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  • Protocolo
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.

Resumen

Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 - 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.

Introducción

Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recientemente, RNA-seq fue utilizado para caracterizar cambios de expresión génica en el tiempo durante la hipoxia 13. Aquí, se presentan los detalles experimentales y discuten.

La hipoxia puede lograrse de varias maneras, cada una produciendo un nivel diferente de O2. Aquí, la hipoxia fue establecida por continuamente que fluye ultra alta pureza N2 en frascos, que disminuye [O2] inmediatamente disuelta con reproductivos cinética 10. Es posible que algunas O2 moléculas presentes que contribuyen a la expresión génica y el metabolismo pero este entorno se considera muy cerca de anaerobios. En ausencia de O2, las células de levadura no pueden sintetizar hemo, ergosterol y ácidos grasos insaturados 4,12,14. Así, estudios previos han incluido estos metabolitos cuando levadura sin oxígeno 5,10,15. Sin embargo, muchas respuestas hipóxicas son mediadas por el agotamiento de estos metabolitos y así rellenarlos invierte en el gen hipóxico expresión respuestas 12,16. Con el fin de imitar la hipoxia natural, estos metabolitos no fueron agregados a los medios de comunicación. En el poco tiempo que las células fueron expuestas a hipoxia sin la presencia de estos metabolitos esenciales, no había ningún aumento sensible en la muerte celular (datos no mostrados) ni a estrés prolongado respuesta 13.

La respuesta también es dependiente de la cepa y su genotipo. Especialmente importantes son los alelos de los reguladores conocidos de respuestas hipóxicas 2. El fondo de la cepa de S288C es altamente deseado para que resultados pueden ser comparados con los otros estudios genómicos realizados con esta variedad. Sin embargo, S288C contiene un alelo de pérdida de la función parcial de la HAP1 gen 17, un regulador transcripcional esencial para la respuesta hipóxica. Este alelo fue reparado en S288C usando un wildtype copia de la Σ1278b cepa fondo 11.

Expresión génica es altamente dependiente sobre el medio ambiente celular. Por lo tanto, al realizar el análisis del mRNA del genoma, es importante mantener un ambiente constante mientras varía otro parámetro como tiempo, estímulo o genotipo. Para lograr resultados altamente reproducibles, considere estas tres prácticas para el estudio y sus réplicas biológicas o técnicas. En primer lugar, el mismo experimenter(s) debe realizar el estudio, desde prácticas técnicas pueden variar a través de experimentadores. En segundo lugar, del mismo lote de ingredientes debe utilizarse en los medios de crecimiento, ya que cada lote tiene una composición ligeramente diferente que puede afectar la expresión génica. En tercer lugar, para minimizar los efectos del ciclo de la célula, cada momento debe consistir en células asincrónicas en la fase de registro medio de crecimiento (1-2 x 107 células/mL).

Al caracterizar una respuesta compleja como la gene expresión respuesta a la hipoxia, un curso del tiempo es ventajoso para la determinación de la cinética de varios eventos. Puntos de tiempo específico deben ser elegidos que capturará los principales cambios de la respuesta. En este estudio, se observaron puntos de tiempo entre 0 y 4 h, porque pasados experimentos revelaron cambios generalizados en la expresión génica durante este período 13.

Para medir la expresión génica global, RNA-seq fue usado 18,19. Este método utiliza secuenciación de próxima generación para determinar la abundancia relativa de transcripción de cada gen. En comparación con el análisis de microarrays de DNA, RNA-seq exhibe una mayor sensibilidad (para detectar menos abundantes transcripciones), un mayor rango dinámico (para medir cambios veces mayor) y reproducibilidad superior (seguir con precisión la expresión génica en el tiempo). Normalmente, más celular ARN es ARN ribosómico que muchos métodos han sido desarrollados para enriquecer determinados RNA especie 20. Aquí, granos de poly-T se utilizaron para purificar las transcripciones del mRNA de la poli-que la contengan, aunque varios comercialmente - kits disponibles de agotamiento de rRNA también podrían ser eficaces en el enriquecimiento de mRNA.

Aquí, se caracterizó la respuesta de expresión del gen de S. cerevisiae a la hipoxia. Las células fueron expuestas a la hipoxia y luego muestras en ocho puntos del tiempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 y 240 min). Para confirmar la reproducibilidad e identificar estadísticamente cambió las transcripciones, se realizaron tres réplicas biológicas. ARN fue extraído por la interrupción mecánica y purificación de la columna y luego procesada para el análisis de RNA-seq. Se describe la tubería posterior secuenciación y programación scripts son siempre que permiten la replicación exacta de los análisis realizados. Específicamente, Trimmomatic 21TopHat2 22, HTseq 23, el entorno estadístico de R 24y el DESeq2 paquete 25 fueron utilizados para procesar los datos de RNA-seq y a identificar los 607 genes que cambian significativamente durante hipoxia. Análisis de componentes principales (PCA) y expresión génica de las repeticiones indican la reproducibilidad de la técnica. Clustering y heatmaps reveló cinética de expresión amplia, mientras que el análisis del gene ontology (GO) demostró que muchos procesos celulares, como respiración aeróbica, se enriquecen en el conjunto de genes regulados por el oxígeno.

Protocolo

1. inducción de hipoxia

  1. Un día o más antes del curso de tiempo de hipoxia: preparar la incubadora, celular filtrado sistema de vacío, tanque de gas, frascos, tapones, tubos de vidrio y tubos, como en la Tabla de materiales.
  2. Coloque el tanque de2 N, incubadora, sistema de aspiración y filtración en proximidad cercana, a habilitar el procesamiento rápido de las células.
  3. Preparar medio YPD líquido estéril (1% Extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa) mezclando los componentes en una botella de vidrio y autoclave.
  4. Plan de diseño de frascos en la incubadora.
    Nota: El tanque de2 N, el primer frasco será una trampa de agua, el segundo matraz será el último punto de tiempo, el tercer matraz será el segundo a último momento y así sucesivamente hasta el último frasco que es una trampa de agua final. La figura 1 muestra el orden y las conexiones entre los frascos.
  5. El día anterior el curso del tiempo, inocular una colonia de levadura en una cultura de 5 mL de líquido YPD dentro de un tubo de ensayo estéril. Específicamente, recoger una colonia completa de una placa con un palito aplicador estéril. Coloque el palo en el YPD líquido y agitar el palo hasta que la mayoría de las células en suspensión.
  6. Gire los tubos a 30 ° C durante la noche (~ 16 h).
    Nota: Después de 16 horas, las células de tipo salvaje alcanzar saturación (~ 2 x 108 células/mL), indicado por una cultura muy nublada. Otras cepas pueden tardar más tiempo para alcanzar la saturación y prueba midiendo la concentración de células con un espectrofotómetro, tal como se indica en el paso 1.9.4.
  7. En el día del curso del tiempo, después de 16 h de incubación, diluir la cultura saturada 1:50 por utilizando una pipeta de 5 mL a 4 ml de noche cultura en 196 mL de YPD líquido dentro de un matraz de 500 mL estéril. Crecer con agitación a ~ 200 rpm durante 4 horas a 30 ° C.
    Nota: Después de 4 h, una cultura de tipo salvaje llega a una concentración de medio registro de ~ 1-2 x 107 células/mL.
  8. Durante la 4 h de incubación, etiqueta los frascos (para las trampas de la hipoxia y el agua) y los 50 mL tubos de recogida. Si la incubadora en el paso 1.7 anterior no se utiliza para el curso del tiempo de hipoxia, encienda la otra incubadora y 30 ° C.
  9. Justo antes de someter las células a la hipoxia:
    1. Añadir 50 mL de agua a dos de los frascos estéril de 250 mL que servirán como las trampas de agua.
    2. Llenar 1/3 de hielo de cubo con nitrógeno líquido y sumerja un bastidor de espuma de poliestireno para sostener tubos de centrífuga de 50 mL.
    3. Configurar el sistema de filtro para recolección de células. Añadir un disco de filtro estéril en la unidad inferior del sistema de filtración utilizando pinzas estériles, teniendo cuidado de tocar sólo los bordes del disco de filtro. Coloque la unidad en la unidad inferior del filtro filtro y asegure con abrazaderas el sistema. Asegurar que las unidades superior e inferior están alineadas para que haya un sello hermético y no hay fugas.
    4. Medir la concentración de células con un espectrofotómetro. Diluir las células por lo que puede medirse en el rango lineal del espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0,6, dependiendo del espectrofotómetro.
      Nota: Una unidad de OD600 es ~ 3 x 107 células/mL, dependiendo de la morfología de la célula y espectrofotómetro. Se espera una concentración de ~ 1-2 x 107 células/mL, correspondiente a OD600 ~0.33 - 0.66.
    5. Obtener rápidamente la muestra de tiempo 0.
      1. Conecte el sistema de filtro a un vacío fuerte (~ 10 mbar) a través de tubo de vacío y una trampa de frasco de 1.000 mL. Encienda la aspiradora. Vierta la cultura (generalmente unos 20 mL) en la unidad y espere a líquido ser tirado a través del filtro (~ 10 s, dependiendo de la fuerza del vacío).
      2. Con cuidado retire el disco de filtro con unas pinzas limpias y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque inmediatamente el tubo de centrífuga en el estante sumergido en nitrógeno líquido. Importante, no pre-enfriar los tubos antes de insertar el filtro ya que podría explotar los tubos.
      3. Después de > 30 s, lugar el tubo en un congelador de-80 ° C para la posterior extracción de RNA. Después de cada filtración, limpiar y volver a montar el sistema de filtro. Enjuague el sistema tirando agua a través de 10 s sin un disco de filtro. Por último, seque el sistema con una toalla de papel.
    6. Diluir la cultura 4 h en frascos diferentes para los distintos puntos de tiempo, para que cada frasco alcanza registro media concentración (~ 1-2 x 107 células/mL) en el momento indicado de la hipoxia.
      Nota: La tabla 1 muestra las diluciones que se utilizaron para la cepa haploide de tipo salvaje S288C HAP1+ . Es aconsejable probar cada cepa en estas condiciones de cultivo hipóxico y ajustar en consecuencia las diluciones.
    7. Una vez que las células y los medios de comunicación se añaden a los matraces, reemplazar el papel de aluminio que cubre el frasco con un tapón que contiene dos tubos de vidrio insertados.
    8. Coloque los frascos en la incubadora en el diseño determinado anteriormente.
    9. Conecte firmemente la tubería como se muestra en la figura 1.
    10. Compruebe que todos los tapones se empujan firmemente en los orificios del matraz.
  10. A tiempo 0, abra la válvula del regulador. Luego ajuste el medidor de flujo a 3 L/min.
    Nota: Burbujeo se observará en ambos frascos de agua, indicando flujo adecuado de gas. Si este no es el caso, compruebe que los tapones estén bien apretadas y tubería esté correctamente conectada.
  11. La incubadora de cierre y ajuste la velocidad de agitación a ~ 200 rpm. Iniciar un temporizador.
  12. Antes de cada momento, establecer el sistema de filtración como se describe anteriormente en el paso 1.9.3.
  13. En cada punto del tiempo (p. ej., 5 min, 10 min, etc.), con dos personas procesar rápidamente las celdas como sigue:
    1. Primera persona: Retire el matraz adecuado del soporte y sacar el tapón (con tubo de vidrio conectado).
      Nota: Esto no interrumpirá el flujo de N2 a cualquiera de los frascos de cultivo restantes pero rompe temporalmente el flujo a la última trampa de agua.
    2. Segunda persona: Pipetear 1 mL de cultivo y pipetear en una cubeta. Vuelva a conectar el tubo del frasco de cultura que está ahora en el extremo de la línea a la última trampa de agua (un tubo y una tapón voluntad eliminarse en el proceso). Entonces, medir la concentración de células en la cubeta, como se describió anteriormente en el paso 1.9.4.
    3. Primera persona: Vierta el resto de la cultura en el sistema de filtración de vacío y luego realizar filtrado y congelación como se describió anteriormente en el paso 1.9.5.
  14. Cuando haya terminado con todos los puntos de tiempo, apague el gas N2 . Primero cerrar el regulador y esperar a que la presión liberar y luego apague el medidor de flujo. Finalmente, desmontar el sistema y limpiar todos los materiales con agua y luego con etanol al 70%.

2. extracción de RNA

  1. Preparar buffer RLT para purificación del ARN a columna, como se describe en la Tabla de materiales.
  2. Preparar una solución de trabajo de la ADNsa añadiendo 10 μl de la solución madre de DNasa a 70 μl de buffer RDD por muestra (véase Tabla de materiales).
  3. Retirar los tubos de 50 mL que contiene filtros y células del congelador de-80 ° C y coloque en hielo se descongele (~ 15 min). Realice los pasos siguientes con los tubos en hielo.
  4. Etiqueta 2 mL tubos de tapón de rosca y colocar en hielo, un tubo para cada muestra. Añadir ~0.6 mL de ácido lavado los granos en cada tubo, utilizando un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cucharada y medir las cuentas.
  5. Añadir 0,6 mL del tampón frío de la RLT en los tubos de 50 mL.
  6. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para quitar las células de filtro y suspender en la solución. Evitar que el filtro permanezca en la solución como empapará el filtro de la solución. Quitar toda la solución absorbente en el filtro utilizando la punta de la pipeta para apretar el filtro contra la pared del tubo.
  7. Transferir todo el líquido del tubo de 50 mL a los tubos de tapón de rosca que contiene granos.
  8. Colocar los tubos de tapón de rosca en un homogeneizador de molino de grano y duración de un minuto.
    Inmediatamente Coloque los tubos en hielo durante tres minutos. Otra vez, colocar los tubos en el homogenizador y duración de un minuto.
  9. Retirar los tubos del homogeneizador y el lugar en el hielo durante 5 minutos. Las cuentas se asentarán en la parte inferior de los tubos.
  10. Realizar el resto de los pasos a temperatura ambiente.
  11. Con una pipeta, transferir solamente el lisado (~ 350 μL), evitando los granos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  12. Microcentrífuga por 2 min a máxima velocidad y luego traslado el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  13. Agregar 1 volumen de etanol al 70% (a base de etanol de grado biología molecular prueba 200). Mezclar por pipeteo.
  14. Transferencia de la solución y cualquier precipitado a una columna de RNA que se ha colocado dentro de un tubo de colección de 2 mL.
  15. Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través (el líquido en el tubo).
  16. Añadir 350 μl de tampón RW1 a la columna. Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.
  17. Añadir 80 μl DNasa I mezcla de incubación de la membrana de la columna (no permita que en los lados del tubo) y dejar para reposar 15 minutos.
  18. Añadir 350 μl de tampón RW1 a columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.
  19. Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar flujo a través.
  20. Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga por 2 min a ≥12, 000 x g.
  21. Cuidadosamente retire la columna y coloque en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Microcentrífuga a toda velocidad durante 1 minuto (para secar completamente la membrana).
  22. Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna.
  23. Eluir el RNA de la columna por microcentrifuging durante 1 min a ≥12, 000 x g. Al cargar las columnas en la microcentrífuga, asegúrese de que las tapas del tubo de colección se enfrentan en la dirección de la centrifugadora gira, para evitar que las tapas de interrupción.
  24. Añadir otro 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna, manteniendo la columna en el mismo tubo de microcentrífuga.
  25. Microcentrífuga durante 1 min a ≥12, 000 x g, por lo que el volumen del efluente final es 60 μL.
  26. Almacenar cada tubo de 1,5 mL que contiene 60 μL de RNA en el congelador de-80 ° C.

3. determinar la calidad y la concentración de RNA

  1. Medir la concentración de ARN y ADN en cada muestra de RNA, con un Fluorímetro, (b) ADN y RNA-específico fluorescente tintes y tubos de ensayo (c), que se enumeran en la Tabla de materiales. Siga las instrucciones de los tintes y el fluorómetro.
  2. Por otra parte, medir la concentración de ácidos nucleicos con un espectrofotómetro de UV a 260 nm.
    Nota: Una una lectura260 de 1.0 es equivalente a ~ 40 μg/mL solo ARN.
  3. Prueba calidad de RNA ejecutando el RNA en un analizador comercial de ácido nucleico (véase Tabla de materiales) o en un formaldehído/agarosa estándar gel 26.

4. RNA-seq análisis

  1. De la estirpe de RNA total, son 21 μl de 100 ng/μl de RNA en agua libre de ARNasa. Use 1 μl de este 21 μL para la concentración de RNA como el anterior. Presentar lo restantes 20 μl (2 μg) ARN total para un centro de secuenciación externa para el enriquecimiento de mRNA, preparación de la biblioteca específica de filamento (con ocho o más códigos de barras para multiplexación) y secuencia (véase Tabla de materiales). Alternativamente, localmente realizar enriquecimiento de mRNA y la preparación de la biblioteca y luego presentar la biblioteca para la secuencia.
  2. Piscina de ocho o más muestras de multiplexado y la secuencia en un carril de un secuenciador de última generación.
  3. Descargar el fichero FASTQ que contienen toda las secuencia de lecturas y lee el índice correspondiente. Descargar el archivo de texto que contiene los códigos de barras multiplex.
    Nota: Las lecturas de índice pueden estar presentes en un archivo separado de FASTQ. Coloque todos estos archivos en un directorio.
  4. Colocar el script que aquí, "fastq_pipeline.sh", en el mismo directorio. Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador.
    Nota: esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, la calidad de la secuencia de comandos recorta la lee la Lee los mapas del genoma y genera un archivo delimitado por tabuladores que contiene el número de lecturas por gen por cada muestra.
  5. Depositar los archivos FASTQ y crudos datos leer en Gene expresión Omnibus de NCBI antes publicación 27. Siga las instrucciones para "Datos de la secuencia de alto rendimiento de envío a GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importar los datos de cuenta leer en el ambiente estadístico de R y realizar análisis estadístico, utilizando el script de R que aquí, "time_course_script. R". Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador.
    Nota: Esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, este script importa los datos leídos, normaliza la Lee, identifica genes que cambian significativamente durante el curso del tiempo, realiza análisis de PCA y grafica la expresión de genes seleccionados.

Resultados

El curso del tiempo de hipoxia y RNA-seq análisis fueron realizados independientemente tres veces. Para examinar la reproducibilidad de las tres repeticiones, datos de expresión genética para todos los genes se analizan mediante análisis de componentes principales (ACP). La figura 2 muestra cómo cambian las muestras durante los dos primeros componentes principales, que en conjunto representan el 58.9% de la variabilidad. Este análisis indicó que cada c...

Discusión

En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Enclosed dry incubatorThermo ScientificMaxQ 4000Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter HolderMilliporeXX100253025mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuumEdwardsE-LAB 2The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flaskTo act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 inTygon38TTTwo pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flaskOpening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasksOpenings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mmSterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mmTygonE-3603One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discsMilliporeHAWP0250025 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettesFor measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubesOne for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogenFor freezing cells
acid-washed beadsSigmaG8772Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104For RNA column purification
Qiagen RLT bufferPrepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubesQiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPEQiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenincluded in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutionsQiagen79254The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDDQiagenincluded in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubesFor lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizerBiospec Mini-Beadbeater-24112011Keep in cold room
Bacto PeptoneBDDF0118for liquid YPD media
Bacto Yeast ExtractBDDF0886for liquid YPD media
glucoseFisherD16for liquid YPD media
Qubit assay tubesThermo FisherQ32856for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay KitThermo FisherQ32853for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay KitThermo FisherQ32855for measuring nucleic acid concentration
Qubit FluorometerThermo FisherQ33216for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis systemAgilentBioanalyzer 2100for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencerIlluminaHiSeq 2500for sequencing libraries
automated liquid handling systemWafergenApollo 324for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation KitWafergen400047for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library KitWafergen400039for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitterhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip commandhttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

Referencias

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