쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

요약

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

초록

이 프로토콜 텔레비전 현미경 고립된 대뇌 저항 동맥 (와 다른 배), 혈관 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 의 사용을 설명 하 고 레이저 도플러 Flowmetry (LDF를 사용 하 여 조직 관류를 평가 하기 위한 기술에 설명 합니다. )와 microvessel 밀도 붙일 활용 Griffonia simplicifolia (GS1) lectin를 표시. 현재 공부에 대 한 과거 발생 압력에서 vivo에서 에서 저항 동맥을 분리 방법과 parenchymal 세포 영향의 부재에서 vivo에서 연구와 분자에서 얻은 정보 사이의 중요 한 링크를 제공 전체 동물 수준에서 통합 응답에 제한 된 통찰력을 제공 하는 reductionist 접근. 선택적으로 붙일 레이블 GS1 lectin arterioles, 모세 혈관을 식별 하는 LDF 및 기술 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 지식을 확장할 수 사관 수 있도록 실용적인 솔루션을 제공 합니다. 이 종이 혈관 생리학과 병리학 일반 실험 모델 쥐에서의 기본적인 지식을 얻기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 하 고 전문의 다양 한 제공할 수 있는 "디자이너" 쥐 종자를 유전자 조작 중요 한 혈관 고기에 특정 한 유전자의 영향으로 중요 한 통찰력. 녹아웃 마우스 모델에서 개발 된 과학 건물의 엄 함 확장 됩니다 선택적 번 식 전략과 쥐에 유전자 녹아웃 모델 생산을 위한 새로운 기술을 개발한 쥐 긴장에서이 귀중 한 실험적인 접근을 이용 하 고 그 지식을 잘 이해 생리 적 배경 및 그것의 큰 크기 때문에 생리 적 연구에 대 한 적합성과 더 관련 동물 모델을 확장 합니다.

서문

혈관 기능 활용 하는 동맥 도관 동맥, 및 많은의 초기 연구는 대동맥의 경우. 큰 동맥에서 강제로 생성은 일반적으로 조직 목욕; 힘 변환기를 동맥의 링 세그먼트를 연결 하 여 공부 대동맥의 경우 나선형 절단 하 여 스트립 선박의 있도록 부드러운 근육 섬유 첨부 파일의 포인트와 힘 변환기의 수축에 의해 생성 된 힘의 좋은 견적을 제공 하는 경도 방향에서 동쪽으로 향하게 했다 세로 축 따라 부드러운 근육입니다. Aortas의 나선형 스트립을 절단에 대 한 표준 기술 선박의 루멘에 유리 막대를 배치, 원하는 각도에서 혈관 벽에 상처를 만들고 컷은 전체 생산 확장으로 혈관 벽의 노출된 가장자리의 끝에 개최 되었다 그릇의 나선형 스트립입니다. 그 시점에서, 혈관의 내 피 쪽은 일반적으로 선박 스트립 힘 변환기에 연결 하 고 물속에 산소를 준비 하기 전에 파편을 제거 하 얼룩이 및 온도 제어 조직 목욕. 결국, 편안한 인자 (EDRF), 이후에에서 산화 질소로 식별 된 파생 된 접근 생리학의 역사에서 가장 유명 하 고 중요 한 발견 중 하나를 Furchgott와 Zawadski¹, 즉 피 내 막의 역할에 의해 주도 혈관 기능을 규제. 그의 발견에 지도 하는 중요 한 이벤트는 조사 외국 표면 동맥의 내 피 쪽의 접촉을 피하 여 그대로 피를 유지 하 고 대동맥 스트립 예상 전시 하지 않았다 발견 상황 이었다 아 세 틸 콜린 (ACh), 대신에 ACh 대응 편안 하지만 수축. 그 관찰을 바탕으로, 조사는 그들은 (그러나 수축 성 힘을 생성할 수 없습니다)는 그대로 피와 대동맥 세그먼트를 연결 하는 "샌드위치" 준비 대동맥의 표준 헬리컬 스트립 개발과 ACh 유도 변환 휴식으로 수축입니다.

광범위 하 게 오늘 사용 되는이 지역에서 두 개의 주요 발전은 작은 저항 동맥^2,3 에 활성 수축 성 힘을 측정 하는 준비의 개발 (예:³ 장 mesentery )와 cannulated 저항 동맥 준비^4,,56. 초기 보고서 중 하나에서 Mulvany 및 Halpern³ 와이어 myograph 준비 공부 저절로 고혈압 쥐 (SHR)의 장 mesentery에서 절연된 저항 동맥에 활성 수축 성 힘을를 사용 하 여 설명 하 고 normotensive WKY 제어 합니다. 와이어 myograph 시스템의 개발, 후속 cannulated 저항 동맥 준비 vivo에서 조건^4,,56배 가까이의 연구를 허용 하도록 개발 되었다.  두 방법 모두 귀중 한 결과 제공 하는 동안 cannulated 동맥 준비는 더 효과적으로 보존; 동맥에 본질적인 활성 톤의 추가 장점 변화 흐름 율과 내 피 전단 응력 변화에 과거 압력과 배 응답에 활성 조직적 응답 연구 조사를 허용 하 고 (참조 Halpern와 켈리⁶검토).

현재 종이의 주요 목표에서 이러한 중요 한 활성 톤을 조절 하는 메커니즘에 대 한 정확한 정보를 얻기 위해 절연, cannulated 저항 동맥을 사용 하 여 비디오 현미경의 영광 기술을 채용 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 혈관, 신경, 체액, 또는 parenchymal 세포의 독립에 영향을. 이 기본 정보, 고용 표준 쥐 모델 및 예의 우리의 연구에서 새로운 유전자 조작 쥐 긴장, 텔레비전으로 얻을 수 있는 혈관 기능에 대 한 통찰력의 종류의 아이디어로 독자를 제공할 것입니다. 현미경 접근 하 고 있는 모든 제어 및 탐정의 선택, 강력한 새로운 실험 쥐 모델을 포함 한 선택적 근 친 결혼에 의해 생성 하 고 새로 개발 된 유전자의 실험적인 그룹을 포함 하는 연구에서 채택 될 수 있다 엔지니어링 기술입니다.

텔레비전 현미경 방식의 정밀 감사 cannulated 동맥 준비에 직경 변화의 측정 혈관의 내 피-종속 및 endothelium 독립 메커니즘에 관한 매우 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 휴식, 뿐만 아니라 고혈압, 높은 소금 다이어트, 그리고 다른 실험 개입으로 발생 하는 혈관 제어 메커니즘에서 중요 한 (그리고 때로는 예기치 않은) 변경. 더하여, 압력-직경 관계의 절연 측정과 cannulated 극대로 Ca^{2 +}치료에 의해 완화 저항 동맥-무료 솔루션 또는 약리학 vasodilator 약물 평가 하기 위해 조사를 수 동맥 동맥 기능에 영향을 미칠 수 있는 동맥의 수동 기계적 특성의 변화에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있는 수동 응력-변형 관계⁷ 을 계산 하 고 혈관 개장 때문에 구조적인 변화 독립 (또는 이외에)의 활성 제어 메커니즘에 변경합니다. 그것은 또한 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 정보 LDF, 전체 동물 레벨^{8,9 조직 관류를 평가 하기 위한 실용적인 방법을 이용 하 여 얻은 정보에 의해 보완 될 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 ,10}, microvessel 밀도 붙일 이라는 GS1 lectin를 사용 하 여 평가에서 얻은 정보로는 특히 작은 arterioles, 모세 혈관¹¹ 의 지하실 막에 있는 당단백질 moieties에 바인딩합니다 ^{, 12}. 후자의 방법을 고전적인 어려움 혈관에서 vivo에서, 예를 들어 비 끼얹는다 누락 계산 하 여 microvessel 밀도 추정에 적용 되지 않습니다 microvessel 밀도의 매우 정확한 견적 제공 선박 어디 혈 arterioles의 활성 폐쇄로 인해 중지. 함께 사용 하는 경우 이러한 접근 기능 변경 수준 microcirculatory; 조직 관류의 변화에 절연된 저항 동맥에 연결 하는 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그리고 cannulated 동맥 기술와 함께에서 이러한 중요 한 접근 방법의 사용의 몇 가지 예 또한 현재 원고에 제공 됩니다.

현재 종이 outbred Sprague-Dawley 쥐의 동맥에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 비디오 현미경 검사 법 기술의 사용에 초점을 맞추고. 그러나, 그것은 중요 이러한 기술을 elucidating 선택적 번 식 또는 유전자 기술을 사용 하 여 편집에 의해 만들어진 고도로 전문화 된 유전자 조작된 쥐 긴장에서 phenotypic 변경에 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 이 원고를 제공 어떻게 비디오 현미경 검사 법 기술의 예 수 귀중 한 쥐에에서 혈관 기능에 관한 중요 한 정보에서 가장 널리는 Dahl 소금에 민감한 (SS) 타고 난된 쥐 쥐 한 긴장을 포함 한 모델 제공 실험 모델을 사용 하는 소금 민감한 hypertenson^{18,19,20,21,,2223};의 메커니즘 연구 그리고 consomic 쥐 소금 구분 브라운 노르웨이 (BN) 쥐 긴장 SS 쥐의 선택적인 breeding를 통해 만든. Consomic 쥐 패널에서 갈색 노르웨이 쥐에서 모든 염색체 introgressed Dahl SS^24,,2526 유전 배경으로 개별적으로 되었습니다. 혈압 및 혈관 반응성^{24,25,26 포함 하 여 다른 고기 소금 감도에 기여 하는 특정 염색체에 관한 귀중 한 단서를 제공 하는 consomic 쥐 패널의 사용 ,,2728}.

SS 쥐와 개별 BN 염색체를 운반 하는 consomic 쥐를 이용 하 여 선택적 번 식 전략 또한 Dahl SS 유전으로 개별 브라운 노르웨이 염색체 introgressed의 작은 세그먼트와 좁게 congenic 긴장의 생성 활성화 배경^22,29 이 제공 하는 매우 귀중 한 입력된에 특정 한 유전자 또는 혈압, 신장 손상, 혈관 반응성^22,29등 중요 한 생리 적 변수 영향을 미칠 수 있는 염색체의 지구를 좁힐 수 있습니다. 쥐 유전자 도구 상자에 또 다른 강력한 추가 쥐 유전자 녹아웃 모델 ZFNs, transcriptional 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENS)를 포함 한 기술을 편집 고급 유전자를 활용 하 여 개발 하 고 가장 최근에 CRISPR-Cas9^{13 ,,1415,,1617}. 쥐에 기 절 하는 유전자를 활성화 하는 이러한 강력한 기술의 출현은 대단히 중요 한 발전 날짜에 유전자 녹아웃 학문의 사용 (및 계속 사용) 마우스 때문에 거의 독점적으로. 현재 종이 다른 실험적인 구성 요소 cannulated 동맥 기술 및 녹아웃 쥐 마스터 항 산화 및 세포 보호 전사 부족에 생리 적 제어 메커니즘을 평가 하기 위해 비디오 현미경의 값을 보여 줍니다. 요소, 핵 팩터 (erythroid 파생 2)--2 (NRF2)^30,31, Sprague-Dawley 유전 배경¹⁷TALEN 기술을 사용 하 여 개발 되었다. 그 실험에서 NRF2 유전자의 손실의 기능 검증을 제공 하 고 잠재적으로 귀중 한 치료 접근을 중재 하는 NRF2 항 산화의 직접 upregulation에 따라 테스트를 비디오 현미경 기술은 생체 외에서 사용 되었다 방어입니다. NRF-2는 항 산화 비타민 C와 E³²등의 직접적인 관리를 포함 하는 임상 시험의 실망 스러운 결과 비추어 인간에서 혈관 산화 스트레스를 싸우는에 상당한 치료 중요 합니다.

프로토콜

의학 대학의 위스콘신 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인이 문서에 설명 된 모든 프로토콜 및 모든 절차는 준수는 국립 보건원 (NIH) 사무실의 실험실 동물 복지 (OLAW) 규정입니다.

1입니다. 솔루션 및 선박 챔버의 준비

1. 일련의 실험을 실시, 사전 준비 집중된 소금 재고 솔루션 278 g/L NaCl; 구성 된 x 20의 2 L 14 g/L KCl; 11.52 g/L MgSO₄^. 7 H₂O; 9.4 g/L CaCl₂^. 2 H₂o. 또한 집중된 버퍼 재고 80.8 g/L NaHCO₃ 및 0.4 g/L EDTA, 구성 된 x 20의 2 리터를 준비 하 고 20 x 2 L 집중 캘리포니아^{2 +}-무료 재고 솔루션 281.6 g/L NaCl;의 구성 14 g/L KCl, 및 11.52 g/L MgSO₄^. 7 H₂o.
   참고: 재고 솔루션 X 20 저장할 수 있습니다 냉장고에 사용까지.
2. 실험 당일 준비 생리 적 소금물 (PSS)의 2 L 집중된 재고 솔루션 x 20에서 다음과 같습니다: 2l 삼각 플라스 크 또는 동력된 교 반 접시에 비 커에 이온된 수의 1800 mL를 100 mL 소금 재고 x 20의 추가. 동안 지속적으로 솔루션 포함 된 21% O₂, 5% CO₂가스 혼합물으로 평형 20 x 버퍼 재고 100 mL를 추가, N₂및 자석 교 반 바 감동 균형. 천천히 0.28 g NaH₂포₄ pH;를 모니터링 하는 동안 추가 파스퇴르 피 펫에서 방울 6 N HCl 또는 6.5 N NaOH 솔루션을 추가 하 여 필요에 따라 pH 7.4에 조정 합니다. PSS 준비 후 pH 조정, PSS를 1.98 g의 포도 당을 추가 합니다.
   참고: 그것은 천천히 때문에 PSS의 pH를 모니터링 하는 동안 마지막 NaH₂포₄ 추가 하는 것이 중요 NaH₂포₄ 알카라인 솔루션의 추가 (pH > 7.4)에 표시 된 대로 인산 칼슘 침전을 형성 수는 흐린 솔루션 또는 컨테이너의 하단에 흰색 침전의 모양입니다.
   참고: PSS의 최종 조성은 119 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1.17 m m/L m g₂이렇게₄. 1.6 mM/L CaCl₂; 1.18 mM/L NaH₂포₄; 24 m m/L NaHCO₃; 0.03 mM/L EDTA; 그리고 5.5 m m/L 포도 당입니다. PSS의 구성 실험실 사이에서 다를 수 있습니다, 하지만이 제조 법은 매우 혈관 톤, 내 피 기능 및 절연된 저항 동맥 vasoactive 에이전트 응답 유지 적합 합니다.
3. 최대 직경을 결정 하 고 생산 선박의 최대 팽창 하 여 동맥에 활성 톤을 평가 하기 위해 준비의 캘리포니아^{2 +}500ml-20 X 캘리포니아^{2 +}25 mL를 추가 하 여 PSS를 무료-무료 이온된 물 450 mL 소금 재고 25 mL 삼각 플라스 크 또는 비 커와 비슷한 1.2 위의 단계에서 버퍼 재고 x 20의 뒤. 모니터링 솔루션의 pH를 조정 하는 동안 NaH₂포₄ 의 0.07 g 솔루션에 추가 합니다. 캘리포니아^{2 +}-무료 PSS 정상적인 PSS에 선박 응답에 영향을 미칠 수 있는 세포내 캘리포니아^{2 +} 매장을 없애고 방지 하기 실험의 끝에 PSS 저수지와 선박 챔버에 추가 됩니다. 때문에 캘리포니아^{2 +}-무료 솔루션, 동맥의 최대 휴식을 생성 하는 실험의 끝에 추가 됩니다 PSS에 포도 당을 추가할 필요가 없습니다.
   참고: 때, 캘리포니아^{2 +}의 최종 구성 완료-무료 PSS는 120.6 m m/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1.17 m m/L m g₂이렇게₄. 1.18 mM/L NaH₂포₄; 24 m m/L NaHCO₃; 0 mM/L CaCl₂; 그리고 0.03 m m/L EDTA입니다.
   참고: 많은 연구는 동맥의 최대 팽창을 요구, verapamil (1 µ M) 같은 칼슘 항목 차단 및/또는 나트륨 nitroprusside (10 µ M)과 같은 산화 질소 기증자 추가할 수 있습니다 PSS에서 캘리포니아^{2 +} 제거 뿐만 아니라 솔루션에.
4. 지속적으로 고립 된 대동맥 반지, 장 평활 근, 또는 다른 조직 (그림 1)을 공부 하는 데 사용 하는 표준 기관 목욕에서 선박 챔버로 흐르는 PSS 평형 여 포₂, PCO₂및 PSS의 pH를 유지 합니다. Tetrafluoroethylene 튜브의 합성 중합체를 사용 하 여 연결할 가스 탱크 기관 목욕 튜브의이 종류는 가스 불 침투성, 튜브, 예를 들면, 라텍스의 많은 다른 형태를 달리 하기 때문에.
5. 장소는 작은 공기 돌 PSS 가스 구성 유지 하려면 배 실에서 재래식 가스 혼합물에 연결.
   참고: 변화 포₂ 에 선박 응답 선박 실과 luminal perfusate에 PSS O₂, 예를 들어, 21% O₂, 10% O₂, 5 %O_{2의 다양 한 비율을 포함 하는 가스 혼합물으로 평형으로 시험 될 수 있다} , 0% O₂, 5% CO₂ 와 균형 N₂^33,,3435와 함께. 두꺼운 벽, 혈관 벽의 센터에 산소의 확산 제한 해야 할 수 있는, 큰 동맥 산소, 예를 들면, 95% O₂ 의 더 높은 백분율을 사용할 수 있습니다.
6. 개별 실 그들의 열 전달 특성에 따라 달라질 수 있습니다으로 밀접 하 게, 선박 챔버에서 온도 모니터링 합니다.
   참고: cannulated 저항 동맥의 연구에 사용 하는 많은 상업적으로 준비 된 선박 챔버 활용 연동 펌프 가스 equilibrated 저수지에서 산소 PSS를 제공를 제공 하는 매우 정밀 하 게 제어 목욕 온도 산소의 PSS입니다.
7. 대형 (2 패) Mariotte 병 스 토퍼와 기관 목욕을가 열 하 고 가스 equilibrates 용기 챔버 (그림 1A)로 흐르는 PSS에 PSS를 지속적으로 제공 하는 저수지 역할을 중앙 유리 튜브에에서 PSS를 놓습니다.
8. 장소 Mariotte 병 기관 목욕으로 PSS의 배달에 대 한 일정 한 액체 정역학 압력 머리 유지 기관 목욕에 PSS의 상단으로 동일한 수준에 중앙 유리 튜브의 오프닝. 사용 하 여 폴 리 에틸렌 튜브 J 모양 유리 또는 플라스틱 튜브 기관 목욕으로 PSS Mariotte 병에서 제공에 연결.
9. Luminal 관류 (그림 1A)를 사용 하 여 폴 리 에틸렌 튜브 60 cc 플라스틱 주사기 (일반적으로 80 mmHg 쥐 뇌의 연구에 대 한 원하는 유입 압력을 유지 하는 위치에 높은 구성 PSS 저수지에 유입 피 펫을 연결 자 지를 통해 시스템에 연결 된 한 동맥), 압력 측정 변환기
10. 압력 기울기에 대 한 응답에 있는 배를 통해 흘러 PSS 수 있도록 폴 리 에틸렌 튜브를 유출 피펫으로 고 저수지 유입 저수지와 비슷한에 유출 라인 연결. 비슷한 자 지와 압력 변환기 연결을 사용 하 여 유출 압력 측정.
    참고: 과거 압력을 설정 하 고 혈관을 통해 흐름 제어에 대 한 절차는 아래 2에서 설명 합니다.
11. 실험의 끝에, 상공 회의소, 배달 라인과 저수지 시스템과 증류수 린스 철저 하 게. 빈번한 간격 깨끗 한 배관 및 납품 라인을 대체 또는 시스템에는 stopcocks를 대체 하 고 주기적으로 박테리아와 오염 원인이 다른 미생물의 성장을 방지 하기 위해 산 성 세척에 어떤 유리 PSS 저수지를 대상 및 혈관 반응성을 영향을 줍니다.

2. cannulated 동맥 준비

1. 5 %isoflurane Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize 하 고 1.5-2.5% 의학 급료 산소³⁶을 사용 하 여 마 취를 유지 합니다. 또는, 케 타 민 (75.0 mg/kg), acepromazine (2.5 mg/kg), xylazine (10.0 mg/kg);를 포함 하는 근육 주사를 관리 pentobarbital (50-60 mg/kg);의 복 주사 또는 마 취, 프로토콜 및 탐정 환경 설정에 따라 다른 승인 된 방법.
2. 깊은 마 취 쥐 목을 벨 고 저항 대뇌 동맥의 연구에 대 한 뇌를 제거 합니다.
3. 두뇌의 제거 후, 신중 하 게 중간 대뇌 동맥 (MCA) (또는 격리 관심 예를 들어, 두개골 기저 부의 동맥, 후부 대뇌 동맥의 다른 동맥)^37,38. MCAs를 격리 하려면 뇌를 부정사 차가운 PSS (그림 2)으로 가득 유리 페 트리 접시에 놓습니다.
4. 욕실이 위 및 Dumont #5 좋은 팁 겸 자 사용 하 여 뇌에서 MCA를 삭제할.  MCA는 집게를 사용 하 여에서 어떤 잔여 뇌 조직 깨끗 하 고 온도 제어 선박 상공으로 앞에서 설명한 PSS를 포함 하는 동맥을 전송. ^{33 , 34}  .
5. 동맥 혈관 챔버를 전송 하려면 부드럽게는 ACA 또는 사후 통신 동맥 세그먼트 삭제 선박 누른 신중 하 게 챔버에 배치 합니다.
   참고: MCA, 뿐만 아니라 cannulated 선박 시스템은 다양 한 골격 근육 저항 동맥^33,,3940, mesenteric 저항 동맥을 포함 하 여 작은 그릇 준비에 적합 ^{38 , 41 , 42}, 그리고 큰 (첫번째 순서) cremaster 근육⁴³, arterioles, 인간 관상 동맥 arterioles 고 인간의 arterioles gluteal 생^{44,45, 동안 피하 지방 조직에서 얻은 46,47}.
6. 팁 MCA의 루멘으로 발전 될 때까지 피 펫 기지 쪽으로 당겨 유입 micropipette에 동맥을 연결 합니다. 이전 동맥 (그림 1B)에 주위 10-0 봉합에서 조롱 한 가닥 파이버에서 준비 하는 루프를 매 여 유입 피 펫에 동맥을 보안 합니다. 두 번째 봉합 루프 선박 (그림 1B) 주위를 강화 하 여 유출 피 펫에 MCA의 반대쪽 끝을 보안 합니다.
   참고: 봉합 루프 선박에 장착 하기 전에 micropipettes에 및 첨부 파일의 마지막 포인트에 가까운 위치, 어떤의 위험을 최소화 있도록 동맥에 쉽게 미 끄 러 하 고 신속 하 게 확보 선박 위치에 있을 때는 동맥은 펫을 미끄러져입니다.
   참고: Micropipettes 붕 규 산 유리 모 세관 튜브 (2 mm 외부 직경 1 m m 내경, 길이 10 c m)에서 준비가 수직 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 동맥을 연결 하기 전에 micropipettes의 팁 직경을 관류 시스템에서 유입 및 유출 저항의 불일치를 방지 하기 위해 최대한 가깝게 일치 합니다.
7. 동맥은 micropipettes에 안전 하 게 연결 되어, 후 유입 피 펫 소유자에 연결 하는 마이크로 미터를 사용 하 여 제자리에 길이에 동맥을 스트레칭.
8. 동맥에 일정 한 압력을 유지 하기 위해 10-0 봉합에서 조롱 하는 단일 가닥으로 모든 측 지점에서 넥타이.
9. Intraluminal (과거) 압력 일시적으로 유입 피 펫을 닫은 후 계속 유지 하 여 누출의 부재를 확인 합니다. 어떤 지점에서 매십시오 또는 압력이 떨어지는 경우는 혈관에 있는 구멍에 대 한 확인. 과거 압력 일정 하 게 유지 하는 확인 한 후 관류를 복원 합니다.
   참고: Cannulation 절연된 저항 동맥의 수동 손 재주 및 연습을 요구 한다. 관찰 될 주요 조치는 펫을 침입 방지 하 고 동맥은 펫에서 슬라이드 하지 않습니다 있는지 확인 하십시오 있습니다. 선박 외상 endothelium을 손상 시킬 수 있습니다 전체 절차를 통해 격리 된 동맥을 부드럽게 하는 것이 중요 하다 혈관 부드러운 근육의 정상적인 기능을 방해 그리고/또한.
10. 이루어진 해 현미경에 부착 하 고 비디오 마이크로미터와 텔레비전 모니터 (그림 1B, 1c)에 연결 된 비디오 카메라는 비디오 현미경 설치 (그림 1A)를 사용 하 여 동맥의 내부 직경을 측정 합니다. 이로써 동맥의 안 벽에 이동식 참조 라인을 배치 하 여 수동으로 배 직경을 측정 하는 관찰자 고, 원하는 경우, 뿐만 아니라, 동맥의 외부 벽에 혈관 벽의 두께 측정 하기 위하여.
    참고: 일부 비디오 마이크로미터 선박 크기의 자동 추적을 제공합니다.
    참고: 현미경 스테이지 마이크로 미터와 유입 비디오 마이크로미터 보정 및 압력 트랜스듀서는 수은 혈압 계 (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg, 그리고 200 mmHg) 실험의 정확한 측정을 보장 하기 위해 사이 유출 혈관 직경 및 intraluminal 압력입니다.
    참고: 표준 제어 과거 압력 쥐 MCA 실험에 대 한 80 mmHg입니다. 높고 낮은 압력 레벨 보정 극대로 동 공이 확장 되어 동맥에서 압력 및 수동 압력 직경 곡선 변화 과거에 조직적 응답의 연구에 대 한 정확도 보장합니다.
11. 일정 한 레벨에서 원하는 과거 압력을 유지 하기 위해 유입 및 유출 저수지의 높이 조정 합니다. 작은 금액 (< 5 mmHg)으로 유입 저수지를 제기 하 고 동일한 양만큼 유출 저수지를 낮추는 뜻 과거 압력을 유지 하 고 배 루멘⁶에서 관류 흐름을 만듭니다.
    참고: 유입 저수지를 제기 하 고 동일한 금액으로 유출 저수지를 낮추는 압력 동맥, distending 같은 말은 과거를 유지 하지만 선박, 흐름 및 전단 응력을 발생 시키는 압 그라디언트를 생성 수는 변화 intraluminal 전단 응력에 다른 실험에 피 종속 응답을 평가 하는 조사는⁴⁸를 그룹화 합니다.
12. 조직적 응답 선박 vasodilator 자극에 응답을 평가, 동맥 실험 전에 활성 톤 (약 40%)의 적합 한 레벨을 전시 있는지 확인 합니다. 어떤 동맥 혈관, 예를 들어, 일반적으로 활성 휴식 톤을 전시 하지 않는 작은 mesenteric 동맥을 제외한 나머지에서 활성 톤 부족을 삭제 합니다.
    참고: 일반적으로 자연 스러운 톤을 전시 하지 않는 선박에 대 한 상응 하는 금액 norepinephrine 등 phenylephrine vasoconstrictor 주 작동 근을 이용 하 여 미리 동맥 수축. 미리 동맥을 수축 하는 데 사용 하는 주 작동 근의 복용량을 선택 하는 좋은 방법은 vasoconstrictor 에이전트, 예를 들어, norepinephrine^41,42의 EC₅₀ 복용량을 활용 하는 것입니다. 그러나, 약리학 vasoconstrictor 요원 하지 휴식 조건 아래 자연 활성 톤 하는 동맥에 적용 합니다.
13. ACh의 농도 증가의 추가 동안 혈관 직경을 측정 하 여 cannulated 저항 동맥의 내 피-종속 반응 테스트 (10^-10 M-10^-5 M) 선박 약 실에. (10^-10 M-10^-5 M)에 산화 질소 기증자 나트륨 nitroprusside의 농도 증가의 추가 동안 혈관 직경을 측정 하 여 혈관 평활 근의 내 피 독립 질소 산화물 감도 테스트는 선박 약 실입니다.
    참고: 감도 vasoconstrictor 에이전트 및 다른 vasodilator 촉진제를 테스트할 수 있습니다 비슷한 방식 선박 약 실에 있는 주 작동 근의 증가 농도 추가 하 여.
    참고: vasoactive 에이전트 뿐만 아니라 다양 한 약물, 억제제, 및 다른 약리 에이전트 추가할 수 있습니다 조직 목욕 또는 luminal perfusate. 포₂ (로 PCO₂ 와 pH) 변화 관리 될 수 선택적으로 동맥의 내 피 쪽 또는 추가 luminal luminal perfusate의 별도 평형에 의해 보정된 가스 혼합물에 연결 하는 공기 돌으로 다른 조직 목욕^33,,3449에 PSS를 equilibrate 하는 데 사용 하는 혼합. 과거 압력의 변화에 대 한 조직적 응답 유출 피 펫을 폐쇄 하 고 양육 하 여 공부 될 수 있다 (또는 저하) PSS 저수지의 높이는 유입 피 펫^49,,5051 에 연결 증가 또는 intraluminal 압력을 감소 시킨다.
14. 특정 자극에 선박 응답 중재에서 endothelium의 역할을 테스트 하려면 혈관 내 피를 제거 하 고 그 자극에 선박 응답 endothelium의 유무에 비교. 있는 피를 제거 하려면 신중 하 게 유출 피 펫에서 동맥 풀고 천천히 공기 bolus로 동맥의 루멘 perfuse (0.5-1.0 mL). 어 재 관류 후 PSS 관류 전에 다시 유출 피 펫⁴³에 배를 묶는 세포질 파편을 복원 합니다.
    참고: 내 피 노출 절차에 따라 그것은 endothelium 알려진 endothelium 종속 엷게 그 선박 종류에서를 생산 하는 주 작동 근 (보통 ACh) 혈관 응답 테스트 하 여 제거 됩니다 확인 해야 합니다. 그러나, 특정 pathologic 조건에서 endothelium 종속 vasoconstrictors 해제 됩니다, 어떤 경우에, 그것은 위 응답 내 피 제거 다음 제거 됩니다 확인 해야 합니다.
15. 실험의 끝에, 캘리포니아^{2 +}를 추가 하 여 동맥의 최대 직경을 결정-perfusate 및 superfusate를 PSS를 무료. 적극적인 휴식 톤 (%) ((D_최대-D_나머지) /D_최대)로 D_최대 는 캘리포니아^{2 +}의 최대 직경 100 x 계산-무료 솔루션 및 D_나머지 는 휴식 제어 직경.
    참고: 다른 실험적인 그룹에 있는 극대로 편안한 동맥의 직경 측정은 활성 휴식 톤, 구조 (즉, 벽 두께 루멘 직경에서 변화), 리 모델링 및 동적 기계적 특성 비교에 중요 한 (과거 압력의 서로 다른 수준에서 수동 직경에서 계산 응력-변형 관계).

3. 대뇌 혈액 흐름 응답 LDF와 평가

1. 5 %isoflurane 동물을 anesthetize 및 보안 기구 stereotaxic^9,10에 쥐.
2. 호흡 주파수, 끝 간만 CO₂, 그리고 발가락 핀치³⁶와 마 취의 깊이 모니터링 하는 동안 상수 마 취 동물을 유지 한다.
3. 신중 하 게 얇은 광학 커플링¹⁰를 제공 하는 낮은 속도 치과 드릴 및 미네랄 오일을 사용 하 여 반투명에 두개골. 주의 과도 한 열 생성을 방지 하 고 뼈를 관통 하지 않도록 합니다.
   참고: 기본 조직에 도달 하 고는의 크기 (즉, 적혈구) 움직이는 입자의 수에 의해 결정 됩니다 도플러 이동 측정 하기 위하여 조사를 다시 반영 레이저 빛을 허용 한다 두개골의 고 그들의 속도입니다.
4. micromanipulator LDF 프로브를 장악 하 고 두개골의 남았다 영역 바로 위에 놓습니다. 실험 기간 동안 LDF 조직에의 한 제한 된 지역에 흐름을 측정 하기 위해 설계 하 고 모션 아티팩트에 매우 민감한 LDF 프로브 또는 자체 준비의 움직임을 방지 하기 위해 매우 중요 하다.
   참고:의 처음 위치에서 검색의 모든 움직임 비교 제외 조직의 다른 영역에 혈액 흐름의 견적을 제공할 것입니다. LDF 절대 흐름 값을 제공 하지 않는 하는 동안 주제 사이 비교에 적합 하지 않습니다, 그것은 noninvasively 개별 과목; 실험 개입에 대 한 응답에서 조직 관류의 변화를 평가 하는 훌륭한 방법 그리고 LDF 신호 제어 값에서에 상대적인 변화를 평균 하 고 다른 실험적인 그룹에 있는 컨트롤에서 LDF 신호에 있는 변화에 비해 수 있습니다.
   참고: LDF는 다른 실험 그룹^8,,910전체 혈관 침대의 수준에서 혈액 흐름을 조절 하는 요인에 대 한 편리한 방법입니다. LDF와 조직 관류의 평가 전체 침대 관점에 고립 된 배 연구 로부터 얻은 지식을 동화 하는 실용적인 접근 방식을 제공 합니다. 저항 동맥 사이는 미세 혈관 제어 메커니즘에 있는 지역 다름, 없다면 LDF 얻은 측정 일반적으로 얻은 결과와 일치 하는 조직의 혈액 흐름 제어의 좋은 표시를 제공 cannulated 동맥 준비입니다.

4. 평가 GS1 Lectin과 골격 근육 Microvessel 밀도의

1. 표준 미세 수술가 위로 음 낭 오픈 절단 하 고 다음 몬 트 #5 집게를 사용 하 여 근육을 파악 하 여 남성 쥐에서 cremaster 근육을 제거 합니다.
   참고: (예를 들어, cremaster 근육 뿐 아니라 신 근 digitorum longus와 tibialis 앞쪽 근육 남성 및 여성 쥐에서 발견 되는) 얇은 근육 적합 사용 하기 위해 전체 lectin 연구에 대 한 마운트로 비록 조직학 두꺼운 조직에 대 한 섹션을 사용할 수 있습니다.
2. 한 컷을 사용 하 여 고환에서 cremaster 근육을 제거 합니다. 얼음 처럼 차가운 PSS에 배치 하 고 표면 내부 바닥에 실리콘 고무 라이닝과 페 트리 접시에 그것을 핀. 부드럽게 떨어져 결합 조직 Dumont #5 집게를 사용 하 여 나무 랄 수 있습니다.
3. 버퍼링 된 PSS의 2 mL와 함께 근육 샘플 린스 다음 rhodamine 표시 GS1 lectin (20 µ g/mL PSS) 2 mL와 함께 12-잘 셀 문화 판에서 50 분에 젖어/잘 그 빛을 제외를 알루미늄 호 일에 싸여 있다.
4. Lectin 솔루션에서 조직을 제거 하 고 그들에 게 PSS에 세 번을 씻어 5 분 "세척" 외피에는 로커와 현미경 슬라이드에 탑재. 품 어 어둠 속에서 조직 및 형광의 손실을 방지 하기 위해 어둠 속에서 슬라이드를 저장 해야 합니다.
   참고: 슬라이드는 즉시 사용할 수 없습니다, 그들은 형광의 손실 없이 냉장고에 보관 될 수 있습니다. 장기간된 보관에 대 한 슬라이드¹¹악화 방지 하기 위해 냉동 실에 보관할 수 있습니다.
5. Microvessel 밀도⁵²이미지 통해 컴퓨터에서 생성 된 그리드 선 또는 슬라이드를 보려면 하는 데 사용 되는 모니터 위에 겹쳐 투명 그리드 오버레이 레이블된 microvessels의 교차점의 수를 계산 하 여 평가 합니다.
   주: GS1 lectin 접근 설명 하는 데 사용 되었습니다: 소금 유도 microvascular 진공⁵³, 소금 방지 보호 효과 유도 angiotensin II 억제 소금 먹이 동물^{17 microvessel 밀도 복원 ,5354}; 쥐 소금 먹¹⁷; microvessel 희박을 방지 하기 위해 낮은 복용량 angiotensin II 주입의 보호 효과 중재 하는 NRF2의 역할 그리고 또한 안의 역할을 평가 하기 위해 신생 응답 소금에 만성 근육 자극을 유지 하는 II 쥐^54,55먹이. GS1 lectin 기법에의 한 장점은 cannulated 저항 동맥 또는 LDF의 연구에 사용 하는 동일한 동물에 microvessel 밀도 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

결과

과거 압력 정상 에 vivo에 에서 그리고 parenchymal 세포의 부재에서 cannulated 저항 동맥의 생체 외에서 현미경에 작은 저항 동맥 (큰 arterioles) 활성 톤을 영향을 미치는 요인의 연구에 대 한 허용 영향을 미칩니다. 다양 한 vasodilator 및 vasoconstrictor 자극에 선박과 일반 PSS, 캘리포니아^{2 +}에서 과거 압력 상승에 대 한 조직적 응답의 반응성을 평가 하는 것 외에?...

토론

이 종이 소개에서 설명 했 듯이, 텔레비전 현미경의 사용에 설명 합니다 및 절연된 저항 동맥 표준 쥐 모델 (비디오에 사용)에 뿐만 아니라 혈관 기능을 평가 하기 위해 접근 하지만 또한 매우 전문화 유전자 소설과 이러한 접근법을 활용 하 여 얻을 수 있는 강력한 통찰력을 보여 조작된 쥐 변종. 활성 톤을 평가 하기 위해 이러한 강력한 방법 사용 하 고 작은 저항 동맥의 수동 기계적 성질 endotheliu...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS Rat	Medical College of Wisconsin	SS/JHsd/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 5BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 13BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates	Medical College of Wisconsin	SD-Nfe212em1Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113756
Colorado Video Caliper	Colorado Video, Inc.	Model 308
Video Camera	Hitachi	KPM1AN
Microscope	Olympus Life Science	CKX41
Television Monitor	Panasonic	WVBM1410
Pressure Transducers	Stoelting	56360
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Cannulated Artery Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1	Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber	Living Systems Instrumentation	TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight	Living Systems Instrumentation	GD-MS	Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature	Living Systems Instrumentation	OX	Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin	Vector Labs	RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes	Fredrich Haer Co.	27-33-1	2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY	Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.	114-ANM-10	Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Scissors	Fine Science Tools	15003-08
Protandim	Protandim		NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous	Fisher Chemical	D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)	Sigma Aldrich	M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)	Sigma	C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)	Sigma	S0751-500G
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Chemical	P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	ED255-500G