JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Лазерная microirradiation является полезным инструментом для исследования ДНК ремонта в живых клетках. Методологический подход к использования УФ лазеров чтобы побудить различные поражения ДНК показано. Мы оптимизировали метод для местных microirradiation, который поддерживает нормальное клеточного цикла; Таким образом облученных клеток перейти через митоз.

Аннотация

Местные microirradiation с лазерами представляет собой полезный инструмент для исследования процессов, связанных с ДНК ремонт, в живых клетках. Здесь мы описываем методологический подход к анализу белка кинетики в ДНК повреждения по времени или белок белковых взаимодействий на локально microirradiated хроматина. Мы также показывают, как распознавать отдельные фазы клеточного цикла с использованием сотовой системы Fucci для изучения кинетики клеток цикл зависимых белков в повреждения ДНК. Методологические описания использования двух УФ лазеров (355 Нм и 405 нм) чтобы побудить различные типы повреждений ДНК также представил. Только клетки microirradiated лазерного диода 405 нм обычно перешла через митоз и были лишены Циклобутан пиримидина димеров (ДСП). Мы также показывают, как microirradiated клетки может устанавливаться на данный момент для выполнения immunodetection эндогенных протеинов интереса. Для ремонта исследования ДНК, мы дополнительно описывают использование биофизических методов, включая FRAP (флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание) и FLIM (Imaging микроскопии флуоресцирования жизни) в клетках с спонтанно возникающих очагов повреждения ДНК. Мы также показывают применение FLIM-Лада (флуоресценции резонанс передачи энергии) в экспериментальных исследованиях белок белковых взаимодействий.

Введение

Повреждение ДНК приводит к появлению поражения ДНК, состоящий из Циклобутан пиримидина димеров (ДСП), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine и одно нить или двухнитевые разрывы1,2. Гамма-лучи являются формой ионизирующего излучения с высокой энергией и высокой пенетрантностью, таким образом этот источник излучения широко используется в радиотерапии3. С другой стороны экспериментально индуцированного повреждения ДНК, вызванные УФ лазеров имитирует естественный воздействие ультрафиолетовым светом. UVA microirradiation, как микроскопические метод, представляет собой экспериментальный инструмент для изучения повреждения ДНК в отдельных живых клеток. Microirradiation был использован в первый раз 40 лет тому назад для того, чтобы выявить организации хромосома регионов4,5. Эта техника очень сильно зависит от функциональных свойств конфокальные микроскопы или технические пределы современного наноскопия. Чтобы вызвать повреждения ДНК, клетки могут presensitized 5' Бромдезоксиуридин (BrdU) или Hoechst 33342 до УФ облучения. Bártová и др. 6 описано presensitization шаг, и недавно мы оптимизировали этот метод microirradiation для того, чтобы избежать смерти клетки или apoptosis. Например использование 405 нм УФ лазер (без presensitization Hoechst 33342) приводит к индукции 53BP1-позитивных двухнитевые разрывы (DSBs) за счет Циклобутан пиримидина димеров (ДСП). С другой стороны, presensitization шаги в сочетании с УФ microirradiation вызвать очень высокий уровень ДСП и DSBs одновременно7,8. Эта методология трудно применять к изучению один путь восстановления ДНК.

С microirradiation можно анализировать набор белков, кинетики и взаимодействие на повреждения ДНК в живых клетках. Пример этого метода была опубликована Luijsterburg соавт. 9 для гетерохроматин белка 1β и мы недавно показали в первый раз, что плюрипотентности факторов Oct4 и белок, который связывается с тела Cajal, проекта, набираются для УФ индуцированной ДНК поражений6,10. Кинетика белка на этих повреждений ДНК также могут быть изучены с помощью FRAP (флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание)11,12,13 или ладу (флуоресценции резонанс передачи энергии) методы14 ,15. Эти методы имеют потенциал, чтобы выявить простой диффузии белков в повреждения ДНК или белок белковых взаимодействий. Полезным инструментом для дополнительных характеристик белков является FLIM (Imaging микроскопии флуоресцирования жизни) или его комбинации с ЛАДАМИ технологии (Лада-FLIM)16. Эти методы позволяют исследование процессов в живых клеток, которые являются стабильно или временно выражения протеина интереса, помеченный флуоресцентных молекул17. Здесь приведен пример времени (τ) экспоненциальный распад белка GFP-тегами p53 и взаимодействия партнера, 53BP1, mCherry меткой, играет важную роль в ДНК повреждения ответ18,19 . Параметр τ, время жизни флюрохром, предоставляемый FLIM расчеты, специфичных для данного флуоресценции красителя, его способности привязки и ее клеточной среды. Таким образом этот метод может показать нам различия между белка субпопуляций, их способности привязки и их функциональные свойства после, например, повреждение ДНК.

Здесь, наброски методологических подходов микроскопии передовых методов, которая используется в нашей лаборатории для изучения набора время специфических белков, кинетика, диффузии и белок белковых взаимодействий на сайте microirradiated хроматина представлены. Предоставляются пошаговые методологии для индукции местного поражения ДНК в живых клетках и описание методологии полезно для изучения событий, связанных с ДНК ущерб, на локально индуцированных поражения ДНК, вызванные УФ лазеров.

протокол

1. выращивания клеточных линий

  1. линии клетки HeLa производные
    Примечание: использование НеЬа клетки рак шейки матки: либо клетки HeLa, стабильно выражая гистона H2B отмеченных GFP или HeLa-Fucci клеток, выражая ЗП-Cdt1 в G1 и ранние фазы S и GFP-geminin S/G2-М этапах ( рис. 1).
    1. Для выращивания всех линий клетки HeLa производные, используйте Дульбекко ' s изменение орел ' s среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным 10% и соответствующие антибиотики при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO 2. Заменить средний 2 - 3 раза в неделю.
    2. Удалить питательной среды и промойте клетки с помощью 1 x PBS для ликвидации всех следов сыворотка, содержащая ингибитор трипсина. Выполните этот шаг в биологической капюшон при комнатной температуре.
    3. Добавить 1 мл раствора подогретую трипсина-ЭДТА для покрытия слоя клеток и держать клетки на 37 ° C. Trypsinize клетки, до тех пор, пока слой клетки рассеивается (обычно 3-5 мин).
    4. Добавить 3 мл подогретую полный рост средних инактивирует трипсина-ЭДТА и разгонять среды, нежно закупорить несколько раз.
      Примечание: Эта процедура должны быть выполнены в капюшоне биологической защиты оператора от загрязнений и поддержания оптимального ячейку условия культивирования.
    5. Количество клеток с помощью автоматического клеток счетчика или Bürker камеры. Разбавления суспензии клеток в 1 5 × 10 кл/мл и 5 мл накапайте в новое блюдо. Инкубировать клетки при 37 ° C и 5% CO 2.
  2. Культивирование мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), D3 клеточная линия
    1. mESCs культуры на ячейку культуры блюда с 0,2% желатина и mESC обслуживанию среднего покрытием. Инкубировать клетки при 37 ° C и 5% CO 2.
      Примечание: Рекомендуется подготовка среды культивирования/техническое обслуживание mESCs в 50 мл аликвоты и хранить при температуре 2-8 ° C до 2 недель. MESC носитель содержит 75 мл ES клеток FBS, 5 мл пенициллин G и стрептомицин, 5 мл Non-Essential аминокислоты (10 мм) (конечная концентрация 0,1 мм), 50 мкл мыши лейкемии ингибитора фактора (mLIF; 100 мкг/мл) (конечная концентрация 10 нг/мл), 430 мкл MTG (1- Thioglycerol; 1: 100 разрежения в среде DMEM) (конечная концентрация 100 мкм) и высокие глюкоза DMEM среднего до 500 мл.
    2. Аспирационная среды культивирования mESC от культуры блюдо и промойте клетки один раз с ПБС.
    3. Добавить 0,5 мл трипсина-ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C только до тех пор, пока клетки начинают оторваться от блюдо. Затем, деактивируют трипсина, омыв клетки с 2 мл среды культивирования mESC дополнены 15% плода бычьим сывороточным.
    4. Использовать пипетку выбить оставшиеся ячейки от культуры блюдо.
      Примечание: Важно для получения единичных клеток, потому что ячейки сгустки содействовать дифференциации клеток.
    5. Сплит клетки 1:10 на gelatinized блюда с mESC обслуживания среднего.
      Примечание: Если плотность клеток mESC слишком мало, они не растут хорошо; Если плотность является слишком высокой, дифференциация пропагандируется.
    6. Убедитесь, что mESCs поддерживаются в недифференцированном состоянии, выполнив проход mESC каждый второй день путем разделения клетки от одной чашке Петри на четыре новых блюд. Осмотрите mESC колоний с инвертированным микроскопом под 100 X 200 X увеличение или и, если есть доказательства спонтанное МЧС дифференцировки клеток, выполняют западных помарках оценить Oct4 белка истощения.
      Примечание: С пассированый оптимальное ячейки, спонтанной дифференциация mESCs в пробирке может быть уменьшена.

2. Transfection клетки

  1. семян клетки 48 ч до экспериментов на сетке микроскопию блюда (диаметр 35 мм) для того чтобы найти microirradiated клетки согласно их координат на Петри блюдо.
    Примечание: Это пример, в котором microirradiation это первый экспериментальный шаг и иммуноокрашивания является вторым ( рис. 2A).
    1. Для посева, использовать в концентрации 5 × 10 4 клеток/мл для линии клетки HeLa, полученных (или 1 × 10 4 клеток/мл для D3 mES клетки). Использовать до полного среднего 2 мл за блюдо. В ходе выращивания и microirradiation, сохранить клетки в термостат или выращивания камере при 37 ° C и 5% CO 2.
    2. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматическое клеток.
      Примечание: Не используйте более высокую концентрацию клеток. Особенно в случае плотно упакованных колоний D3 mESCs, плотность высокая клеток предотвращает идентификации локально microirradiated клеток после иммуноокрашивания.
  2. Подготовить плазмида ДНК и трансфекции реагент выбора следующим образом. Приготовляют раствор A с помощью мкг 2-3 отдельных плазмидной ДНК (см. Таблицу материалов для деталей) и 150 мкл ПБС. Подготовьте Раствор B с помощью 3,5 мкл Реагента трансфекции в 150 мкл 1 × PBS. Убедитесь, что каждое решение хорошо перемешивается тщательно закупорить.
    Примечание: Оптимальное соотношение ДНК и трансфекции Реагент должен эмпирически определяется для каждой линии клеток и индивидуальных плазмиды.
  3. На 24 ч до экспериментальные наблюдения временно transfected живых клеток, сочетать решение A и B решение без vortexing. Инкубируйте комбинированные решения при комнатной температуре 15-20 мин. В духе прикапывают однородно разогнать это полный трансфекции смесь (300 мкл, как описано в пункте 2.2) на слой клеток, растущих в микроскопии блюдо.
  4. Инкубировать клетки при 37 ° C и 5% CO 2 для 4-6 ч, затем заменить трансфекции смесь свежих средних. Культивировать клетки в стандартных условиях.
    Примечание: При использовании лазера 405 нм, не presensitize клетки с любой реагент, но при использовании 355 Нм лазер, выполняют клетки presensitization с 10 мкм 5-бром-2 ' - deoxy - уридина (BrdU) 7 , 8 . Presensitization время зависит от типа ячейки и длина клеточного цикла. Клетки HeLa добавьте BrdU 16-20 ч до местных microirradiation. В случае mESCs, добавить BrdU 6-8 ч до microirradiation.

3. Индукции местных повреждений ДНК и конфокальная микроскопия

  1. блюдо на микроскопа и записать позицию выделенных ячеек на блюдо; координаты ячейки будут необходимы для дальнейшего анализа ( рисунок 2A a-c).
  2. Найти transfected ячейки на площади помечены цифру или букву ( рисунок 2A d-f, стрелки в Ad показать расположение ячейки увеличивается в панели Ae и Af). Получить изображение ячеек с помощью микроскопии яркие поля и получить изображение флуоресценции для того, чтобы определить позицию ячейки и площади помечены ( рис. 2A).
  3. Для захвата изображений до облучения, используйте белый свет лазера (WLL) (470-670 нм с шагом 1-Нм), подключенных к Конфокальный микроскоп (или другой доступны лазер, подключенных к confOcal Микроскоп).
  4. Использовать следующие параметры: 512 × 512 пикселей, пикселей размер 64 Нм, 400 Гц, двунаправленный режим (сканирование в двух направлениях), линия среднее значение 8, zoom 8 x до 12 x.
    Примечание: Средняя линия представляет заданное количество сканов; той же линии сканируется несколько раз, прежде чем переходить к следующей строке. Повторить сканирование всех линий производят последнего кадра изображения.
  5. Для наблюдения изображения и приобретения, использовать цель нефти 63 × с числовой апертуры 1.4 и последовательно получить флуоресценции изображения. Устранить помехи между двумя флуорохромов, используя последовательный режим сканирования соответствующего программного обеспечения.
    Примечание: Все Микроскоп программное обеспечение позволяет параметр так называемый режим последовательного сканирования. Оператор может выбрать, следует ли приобрести флуорохромов ' информацию одновременно (например, в красно зелено голубой флуоресценцией) или, как уже упоминалось здесь, индивидуально (последовательно), флюрохром, флюрохром. Принимать во внимание общую информацию, что максимальная возбуждения/выбросов для GFP-395/509 Нм и максимального возбуждения/выбросов для mCherry-587/610 Нм (см. флуорохромов используется здесь в Рисунок 2B). Основываясь на этой информации, выберите подходящие возбуждения и выбросов фильтры для желаемого флуорохромов. Фильтр выбора и проверки процедур должны быть оптимизированы для каждого Конфокальный микроскоп.
  6. Для индукционного новообразований ДНК, использование 64 линия сканирования режим, выключите WLL (в ' приобретение ' режим), включите внешний источник УФ (на " УФ лазер " кнопка), задать региона интерес (ROI) (в ' приобретения ' режим) и установить 355 Нм Лазерная 100% мощности или, альтернативно, используйте источник лазера 405 нм.
    Примечание: Как правило, мощность лазера регулируется соответствующим лазерных регулировочную кнопку в режиме приобретения изображения.
  7. Для местных microirradiation, использовать лазеры, которые излучают в ближайшем спектр UVA. Для microirradiation ROI в ядре и для захвата изображения установите фон к нулю в режиме приобретения изображения для регулирования интенсивности лазерного за пределами ROI; Если ячейка облученных должным образом, сигнал GFP-гистона H2B исчезнет, и, например, mCherry тегами PCNA белка будут набраны в ДНК повреждения сразу после облучения ( Рисунок 2B и видео 1 ).
    Примечание: Повреждения ДНК, индуцированной в ROI одного конфокальный Секция также появляется в трехмерной проекции (3D) (см. 3D вращение и x-y, x-z, y-z прогнозы в рисунке 2 c и видео 2). Для описания полного технических параметров для 355 Нм и 405-нм лазеры см. Stixová и др. 7
  8. облученных после ROI, отключить внешний источник УФ, выключить ROI, включите WLL, измените строку, сканирование до 8 и найти другую ячейку для облучения. Для выбора ROI, используйте соответствующую кнопку программного обеспечения ' режим приобретения изображений с.
    Примечание: mCherry-PCNA имеет пик максимального накопления повреждений ДНК между 2 и 20 мин ( рис. 2B). Чтобы проверить результат на экзогенные белка уровнях, продолжите иммунофлюоресценции, окрашивание сразу же после местных microirradiation. Выберите интервал времени облучения согласно интерес.
  9. Убедитесь, что накопление экзогенных белки могут быть обнаружены в большинстве microirradiated клеток. Для этой проверки используйте критерии в следующих шагах.
    1. Проверьте, что нет никаких гиперэкспрессия экзогенных белка в временно transfected клеток. В качестве возможного решения, выберите ячейки с слабым проявлением флуоресцентного белка (например, mCherry-PCNA или mCherry-53BP1).
    2. Оценить Фототоксичность WLL экспозиции используется для захвата изображений в.
      Примечание: Для Фототоксичность тестирования, разоблачить transfected клеток к длительной лазерной microirradiation и убедитесь, что клетки приступить к митоз, как показано на рис 3А -B. В качестве возможного решения, уменьшить сканирования время и количество конфокальный срезов в клетку, оптимизировать 3D сканирования, выбор оптимального осевой шаг (0,3 мкм рекомендуется) и установите лазерный ' s мощность ее минимум. Кроме того фототоксичности могут быть устранены с помощью Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic кислота, водорастворимый аналог витамина е) растворяют в среде культивирования. Для экспериментов, связанных с ДНК ущерб, не рекомендуется использовать Trolox из-за его защитный эффект против УФ излучения.
    3. В случае облучения с 355 Нм лазер, проверьте достаточным включение BrdU, используя соответствующий BrdU обнаружения антител от BrdU Включение комплекта (см. Таблицу материалы). Так как BrdU включена в ДНК в S-фазе клеточного цикла, большинство клеток должны перейти через S-фазы во время presensitization. В качестве возможного решения, рассмотреть длину клеточного цикла, который является типом ячейки конкретных.
    4. Анализ ДНК ремонт протеинов интереса ли способность распознавать поражения ДНК в конкретных клеточного цикла спинок. Возможное решение: Чтобы убедиться, что набор выбранных белков для поражения ДНК ограничен к фазам конкретных клеточного цикла (G1/S/G2), используйте клетки HeLa-Fucci. Эти клетки Экспресс ЗП-Cdt1 на ранних этапах S и G1 и GFP-тегами geminin в S/G2-М клеточный цикл фазы 22 ( рис. 1).
    5. , Чтобы избежать апоптоза, смерть клетки, выберите соответствующий лазерный источник и лазерная установка мощности 23. Держите в разуме что облученных клеток должны приступить к митоз ( Рисунок 3А -B, видео 3).
      Примечание: Нежелательные apoptosis могут быть обнаружены, позитивность, caspase 3 или Ламин B расщепления Annexin V. На морфологическом уровне, мобильный отряд и формирование apoptotic тела будет виден.

4. Иммунофлюоресценции окрашивания

  1. промыть слоя клеток (растет в Микроскоп блюда) кратко с 1 × PBS и после полоскания, исправить клеток с использованием 4% формальдегида для 10 мин (на линии клеток HeLa производные) или 20 min (для D3 ES клеток) при комнатной температуре. Промойте блюдо с 1 × PBS.
    Осторожностью: Формальдегид вызывает повреждения серьезные глаз, может вызвать аллергическую реакцию на коже и также является потенциальным канцерогеном; Таким образом, все экспериментальные шаги с формальдегидом должна быть выполнена в вытяжка.
    Примечание: Чтобы избежать ненужных отбеливания флуоресценции сигналов, хранить на блюдо в темной камере во время инкубации время, необходимое для окрашивания иммунофлюоресценции.
  2. Разрушения клеток с 0.1% тритон X-100 растворяется в H 2 O 8 минут и затем инкубации клеток для 12 мин с 1 × PBS, содержащие сапонин 0,1% и 0,1% тритон X-100. После инкубации, вымыть клетки в 1 × PBS два раза за 15 мин
  3. Инкубировать клетки с 1% BSA в 1 × PBS для 60 мин блокировать неспецифических привязки выбранного антител. Мыть после инкубации клеток в 1 × PBS на 15 мин.
    4. Ослабленный первичный гуморальный
  4. развести в пропорции 1: 100 (или 1: 200) (этот шаг должен быть optimized для отдельных антител) в 1% BSA в 1 × PBS, используя 25 мкл этого решения за блюдо и охватывают клетки с coverslip. Проинкубируйте клетки с раствор, содержащий основное антитело в увлажненные камеру на ночь на 4 ° C.
  5. На следующий день вымыть клетки в 1 × PBS два раза за 5 мин.
  6. Разбавленных вторичных антител в соотношении 1: 100 (или 1: 200) в 1% BSA в 1 × PBS, используя 100 мкл этого решения за блюдо и охватывают клетки с coverslip. Проинкубируйте клетки с раствор, содержащий вторичное антитело для 60 мин. После инкубации, вымыть клетки в 1 × PBS три раза за 5 мин
  7. Горы coverslip с каплей монтажа средних и уплотнение coverslip лак или клей для предотвращения высыхания и движение во время микроскопические наблюдения. Хранить блюдо в темноте при 4 ° C.

5. Образ жизни (FLIM) микроскопии флуоресцирования

  1. начала FLIM программного обеспечения. Открытые " Комплект приложений " программного обеспечения и настройте его " FLIM " режим. Убедитесь, что работает в импульсном режиме В.Л.Л.
    Примечание: Оператор должен переключить аппаратную кнопку достичь импульсный режим.
  2. Блюдо, содержащий окрашенных клеток (витражи в разделе 4) на микроскопа в ту же ориентацию как во время местных microirradiation и найти облученных клеток согласно сетки на Петри блюдо. Выполнение захвата изображений с Конфокальный микроскоп.
    Примечание: Используйте следующие параметры: 1024 × 1024 пикселей, 400 Гц, двунаправленный режим, 16 линий, увеличение 8 x до 12 x.
  3. Перед началом измерения FLIM, выполнить предварительный тест, чтобы показать запись в реальном времени экспоненциального распада, нажав на " установки FLIM " и " приобретения " и нажав " запустить FLIM тест ". Оптимизируйте параметры FLIM для образца путем оценки двух основных параметров следующим образом.
    1. Оптимизировать, частота повторения WLL с длиной волны возбуждения настроены со временем жизни образца (см. Примечание ниже). В программном обеспечении конфокального микроскопа, регулировать интенсивность лазера с помощью соответствующей кнопки, который обычно называют " Лазерная регулировка параметра " в ' видеосъемка ' меню. Затем рассчитайте распада кривой (или гистограммы, показаны всем пунктам Фотон), с использованием программного обеспечения FLIM (см. Рисунок 4A -B).
      Примечание: Используйте WLL в импульсном режиме для возбуждения. Программное обеспечение должны быть оборудованы импульса выбора для WLL, который позволяет отбор частота повторения (80, 40, 20 или 10 МГц). Длина волны возбуждения в случае флуоресценции доноров, GFP, является 488 нм. Кривая распада записывается с помощью рабочей области программное обеспечение FLIM. Параметр (τ D, τ DA) показывает экспоненциального распада раз (например, флюрохром жизни); амплитуда флюрохром распада (A) представляет параметр (см. примеры данных FLIM GFP-тегами p53 и меткой mCherry 53BP1 в рисунке 4A -B).
    2. Проверить количество второгодников, используя средство приобретения программного обеспечения (выберите повторение скорость режим). Выберите ярких точек в выборке; кривая для ярких пикселя должна быть ниже 10% от общей интенсивности флуоресценции.
  4. Нажмите на " измерения " и нажмите " запустить FLIM ".

6. доноров жизни с помощью FLIM сценарий и эффективность вычисления беспокойтесь

  1. ладу-FLIM программное обеспечение и открыть ' доноров ' workspace.
  2. Выберите " анализ " / " Imaging " вкладка в меню и запустить скрипт FLIM, нажав " начать ". Для оптимального ладу-FLIM параметров используйте известных взаимодействуя белками партнеров.
    Примечание: Лад-FLIM эффективности для известных взаимодействия партнеров GFP-p53 и mCherry-53BP1 был (34.1 ± 2.3) % ( рис. 4 c).
  3. Использовать только доноров выбросов канал (канал 1 или 2) и нажмите " вычислить быстро FLIM ".
    Примечание: Изображения и графика будут оба обновлены.
  4. В ладу-FLIM программного обеспечения, задайте шкала интенсивности (0 - 4000 графов) и шкала жизни (0 - 5 НС) вручную в программном обеспечении. С этим подходом, визуализировать клетки интереса и задать измерение ладу-FLIM.
    Примечание: Этот параметр устраняет различия в интенсивности флуоресценции между отдельными ячейками в популяции клеток.
  5. В форме распада, выберите установку модели.
    Примечание: Мы рекомендуем n экспоненциальный reconvolution и подбор параметра модель " n ". Прилегание имеет следующие критерии: установлены кривой оверлеи кривой также распад и χ 2 - значение равно 1 ( рис. 4B).
  6. Выберите " порог " / " порог использования " и задать порог для 75. Начало " первоначальный Fit ".
    Примечание: SPT64 программное обеспечение вычисляет среднее доноров жизни в отсутствие ладу (" амплитуда взвешенное среднее время жизни ", τ Av.Amp)

7. ЛАДУ эффективность с помощью скрипта FLIM-лад

  1. выберите рабочее пространство, доноров/акцептора и затем открыть " анализ " | " Imaging " | " образ жизни лад ".
  2. Выберите только доноров в качестве активного канала и отрегулировать биннинга пикселей в зависимости от числа фотонов/пиксель. Затем запустите режим программного обеспечения, называемый " расчет FastFLIM ". Если фотон номер/пиксел в изображении является низкой, увеличить биннинга пикселей до 4 баллов.
  3. Задать интенсивность 0 - 200 графов и жизни до 0 - 5 н.
  4. Активировать " порог использования " и введите порог 75.
  5. Задать установку модели " Multi-Exp. доноров ", введите параметр модель " n ", введите τ Av.Amp (шаг 6.6) как τ D и активировать " первоначальный Fit ".
  6. Задать параметры Bkgr Dec, Shift МАФ и Bkgr МАФ в значения констант, удалив знак.
    Примечание: Установите большинство параметров будет оставаться неизменной как можно больше. Этот подход уменьшает статистических колебаний. В этом случае, не нажимайте " первоначальный подходят " снова. Далее описания перечисленных параметров: IRF = инструмент ответ функция, BkgrDec = фон от экспоненциальной fit, ShiftIRF = МАФ переход от экспоненциальной reconvolution подходят, BkgrIRF = МАФ фон от экспоненциальной reconvolution подходят. Все три параметра рассчитываются и может быть исправлено с помощью программного обеспечения для дальнейшего анализа.
  7. Пресс " вычислить FRETŔ ладу изображение (диаграмме в области изображения FLIM) и ладу эффективности гистограммы рассчитаны, и строится гистограмма ладу расстояние ( рис. 4 c). По завершении анализа изображений нажмите " сохранить результат ".
    Примечание: В ходе экспериментов ладу, это необходимо учитывать, что флуоресцентные белки exhibit реверсивные переходы между флуоресцентные (яркий) и не флуоресцентный (темно) государствами. Эта характеристика называется " мигает ", и эффективность ладу, пострадавших от этого явления (объяснение этого эффекта была представлена Vogerl et al. 24).

8. Анализ FRAP

  1. место дисh на микроскопа, найти transfected клеток, выражая дневно тегами протеина интереса и выполнить получение изображения с помощью микроскопии яркие поля с лампой стандартной микроскопа (см. Рисунок 2Aa-b) и режимы микроскопии флуоресцирования.
    1. Для захвата изображений, используйте белый свет лазера (WLL) подключены к конфокального микроскопа (или лазером выбора, согласно выбранного флюрохром). Используйте следующие параметры: 512 × 512 пикселей, 1000 Гц, двунаправленный режим, средняя линия 1, zoom 8 x до 12 x.
    2. Получить по крайней мере 15 prebleaching изображения (при мощности лазера ~ 10%) и определить области интереса (ROI) в меню изображения приобретение.
  2. Для Фотообесцвечивание экспериментов, использование Аргонового лазера (488 нм). Задайте следующие параметры: рама 512 × 512 пикселей, 1000 Гц, двунаправленный режим, zoom 8 x 10 x.
    Примечание: Флуорохромов, включая GFP, mCherry и ППП может быть взволнован Аргонового лазера, работающих на 488 нм или 514 Нм.
  3. Режим FRAP программного обеспечения микроскопа выбора. Во время Фотообесцвечивание, установите Аргонового лазера ' s мощность до максимума, используя кнопку регулировки лазера. Выполнение загрузки изображений на 0.256 s интервалы, мощность лазера 10%.
    Примечание: Для postbleaching шаги, используйте режим приобретения стандартного образа конфокального микроскопа выбора.
    1. Монитор флуоресценции время восстановления после Фотообесцвечивание (до 45-50 сек после процедуры отбеливания).
      Примечание: Как показано на рисунке 4 d, время восстановления после Фотообесцвечивание для 53BP1 mCherry тегами отличается в спонтанной поражения ДНК и УФ облучения индуцированной очагов. mCherry-53BP1 на UVA поражения восстановлены быстро по сравнению с mCherry-53BP1 скоплений в спонтанно возникающих ДНК ремонт очагов; Посмотреть Рисунок 4 d и Foltankova и др. 25
  4. Экспорт в электронную таблицу данных от Микроскоп программное обеспечение (или по выбору) и выполнять статистический анализ.

Результаты

Используя передовые confocal микроскопии, мы наблюдали накопление меткой mCherry 53BP1 и mCherry-PCNA белков в повреждения ДНК. Анализы на местных microirradiation живых клеток. Признать характере ядерного распространения связанных с ДНК ремонт белков в этапах отдельных клеточного цикла, м?...

Обсуждение

Микроскопия методы представляют собой основные инструменты в исследовательских лабораториях. Здесь краткое описание методов, используемых для изучения белков вербовки и представил кинетики в повреждения ДНК. Мы особенно отметили наш экспериментальный опыт в области местных microirradiati...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана агентства по субсидированию Чешской Республики, проект P302-12-G157. Эксперименты были также поддержаны Чешский-Норвежский исследовательской программы CZ09, которая находится под контролем норвежских фондов и Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики (номер гранта: 7F14369).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell cultivation
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
HeLa -Fucci cellshttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM high glucoseSigma-AldrichD6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-Thioglycerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Penicillin-Streptomycin SolutionBioseraXC-A4122/100
Trypsin - EDTABioseraXC-T1717/100dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishesSigma-AldrichP7866cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166microscopic dish
0.2% GelatineSigma-AldrichG1890-100Gdilute in destille water and autoclaved
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell transfection
GFP-p53 plasmidAddgene12091
mCherry-PCNA plasmidgenerous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmidAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020–2.0
10 × PBSThermo Fisher ScientificAM9625for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridineSigma-Aldrich11296736001
NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8Leica Microsystems
White-light laserLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.laser power 80 mW
405-nm laserLeica Microsystemslaser power 50 mW
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunofluorescence staining
CoverslipVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydeAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponin from quillaja barkSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1Abcamab21083primary antibody
AlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040secondary antibody
VectashieldVector Laboratories LtdH-1000mounting medium

Ссылки

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129FLIMPCNA53BP1p53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены