los anticuerpos primarios comunes que se usan son G3BP1, eIF3b y TIA1.
6. Coloque 50 μL de la mezcla de anticuerpos primarios sobre una película de parafina de plástico (parafilm) firmemente adherida sobre el banco o cámara.
   NOTA: En la Tabla de Materiales se proporciona una lista de marcadores SGs canónicos, pero la composición de los SG puede depender de la tensión aplicada. Otros marcadores SG se enumeran en Kedersha et al. ¹³ Los resultados esperados para una serie de marcadores SG para la infección por S. flexneri se enumeran en la Tabla 1 .
7. Recoja el cubreobjetos con pinzas, limpie el borde del cubreobjetos sobre el tejido, libere brevemente las pinzas para eliminar el exceso de líquido y coloque suavemente boca abajo sobre la gota. Incubar cubreobjetos durante 1,5 h a RT o durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda.
   NOTA: Para preparar una cámara húmeda, coloque los tejidos humedecidos a lo largo de los bordes de una cámara firmemente cerrada forrada con parafilm plástico.
8. Transferir cada cubreobjetos con pinzas en un pozo de una nueva placa de 24 pocillos llena de 1 mL de TBS; Incubar con agitación suave en un agitador de placas durante 5 min. Aspirar el TBS en cada pocillo usando una bomba de succión, reemplazar con 1 mL de TBS y colocar de nuevo en el agitador de placas durante 5 min. Repita el lavado una vez más.
   NOTA: Reutilice el parafilm quitando el exceso de líquido con un pañuelo de papel y lavando la superficie con agua. Asegúrese de que la película de parafina esté completamente seca antes de usinG para la siguiente etapa de tinción.
9. Preparar la solución de anticuerpos secundarios en TBS (dilución 1: 500-1: 2000). Para teñir el núcleo y las bacterias, añadir 2 μ g / mL DAPI a la mezcla. Para teñir actina, añada fluorescentes phalloidin. Pipetear 50 μL de mezcla de anticuerpos secundarios sobre la película de parafina de plástico.
   NOTA: Se recomienda el uso de anticuerpos secundarios de burro de absorción cruzada altamente purificados para estudios de co-localización de diferentes marcadores SG cuando se usa G3BP1 (anticuerpo de cabra). Elija anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente con espectros no superpuestos. EIF3b mancha claramente el citoplasma de las células y por lo tanto es un buen marcador para delinear las células. La tinción de actina ayuda además a delinear las células en los sitios de contacto de célula a célula y las áreas de entrada bacteriana.
10. Recoja el cubreobjetos con pinzas, dab el borde de la cubreobjetos en el tejido, liberando brevemente las pinzas, para eliminar el exceso de líquido. Coloque suavemente el cubreobjeto boca abajo sobre la gota e incube los cubreobjetosEn la oscuridad durante 1 h a TA.
11. Utilice pinzas para colocar el cubreobjetos de nuevo en las placas de 24 pocillos llenos de 1 ml de PBS fresco. Asegúrese de que el cubreobjetos esté completamente cubierto por el PBS. Lave las células 3 veces con agitación suave durante 5 minutos cada una.
    NOTA: Mantenga la placa durante los lavados bajo una cubierta para protegerla de la luz ya que los fluoróforos del anticuerpo secundario son sensibles a la luz.
12. Sumergir brevemente el cubreobjetos en agua desionizada para quitar la sal, secar con un paño seco del borde sobre un tejido y montar el cubreobjetos sobre 5 μl de medio de montaje de fluorescencia en un portaobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos antes de hacer imágenes usando esmalte de uñas. Mantenga los portaobjetos a 4 ° C para el corto plazo (semana) oa -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo (mes).
    NOTA: Evite las burbujas de aire al sellar, ya que esto dañará la calidad de la imagen.

5. Imágenes de fluorescencia

NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración.

1. Adquirir imágenes usando un microscopio confocal usando una lente de inmersión de aceite 40 o 63X. Seleccione los canales fluorescentes deseados para la adquisición de imágenes. Cuando utilice varios canales fluorescentes, seleccione el modo de adquisición secuencial.
   NOTA: Comience con las muestras experimentales en las que se han inducido las SG con mayor fuerza para evitar la sobreexposición en las muestras posteriores. Asegúrese de no tener sobreexpuestos SGs a lo largo de toda la profundidad de la celda.
   1. Establezca un tamaño de bit de 12 o superior dentro de la configuración del microscopio para asegurar la precisión del análisis de la imagen.
   2. Establezca las pilas de imagen para cubrir toda la profundidad de la celda. Compruebe en los diferentes canales y para diferentes marcadores SG para asegurarse de que todo el rango está incluido. Establezca el comienzo de la pila en la base de las celdas y la parte superior de las pilas a la altura en la parte superior de las celdas donde no se observan más marcadores SG.
   3. Adquiera la pila. Mantenga la altura de la pila igual para todas las imágenes.
      NOTA: NoCambiar la configuración de adquisición entre el control y muestras experimentales que se utilizarán para la comparación posterior.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Aquí se describe el análisis de SG en pilas colapsadas usando freeware ICY. El análisis de imágenes de reconstrucciones 3D también se puede hacer usando otro software especializado. La detección de SG puede realizarse a través de un flujo de trabajo totalmente automatizado establecido para este protocolo (disponible en http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Para usar este protocolo, los núcleos necesitan ser manchados con una mancha de ADN para que el software encuentre el centro de cada célula, y los bordes de la célula necesitan ser marcados por un marcador citoplasmático (como eIF3b) o tinción de actina para el software Para identificar los límites celulares. El flujo de trabajo automático se puede utilizar para validar manualmente los resultados derivados o directamente para el análisis cuando los límites de las células se detectan con alta confianza, lo que moDependen de la densidad de las células y del marcador utilizado para detectar los límites celulares.

1. Con ImageJ o Fiji, contraiga las pilas de imágenes (Imagen> Pilas> Proyección Z) y guárdelas como archivos .tiff.
   NOTA: cree una nueva carpeta para cada imagen, ya que el software de análisis de imágenes vinculará sus resultados al sitio de la imagen original.
2. Cargue una imagen control y experimental de .tiff en la plataforma de análisis de imágenes (Archivo> Abrir). Vaya a la ventana Secuencia. Desplácese hacia abajo en la "Tabla de búsqueda" a los parámetros del canal.
3. Desactive todos los canales haciendo clic en la casilla de verificación de todas las pestañas del canal. Haga clic en el canal 0 y luego seleccione el color preferido haciendo clic en la barra de colores de arriba. Aumentar la intensidad del canal según sea necesario para ver todas las estructuras haciendo clic y moviendo la línea en el campo de intensidad. Repita esto para todos los canales.
   NOTA: Desactive los canales que no son necesarios para una tarea determinada para minimizar el sesgo en el análisis de la muestra.
4. VolutaY dentro de la pestaña Canvas, realice un zoom de aproximadamente 10 celdas por campo ajustando la pestaña de zoom.
5. Utilice las herramientas de funciones de polígono (en la barra superior) para delinear los límites celulares de las celdas de la imagen. Use la mancha de actina o un marcador citosólico para delinear los límites celulares ( por ejemplo, eIF3b).
   1. Haga clic en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI". Comience a delinear haciendo clic en la celda y luego extender la línea haciendo anclas a través de clics repetidos alrededor del límite de la celda. Para finalizar un ROI, haga clic de nuevo en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI".
      NOTA: Identifique las subpoblaciones de las células delimitadas infectadas. La muestra consiste en una mezcla de células infectadas y no infectadas. Para identificar bacterias, utilice la tinción DAPI o bacterias fluorescentes (como las bacterias que expresan GFP). Aumentar la intensidad para asegurar que todas las bacterias se ven.
   2. Para nombrar un ROI, vaya a la ventana ROI a la derecha y cliCk en la celda de interés en la imagen. Esto resaltará el ROI correspondiente en la pestaña ROI. Haga doble clic en el nombre del ROI y modifique el nombre ( por ejemplo, celda infectada # 1).
      NOTA: Si una imagen debe usarse para analizar células infectadas y no infectadas, es más fácil guardar la imagen en dos carpetas separadas y delinear las células infectadas y no infectadas por separado, generando dos hojas de cálculo diferentes, lo que facilitará el análisis. luego.
6. Abra la aplicación del detector de puntos en la pestaña "Detección y seguimiento" (barra superior). Dentro de la ficha Entrada, se seleccionará la imagen actual. No cambie nada. En la ficha Preprocesamiento, seleccione el canal que desea analizar.
   NOTA: Sólo se puede analizar un canal en un momento dado. Se puede seleccionar aquí un análisis por lotes si se utiliza la secuencia de análisis completamente automatizada cuyos parámetros se han comprobado para dar resultados satisfactorios.
   1. En la pestaña Detector, seleccione "DeTect las manchas brillantes sobre el fondo oscuro. "Luego seleccione la escala apropiada y la sensibilidad.Por favor, pruebe diferentes configuraciones y la detección cruzada de puntos en el control y las muestras experimentales.
      NOTA: Para una imagen con una resolución de 2,048 x 2,048 y un tamaño de píxel de 0,12 μm ² , un umbral de nivel 2 con una sensibilidad de 25 a 100 es generalmente apropiado, pero cada marcador de SG tiene que ser probado empíricamente. Configure la detección de manchas para que en la muestra de control no tratada no se detecten manchas, mientras que en la muestra experimental con SGs se cuentan todas las SGs pequeñas y grandes.
   2. En la pestaña ROI, seleccione el ROI de secuencia sugerido. En la ficha Filtrado, seleccione Sin filtrado. En la ficha Salida, elija la salida adecuada.
      NOTA: Elegir Activar archivo específico es útil para guardar diferentes condiciones de detección o canales diferentes. Seleccionar para exportar la imagen binaria y la imagen original con ROIs y detección es helPful para el análisis de control de calidad.
   3. Seleccione "Eliminar puntos anteriores mostrados como ROI". Elija la carpeta para guardar el archivo haciendo clic en el botón "ningún archivo seleccionado". En la ficha Pantalla, seleccione las opciones deseadas. Haga clic en "Iniciar detección".
      NOTA: Se creará una carpeta con el nombre y la ubicación elegida que contiene las opciones de imágenes exportadas. Estas imágenes se sobrescribirán para cada nueva condición probada. Para guardar las imágenes, cambie el nombre de la carpeta para que se cree una nueva carpeta o transfiera las imágenes de la carpeta de guardar a una nueva carpeta. Para el control de calidad de las imágenes, es útil seleccionar la marca de detección de la pantalla, el número de detección de ROI y el número de ROI y el nombre.
7. Consolide y guarde los datos para los diferentes parámetros usando la hoja de cálculo generada para cada imagen o condición probada.
   NOTA: Los parámetros a analizar incluyen el número de SG por ROI, las áreas de superficie SG y el SG maxIntensidad media y mínima.
8. Transferir los datos y analizar utilizando un programa de análisis capaz de analizar, representar gráficamente y determinar la significación estadística.

Resultados

Para explicar y demostrar el protocolo descrito en este manuscrito, se caracterizó la imagen de clotrimazole inducida SGs en células HeLa infectadas o no con el patógeno citosólico S. flexneri . Un esquema del procedimiento se presenta en la Figura 1 , e incluye virulenta y avirulenta S. flexneri rayado en placas de Congo Rojo, preparación de bacterias, infección, adición de estrés ambiental, fijación de muestras y tinción, imagen...

Discusión

El protocolo descrito aquí describe la inducción, localización y análisis de SGs en células no infectadas y células infectadas con el patógeno citosólico S. flexneri en presencia o ausencia de estrés exógeno. Usando software de imagen libre, los protocolos permiten el análisis cualitativo y cuantitativo preciso de la formación de SG para identificar y tratar estadísticamente las diferencias en fenotipos dados.

Hay varios pasos críticos dentro del protocolo para la infe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly L lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture
DMEM	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal calf serum	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-essential amino acids	Life Technologies	11140	1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12-mm glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis