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要約

この原稿は、マウス 5/6th腎部分切除術 (PNx) ポール結紮とを実行する詳細な 2 段階手術を提供します。手術後 4 週間 PNx マウスは sham 群と比較して腎機能障害、貧血、心臓肥大、心筋線維化を開発し、心収縮および拡張機能の低下します。

要約

慢性腎臓病 (CKD) 心血管疾患イベントと死亡率の大きな危険因子であり「尿毒症性心筋症」と呼ばれる臨床表現型に徐々 に成長します。5/6th腎部分切除術 (PNx) を付けポール結紮手術後 4 週間で尿毒症性心筋症を開発、実験 CKD マウス モデルをご紹介します。この PNx モデルは、2 段階の手術で行われました。ステップ 1 つの外科で左腎両極を結紮しました。ステップ 1 手術後 7 日間に実行されたステップ 2 の手術で右の腎臓が削除されました。偽手術同じ手術を行ったが、ことがなくポール左腎結紮または右の腎臓の除去。手術プロシージャは、他の方法と比較して、簡単に少ない時間がかかる。ただし、残存機能腎腫瘤が腎動脈結紮として簡単に制御されていません。手術後 4 週間 PNx マウスは sham 群と比較して腎機能障害、貧血、心臓肥大、心筋線維化を開発し、心収縮および拡張機能の低下します。

概要

として知られている慢性腎不全 CKD は最終的に永久的な腎障害に開発時間をかけて腎機能の進歩的な損失です。CKD は、末期腎臓病 (ESRD) に腎疾病初期段階から心血管疾患イベントと死亡率の大きな危険因子であり「尿毒症性心筋症」1,と呼ばれる臨床表現型に徐々 に成長する2,3。CKD や腎不全の患者で尿毒症心筋症は主に左心室 (LV) 圧や左心室の肥大 (LVH)、左心室の拡張、左心室の収縮機能障害4 につながる量の過負荷による心血管系の異常に関連付けられて ,5,6。心臓線維症は左室拡張不全の結果心臓のコンプライアンスが減少尿毒症心筋症の別の一般的な病理学的プロセスです。重度の心筋線維化は、心臓症状7なしであっても心臓突然死につながります。

5/6th PNx は腎不全、尿毒症性心筋症と高血圧を含む動物の研究のための一般的に使用される CKD の動物モデル。PNx は 5/6 腎実質のアブレーションによって実現されます。ラット モデル最初開発された、2 つの最も一般的なプロトコルは、外科的切除または梗塞を採用します。ラット PNx モデルは血圧、心臓肥大、拡張機能の障害の実質的な標高と尿毒症性心筋症を研究する非常に便利なモデルです。その後、マウス PNx モデル、ラットのモデルと同様の手法で運営は幅広い可用性とマウスにおける遺伝子操作の容易さのために開発されました。

それは両方の臨床的および実験的尿毒症心筋症8,9の定数機能を全身酸化ストレスには定評。さらに、酸化ストレスは尿毒症症候群10に貢献し、尿毒症性心筋症11,12,13に見られる心臓の異常の病因に重要な役割を果たしています。これまで、我々 が実証齧歯類 5/6th PNx モデルが原因で尿毒症心筋症14,15,16,の生理学的、形態学的、生化学的機能17です。 ここで説明するマウス PNx モデル、PNx 運営マウス開発重要な酸化ストレス、Na/K ATPase PNx を介した実験的尿毒症心筋症で非常に重要である機能をシグナリングによって少なくとも部分的に仲介されます。Na/K ATPase の信号の減衰だけでなく酸化増幅を低減、また PNx を介した実験的尿毒症心筋症18の表現型の変化を改善します。

プロトコル

すべての動物の世話と実験はケアと実験動物の使用のためマーシャル大学動物介護施設と国立衛生研究所 (NIH) ガイドに従って使用委員会 (IACUC) によって承認されました。男性の c57bl/6 マウス (10-12 週齢) は、指定された客室には 12 時間の明暗サイクルの下で浄化された空気を供給するケージにおける病原体の無料動物実験施設で収容されました。食料や水が指定された 広告自由

。

1 です。 手術準備

注: 手術器具および材料手術操作に固有ではない別のソースから取得されます。器具その他のソースからの材料は、同じ目的のため使用できます。手術器具のリストのための 材料表 を参照してください

。
    1. オペレーティングの届く範囲は、次の場所の 手術の準備 のテーブル: 温暖化パッド、ハロゲン ランプ、酸素タンクとイソフルラン タンク、イソフルラン気化器、バリカン、脱毛クリーム、スケール、滅菌セット、滅菌手術リネン、コットン綿棒、70% アルコール、polyhydroxydine (1% ヨウ素溶液)、0.9 %nacl 水溶液、1 mL 注射器や針 (30 G)、3-0 と 4-0 絹糸、ブプレノルフィン、ペニシリン抗生物質軟膏を営業と潤滑剤眼軟膏
      2. 。
    2. ケージをきれいにし、手術後の住宅のマウスの寝具の下熱パッドを配置します
      3. 。

2。ステップ 1 手術: ポール結紮の左腎臓

注: 手術中に滅菌状態を維持します。オートクレーブの手術器具滅菌パッドをカバーします。手術中に交差汚染を防ぐために 1 つ以上の手術を手に手術器具の 1 つ以上のセットを保存します。楽器は、再度使用する場合は、複数の手術の場合 betadine ソリューション、70% エタノール、機器で消毒して 5 分駆除動作領域の 70% エタノール germinator ガラス ビーズ滅菌器で滅菌し、.ガウンを着用、マスク (カバー鼻と口)、キャップ (頭をカバー) と滅菌手袋のペア。各手術後に手袋を変更します

。
  1. 洗浄手を消毒し、滅菌手術用手袋を着用します。ヘッド キャップとマスクを着用します
    2. 。
  2. は、70% アルコールでテーブルを消毒します。麻酔下で目の乾燥を防ぐためには、マウスの両方の目に潤滑剤の眼軟膏を適用します
    3. 。
  3. イソフルラン気化器システムの誘導の商工会議所にマウスを置き、100% 酸素 (0.8 - 1.2 L/分) で 1-2 分間で 2.5% イソフルランの混合物と麻酔
    注: 麻酔の効果は痛み反射眼瞼反射の不在によってだけでなく、尻尾をつまんでをまぶたに触れることによって誘発の有無によって決定されます
    4. 。
  4. 手術中に感染症や痛みを防ぐためにペニシリン (40,000 単位/kg 体重、IM)、ブプレノルフィン (0.02 mg/kg 体重、SC) を挿入します
    5. 。
  5. は、維持およびプロシージャの間に約 37 ° C の体温を監視する直腸温度計 (当初は 42 ° C で設定) 地球温暖化パッドにマウスを置きます。鼻の円錐形にマウスの鼻を置き、0.8 1.2 の混合物と換気 % 100% 酸素とイソフルラン (0.8-1.2 L/分) 手術中にします
    6. 。
  6. は、右側にマウスを配置します。髪クリッパーで外科領域の毛を剃る、脱毛クリームを取り外します。70% エタノールが続く polyhydroxydine (1% ヨウ素溶液) を使用してサイトを消毒します。外科領域のオートクレーブ外科麻布を配置します
    7. 。
  7. ~1.0 cm 腰椎切開をし、筋と左腎のメスと鉗子 ( 図 1 a) を使用して公開する筋膜分離します
    8. 。
  8. は小さな鈍い鉗子が付いて腎周囲脂肪を引いて非常にゆっくり左腎臓を引き出します。副腎腺を妨げるために、プロセスで副腎の上側に移動腎臓鉗子で
    9. 。
  9. 使用して鈍い鉗子、軽く結合組織と血管を入力終了腎臓の中間の幽門に向かって腎臓の優れた終わりから副腎をいじめます。識別して、尿管を隔離します
    。 注: 結合組織に埋め込まれた光の下ではっきりと見える腎臓の下半分の周りに尿管ある
    10. 。
  10. 優しく結合組織をつかむし、尿管は結紮しないことを確保するため腎臓組織から分離します
    11. 。
  11. 極をする前に腎臓の優れたおよび下 1/3 部分を識別する滅菌定規を使用します。マウス腎臓は通常 1.25 〜 1.5 cm 長すぎます周りは
  12. Ligate 3-0 絹糸縫合文字列と適切な力を使用して、幽門の中央に向かって優れた部分から約 0.4 cm と同様に、0.4 cm ( 図 1 a、点在幽門に向かって劣る部分から行).
  13. 後 ( 図 1 b) 両方の棒を縛ること、出血がないかどうかを確認する 2 分の観測時間を許可します
    。 注: プロセスでそれは副腎、腎動脈尿管結紮を避けるために非常に重要です。左尿管を結紮、マウスはステップ 2 の手術で右腎摘出後死にます。結紮力は、腎出血を引き起こすことがなく、極に血流を制限できます。結紮後 1-2 分以内極の極への血流の制限により変色している
    14. 。
  14. は、左の腎臓を元の位置に押し戻します。筋肉と 4-0 および 3-0 絹糸文字列で皮膚をそれぞれ閉じます。良い回復の消毒手術領域に抗生物質軟膏を適用します
    15. 。
  15. 結紮後、家のケージに個別にマウス熱ランプとケージを寝具エリアに近い 37 ° C (温度計で監視)、個々 のケージに動物を配置する前に、.
    注: マウスを監視は、それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで
    16. 。
  16. は、回復中に水や食料を簡単にアクセスを許可します。ペニシリン、ブプレノルフィンの感染と痛みを防ぐために最初 3 日術後 12 時間間隔を管理します
    。 注: マウスは 2-3 日以内手術のトラウマから回復する必要があります、通常の食事、飲酒や移動に戻ってする必要があります。この時、個別に完全復旧のためのマウスを家します。次を監視する必要があります: 飲む、食べる、歩くパターン、ぎこちない足取り、背を丸めて背中、眼や鼻の放電および積極的な行動。それは、発作、昏睡、不治の感染、歩くことが困難、歩行、食べたり飲んだりすることができませんの損失と 15% 以上の損失の兆候を示している場合は、マウスを安楽死させる操作前重量
    17. 。

3。ステップ 2 手術: 右腎臓の除去

  1. 7 日後、右の腎臓を公開は、前述の手順の左側にマウスを置きを除いて 2.10 に 2.1 で左腎臓の
    2. 。
  2. リネンで右腎を配置し、鈍い鉗子と周囲の脂肪や結合組織をクリアします
    3. 。
  3. 腎動脈と静脈を識別し、2 つの合字 (3-0 シルク) 各 1 つの緩い結び目と血管の周り。結合組織や副腎を優しくいじめる鈍い鉗子を使用して腎臓の中間の幽門に向かって腎臓の優れた終わりから腺。優しく下の端から尿管を変位し、すべての出血を引き起こすことがなく血管一緒に (3-0 シルク).
  4. は、船に沿って 2 つの緩い合字ノットを移動します。腹部大動脈側に向かって 1 つの腎臓側に向かって他のものです
    5. 。
  5. 最初の二重結び目 (腹部大動脈側) に向かって合字結び目を提携; 固体の結び目は右腎の色が変わります。ダブルの結び目 (腎臓側) に向かって合字の結び目を縛る。血管結紮ノットを切断することがなく 2 つの結び目の間をカットするようにこれらの 2 つのダブル ノット間十分なスペースを残しています
    6. 。
  6. は、2 つの結び目の間腎血管をカットし、右腎臓摘出します。可能な腎血管の出血を確認してください
    7. 。
  7. 滅菌ガーゼを使用して右の腎臓を乾燥しそれの重量を量る
  8. 4-0 絹糸文字列と筋切開を終了し、3-0 絹糸文字列で皮膚切開を閉じます
    9. 。 ケージ (ステップ 2.15) 回復する、少なくとも 24 時間のための食糧および水に簡単にアクセスの上熱ランプと
  9. の家のきれいな孤独なケージに個別にマウス。ペニシリン、ブプレノルフィンの感染と痛みを防ぐために 3 日間の 12 時間間隔を管理します
    。 注: マウス 2-3 日以内手術のトラウマから回復する必要があります、通常の食事、飲酒や移動に戻ってする必要があります
    10. 。
  10. 手術後 3 日間、その後実験の期間の日の 1 日 2 回マウスを監視します。2.16 の手順に従って手術後のモニタリングおよび処置のプロシージャに従います
    11. 。

4。偽手術

  1. 偽手術腎臓、左腎臓のポール結紮なく組織の創傷閉鎖は郭清または右の腎臓の除去の露出を含む、同じ手術の手順を実行します
。

5 実験的尿毒症心筋評価

  1. 犠牲、前日は経胸壁心エコー検査を実行し、キャプチャ画像 18.
    。 注: ここでは、経胸壁心エコー検査がテーブルおよび直腸温度計処理マウスを行った。超音波画像は、イメージング システムに接続して動作周波数トランスデューサー 18 38 MHz を使用してキャプチャされました。述べたように 18 を計算した相対的壁厚 (RWT)、心筋の性能指数 (MPI) と左心室 (lvmi).
  2. 犠牲の時に、体重を測定します。HCT 遠心分離機メーカーごとでヘマトクリット (HCT) を測定する ' の指示。ヘパリン コーティング管の 4 ° c 卓上冷却遠心分離機で 1,500 × g で 10 分間の血液サンプルを遠心分離を用いた血漿検体を準備します。シスタチン C、クレアチニンと BUN の次のメーカーのキットを使用しての測定 ' の指示。重複して計測を実行します
    3. 。
  3. 実験の最後に、麻酔のケタミン (90 mg/kg、IP) と xylaxine (10 mg/kg、IP) マウスと開胸によって犠牲に。胸から削除した後心重量を測定します。 18 , 19 の前に説明したように心臓 (LV)、腎臓ホモジネート、タイプ 1 コラーゲン (COL 1)、c Src および蛋白質のカルボニルのリン酸化の定量を準備します
    4. 。

結果

データは、これが変更ことを示して5/6thポール結紮 PNx モデル尿毒症性心筋症を調査する簡単で効果的なモデルです。手術の後 4 週間、モデルを提示この PNx 障害腎機能、貧血、心臓肥大、心筋線維化と心収縮および拡張機能の低下します。結果は以下のとおり。

4 週間後の手術では、PNx マウスは人間?...

ディスカッション

ラット 5/6th PNx モデルは CKD を研究に広く使用されています。多く腎サイズが小さいのでマウスで、古典的な動脈結紮とポール切除可能性の高い死亡率と予期しない出血・血液喪失マウス モデルで非常に挑戦しています。

出血・血液喪失を克服するためにポールの結紮とマウス PNx モデルを採用しました。この PNx モデル改良された生存率と再現性の高い時間はか...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、NIH R15 1R15DK106666-01A1 (劉) して (アオカビ シャピロ) に NIH RO1 HL071556 によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Iris Scissors, 11.5 cm, StraightWorld Precision Instruments501758
WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm TipsWorld Precision Instruments504506
Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, TitaniumWorld Precision Instruments555227F
Iris Forceps, 10cm, Straight, SerratedWorld Precision Instruments15914
Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm TipsWorld Precision Instruments501976
Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless SteelNet233512www.Net32.com
Dr. Slick Iris Scissors; 3.5"Avid Max220-1-965-IrisScsrs-P www.Avid Max.com
Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved4mdmedicalV95-306www.4mdmedical.com
5" Hemostat clap, curved jawPJTool4355www.pjtool.com
sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4"Medical Device depot64-3430www.medicaldevicedepot.com
Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5"PilgtimmedicalFA710-50www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 miceHilltop Lab Animals Inc.
 Mouse Handling Table and rectal thermometerVisualsonics
MicroScan transducer Vevo 1100MS400
Vevo 1100 Imaging System FUJIFILM VisualSonics Inc.
Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit Crystal Chem. Inc.
Mouse BUN ELISA kit MyBioSource Inc 

参考文献

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