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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Vi presentiamo una comoda estrazione in fase solida accoppiata alla cromatografia liquida (HPLC) con rivelazione elettrochimica (ECD) per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina e due dei loro metaboliti nelle urine dei bambini. Identifichiamo anche il metabolita MHPG come potenziale biomarcatore per la diagnosi precoce del danno cerebrale per neonati.

Abstract

L'estrazione e l'analisi dei neurotrasmettitori della catecolamina nei fluidi biologici è di grande importanza nel valutare la funzione del sistema nervoso e malattie correlate, ma la loro misura precisa è ancora una sfida. Molti protocolli sono stati descritti per la misura di neurotrasmettitore da una varietà di strumenti, tra cui la cromatografia liquida (HPLC). Tuttavia, ci sono carenze, come funzionamento complicato o difficile da rilevare bersagli multipli, che non possono essere evitate, e attualmente, la tecnica di analisi dominante è ancora HPLC accoppiato con sensibile elettrochimica o rilevazione fluorimetrica, dovuto a sua alta sensibilità e buona selettività. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per il pretrattamento e la rilevazione delle catecolamine con cromatografia liquida ad alta pressione con rilevazione elettrochimica (HPLC-ECD) in campioni di urina reale degli infanti, utilizzando elettrofilate nanofibre composito composte di etere corona polimerici con polistirolo come adsorbente, noto anche come il metodo di estrazione (PFSPE) di fase solida fibra di pranzo. Vi mostriamo come urina campioni possono essere facilmente precleaned da una colonna di nanofibra-pranzo in fase solida, e come gli analiti nel campione possono arricchirsi rapidamente, sotto esame desorbita e rilevata su un sistema ECD. PFSPE semplifica notevolmente le procedure di pretrattamento per campioni biologici, permettendo per tempo in diminuzione, spese e riduzione della perdita di obiettivi.

Nel complesso, questo lavoro illustra un protocollo semplice e conveniente per estrazione in fase solida accoppiato ad un sistema di HPLC-ECD per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e due di loro metaboliti (3-metossi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e 3,4-diidrossi acido fenilacetico (DOPAC)) nelle urine dei bambini. Il protocollo è stato applicato per valutare le differenze di catecolamine urinarie e loro metaboliti tra neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani. Analisi comparativa ha rivelato una differenza significativa in MHPG urinario fra i due gruppi, che indica che i metaboliti delle catecolamine possono essere un indicatore importante candidato per la diagnosi precoce dei casi a rischio di danni di cervello in infanti.

Introduzione

Neurotrasmettitori della catecolamina e il loro contenuto di metabolita nei liquidi corporei possa influenzare la funzione neurale e compromettere l'equilibrio degli Stati di risposta a stimolo di una larga misura1. Anormalità può causare una varietà di malattie, quali pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e disturbi neurologici1,2. L'estrazione e la determinazione delle catecolamine nei liquidi corporei è significativo per la diagnosi delle malattie. Tuttavia, le catecolamine in campioni biologici presenti in basse concentrazioni e sono facilmente ossidate. Inoltre, sono molto difficili eluire a causa della grande quantità di interferenze in media3. Così, la rilevazione simultanea delle catecolamine nei fluidi biologici è ancora una sfida.

Ci sono state recensioni mostrando che le catecolamine urinarie possono essere una misura di stress, e che i loro livelli sono importanti indicatori biologici risponde alla stimolazione tattile elaborazione in neonati5. Secondo la ricerca, tutti gli infanti che hanno sofferto gli incidenti precoce sono a rischio per la ferita di cervello4,5,6, e danno può causare il rilascio anormale delle catecolamine e questioni connesse nei fluidi. Esistono tecniche di risonanza magnetica avanzata che possono rilevare danni al cervello in precedenti fasi7,8. Tuttavia, entro le prime 48 h, un processo anormale neurodevelopmental causerà danno cerebrale permanente che non sarà evidente in immagini mediche11. Inoltre, le risorse di alto costo e scarsa strumento, insieme ad altri fattori, rende impossibile per tutte le unità neonatale di avere accesso a queste tecniche di neuro-imaging per applicazioni specializzate. Tuttavia, l'uso di un biomarcatore facilmente accessibile e pratico (come le catecolamine e loro metaboliti) potrebbe superare queste carenze, e la proiezione di un biomarcatore nei fluidi umani può aiutare nella diagnosi precoce della lesione cerebrale e condurre per richiedere identificazione dei neonati che necessitano di neuroprotezione9. Le catecolamine nelle urine possono essere un indice semplice ed evidente, a causa della correlazione diretta tra la quantità di loro rilasciata fluidi e neuroactivity funzione.

Tra i fluidi biologici, campioni di plasma e del liquido cerebrospinale (CSF) non sono facili da ottenere tramite procedure esistenti traumatiche, e inoltre è molto difficile sbarazzarsi di disturbi causati dalla proteina adesiva e altre impurità, portando a un fastidioso e processo che richiede tempo di campionamento che è inadatto per il rilevamento di ripetute. Inoltre, per i bambini, è quasi impossibile ottenere i campioni in modo traumatico. Pertanto, campionamento urinaria è meglio di altre forme di campionamento, come è non invasivo, facile da usare e può essere fatto più volte. Campioni di urina sono abbondanti e facili da memorizzare e mostrerà grandi vantaggi rispetto alle altre forme di campioni biologici.

I principali metodi per quantificare le catecolamine nei fluidi biologici includono radioenzymic saggi10, enzimo-immunitario-sorbent test11, voltammetria12 e lente termica spettrometria13. Ma esistono carenze, quali operazioni complicate e difficili da rilevare bersagli multipli. Oggi, la tecnica di analisi dominante è ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)14, accoppiato con sensibili elettrochimico15 o fluorimetrico rilevazione16, a causa della sua alta sensibilità e buona selettività. Con tecnologia di spettrometria di massa tandem, come cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS) e liquido cromatografia/spettrometria di massa/spettrometria di massa (LC/MS/MS), l'analisi e la quantificazione dei neurotrasmettitori possono realizzare alto precisione e specificità17,18. Tuttavia, la tecnica MS richiede strumentazione costosa così come sostanzialmente qualificata manodopera, rendendo il metodo difficilmente applicabile universalmente nei laboratori più convenzionali. Sistemi HPLC-ECD sono comunemente dotate di laboratori più convenzionali e clinici e così sono diventati una scelta comune e buona per gruppi di ricerca da utilizzare per la determinazione chimica, ma richiedono il campione introdotto nel sistema per essere pulito e di Microscala volume19. Così, è di grande importanza per purificare e condensare il campione prima dell'analisi. Il metodo classico per la fase di purificazione è estrazione liquido-liquido14,15,20 e off-line estrazione in fase solida, tra cui colonna di allumina attivata21,22 e diphenylborate (DPBA) complessazione23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. hanno utilizzato resina polimerica chimicamente con etere corona come adsorbente per estrarre selettivamente le catecolamine da urina umana dal 200727. Inoltre, nel 2006, Haibo He et al. ha dimostrato un approccio facile sintesi per boronato affinità estrazione sorbente byutilizing un composito a base nanomagnetici nanomagnetici functionalizable silsesquioxane oligomerici poliedrici (POSS) e la sua applicazione all'arricchimento delle catecolamine nel urina umana (adrenalina e della noradrenalina, isoprenalina)28. Essi hanno anche approfittato dei nanomateriali a compiere l'opera, utilizzando una tecnologia chiamata nano-elettrofilatura e formando il materiale fibroso di polimero in scala nanometrica. Il processo di elettrofilatura può regolare il diametro e la morfologia spaziale allineamento del prodotto controllando la tensione di lavoro e cambiare il contenuto della soluzione di filatura insieme ad altri parametri29. Confronto con la cartuccia SPE convenzionale, le nanofibre elettrofilate sono molto adatte per estrarre e arricchire analiti bersaglio da una matrice complessa, come sono dotate di elevati rapporti di superficie-zona--volume di adsorbire gli analiti con alta efficienza, e presentano più facilmente controllato superficie proprietà chimiche, che permette il comodo attacco dei composti bersaglio. Queste caratteristiche li rendono buone scelte per adsorbenti SPE, riducendo notevolmente la fase solida e desorbimento quantità solvente30,31,32,33. Per le catecolamine in campioni di urina, le nanofibre elettrofilate composte da etere corona apolymeric con polistirene (PCE-PS) sono state utilizzate per estrarre selettivamente tre catecolamine (NE, E e DA)34. La carta indicata che l'etere corona selettiva adsorbito gli obiettivi di NE, E e DA, che si basava sulla sua corretta geometria per l'associazione di catecolamine via formando legami idrogeno. I risultati visualizzati l'etere corona materiale in modo efficace, eliminando altri composti interferenti contenute in campioni biologici. Ispirato da questo rapporto, un nuovo metodo è stato sviluppato per l'estrazione selettiva delle catecolamine mediante uso di elettrofilate nanofibre composito composte di PCE-PS.

In questa carta, il metodo segnalato precedentemente34 era migliorato e impiegato non solo per analizzare correttamente E, NE e DA, ma anche loro metaboliti, MHPG e DOPAC, nelle urine. Inoltre esploriamo nuove possibilità per il meccanismo del processo di adsorbimento. Il metodo Mostra soddisfacente efficienza di estrazione e selettività per gli cinque analiti, e il metodo è stato verificato nell'analisi delle urine da neonati ad alto rischio con lesione cerebrale perinatale e controlli sani.

Protocollo

È stato ottenuto il consenso informato da parte dei genitori, e l'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta per lo studio. Lo studio è stato effettuato in conformità al codice etico dell'associazione medica mondiale (dichiarazione di Helsinki) per esperimenti su esseri umani. Operatori sanitari di tutti i partecipanti forniti consenso per essere arruolati nello studio. Approvazione del comitato etico dall'ospedale di Zhongda, affiliazione con Southeast University, inoltre è stato ottenuto.

1. preparazione delle colonne e delle soluzioni necessarie per l'estrazione e la determinazione delle catecolamine

  1. Preparare la colonna PFSPE. Dividere 1-2 mg di nanofibre PCE-PS in 5-6 aliquote e utilizzare un bel tondino di acciaio con diametro di 0,5 mm per comprimerli ordinata nell'estremità della punta di una pipetta con un volume di 200 µ l.
  2. Preparare l'urina artificiale mediante pesatura 2,427 g di urea, acido urico g 0,034, 0,09 g di creatinina, citrato trisodico 0,297 g, 0,634 g di cloruro di sodio, 0,45 g di cloruro di potassio, 0,161 g di cloruro di ammonio, 0,089 g cloruro di calcio diidrato, 0,1 g di solfato di magnesio eptaidrato, 0,034 g di bicarbonato di sodio, ossalato di sodio 0,003 g, 0,258 g di solfato di sodio, diidrogenofosfato di sodio 0,1 g e sodio fosfato dibasico g 0,011 e sciogliere deionizzata le suddette sostanze chimiche in 200 mL di acqua.
  3. Preparare 2 mg/mL soluzione di riserva di diphenylborate (DPBA) soluzione dissolvendo 2 mg del composto in 1 mL di acqua distillata. Conservare la soluzione al buio a 4 ° C.
  4. Analita standard
    Nota: La struttura chimica e proprietà delle catecolamine sono instabili e si decompongono facilmente. Il processo di preparazione delle norme deve essere molto veloce e deve evitare l'esposizione alla luce solare diretta.
    1. Pesare 1,0 mg di NE, E, DA, MHPG, DOPAC e interno standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA in microcentrifuga separata 1,5 mL. Diluire la soluzione DHBA in acqua a 100 ng/mL prima dell'uso.
    2. Oscillano gli standard preparati al buio a una velocità elevata fino a analiti sciogliere completamente. Questo è lo stock di primario; conservare a-20 ° C per fino a parecchie settimane.
    3. Preparare le scorte di analita secondario 1.000 di ng/mL. Per NE, E, DA, DOPAC e MHPG, trasferire 5 µ l di ogni stock di analita primario in 4.975 µ l di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 5 mL e conservarlo al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. Preparare giornalmente queste soluzioni. Per DHBA, trasferire 5 µ l di magazzino primario in 4.995 µ l di acqua distillata in una provetta da centrifuga da 5 mL e conservarlo al buio separatamente a 4 ° C.
    4. Effettuare diluizioni maggiori con il brodo di analita secondario per creare una curva standard (ad es., supplementare tabella 2). Conservare soluzioni al buio a 4 ° C e preparare freschi ogni giorno.
    5. Verificare la tensione ottima del rivelatore ECD utilizzando lo standard stock con concentrazione appropriata. Variare la tensione per trovare un valore dove gli analiti sono il miglior aspetto di picco.
  5. Preparare eluente contenenti acido fosforico di 30%, 15% acetonitrile, e 55% di acqua distillata. Per 10 mL di solvente eluente, utilizzare 5,5 mL di acqua distillata e aggiungere 1,5 mL di acetonitrile e 3 mL di acido fosforico goccia a goccia in acqua.

2. preparazione dei campioni di urina reale e fase Mobile

  1. Hanno madri raccogliere la prima urina del mattino dei loro infanti usando tazze di urina asettica. Trasferire immediatamente i campioni in provette di polipropilene ed etichetta. Quindi, conservare i campioni in un congelatore a-20 ° C.
  2. Vortex e centrifugare i campioni urinari a 1.510 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) per sbarazzarsi della maggior parte delle interferenze del particolato. Scartare il sedimento e raccogliere i surnatanti per ulteriori esperimenti. Al fine di estrarre efficacemente analiti, procedere al pretrattamento PFSPE (passaggio 3) immediatamente dopo la centrifugazione.
  3. Preparare la fase mobile
    1. Preparare una bottiglia pulita, almeno 1 L. È riportata la composizione della fase mobile supplementare tabella 1; per la fase mobile 1 L, misura 6,7242 g di acido citrico, 93,06 mg di sale disodico di etilene diammina tetra acido acetico (EDTA), 7,02 g di sodio monometallici ortofosfato, 404,5 mg di sale di sodio acido 1-heptanesulfonic e 3,5 g di sodio idrato nella bottiglia. Aggiungere 40 mL acetonitrile e acqua distillata per 1.000 mL. Agitare e vibrare con ultrasuoni per 15 minuti fino a quando la questione della soluzione è tutto sciolto.
    2. Utilizzando un pH-metro con un elettrodo di vetro, regolare il pH della fase mobile su 4.21 con una soluzione satura di idrossido di sodio.
    3. Filtrare la fase mobile con una membrana di 0,45 µm polivinilidene fluoruro microporosa e un dispositivo di aspirazione per sbarazzarsi delle impurità.
    4. Utilizzare la vibrazione ultrasonica per 15 min per degassare la fase mobile ogni volta prima dell'uso.

3. PFSPE estrazione ed analisi HPLC

  1. Attivare le nanofibre. Premere 100 µ l di metanolo e 100 µ l di acqua in sequenza attraverso la colonna PFSPE utilizzando una siringa da 5 mL in maniera lenta, goccia a goccia.
  2. Mix 100 µ l di urina di esempio con soluzione DPBA di 100 µ l 2 mg/ml e 30 µ l 100 ng/ml di soluzione DHBA (IS, standard interno) in una provetta 0,5 mL EP, quindi trasferire la soluzione mista alla colonna PFSPE. Premere la soluzione campione miscelato attraverso la colonna PFSPE con una siringa da 5 mL di plastica tenuta di gas usando la forza della pressione dell'aria.
  3. Filtrare la colonna tre volte caricando 100 µ l di soluzione DPBA (2 mg/mL) nella colonna SPE e spingere la soluzione lentamente attraverso la cartuccia con pressione d'aria utilizzando una siringa di plastica da 5 mL tenuta di gas.
  4. 50 µ l di eluente sulla colonna PFSPE di carico e spingerlo attraverso la colonna, raccogliendo l'eluato con un tubo di 0,5 mL EP.
  5. Accendere il degassificatore HLPC a degassare l'aria nel sistema. Prima dell'analisi del campione, il sistema dovrebbe funzionare per più di 0,5 h con la fase mobile per equilibrare e ridurre il rumore della linea di base. Vedere complementare la tabella 1 Mostra i parametri di configurazione del sistema HPLC.
  6. Campione 20 µ l di eluato utilizzando un campionatore automatico e poi iniettare il sistema HPLC-ECD.
  7. Quando le piste sono state completate, spegnere la cellula di rilevamento utilizzando l'interfaccia del rivelatore. NON spegnere il cellulare con l'interruttore sul retro del rilevatore, poichè questo potrebbe danneggiare lo strumento.
  8. Modificare manualmente la composizione della fase mobile 10% metanolo e 90% di acqua. Correre per almeno 30 min. Quindi, modificare manualmente la fase mobile HPLC-metanolo. Eseguire per circa 15 min proteggere il sistema in metanolo. Per eseguire questo passaggio dopo il tempo di esercizio raccomandato potrebbe comportare danni alla colonna e il rivelatore. Spegnere il flusso, quindi spegnere il degasatore.

4. Phenylboronic Acid cartucce (PBA) estrazione

Le procedure di estrazione di PBA cartuccia erano simili al regime a Kumar et al. (2011) 25. tutte le soluzioni sono spinti attraverso la cartuccia PBA (100 mg, 1 mL) con aria forzata da una siringa.

  1. Condizionare la cartuccia con 1 mL 80: 20 acetonitrile-acqua (v/v) contenente 1% di acido formico e 1 mL di tampone fosfato 50 mM (pH 10) in sequenza.
  2. Premere il campione di urina nel buffer (1 mL di urina e 2 mL di tampone fosfato, pH 8.5) attraverso la cartuccia PBA.
  3. Lavare la cartuccia con 1 mL 50: 50 v/v acetonitrile di tampone fosfato (10 mM, pH 8.5).
  4. Eluire la cartuccia con 1 mL di acetonitrile-acqua (80: 20 v/v) contenente 1% di acido formico.

5. identificazione e quantificazione delle catecolamine

  1. Linearità
    1. Diluire lo stock di analiti secondario con urina artificiale a sei concentrazioni (1,5, 3, 12, 25, 50 e 100 ng/mL); il volume di diluizione dell'urina artificiale segue supplementari tabella 2. Fare tre campioni paralleli con ogni concentrazione per ottenere 18 analita soluzioni sperimentali per la costruzione di curve di calibrazione.
    2. Diluire il magazzino secondario DHBA con urina artificiale 10 volte per ottenere 100 ng/mL di soluzione sperimentale.
    3. Pretrattare tutte le soluzioni di analita da 5.1.1, secondo la fase 3 (procedure di estrazione di PFSPE). Come nel passaggio 3, iniettare 20 µ l di ciascun eluato corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere un cromatogramma HPLC.
    4. Costruire le curve di calibrazione degli cinque analiti tracciando il rapporto tra area di picco (obiettivi/IS) come asse Y contro il rapporto delle concentrazioni (obiettivi/IS) come asse X, come illustrato nella Figura 1 supplementare.
  2. Valore LOD e LOQ per sensibilità
    1. Iniettare 20 µ l di urina artificiale vuoto nel sistema HPLC-ECD (come nel passaggio 3), per ottenere il cromatogramma HPLC del campione.
    2. Nel cromatogramma da 5.2.1, raccogliere 11 valori del segnale in bianco e calcolare il valore medio Xb e la deviazione standard Sb. Calcolare il minimo segnale di una sostanza che può essere rilevato ad un certo livello di fiducia, XL, come XL = Xb+ K * Sb (K è il coefficiente determinato dal livello di confidenza, Sb riflette il livello di rumore della Metodo di misurazione e il livello di rumorosità della macchina). Così, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S sta per il valore di pendenza della curva di lavoro).
    3. Definire un S/N di 3:1 (K = 3) come il limite di rilevabilità (LOD) e un S/N di 10:1 (K = 10) come il limite di quantificazione (LOQ).
  3. Valutare i recuperi
    1. Preparare i campioni di urina reale e appuntiti. Diluire lo stock di analiti secondario con urina reale a tre concentrazioni (5, 50, 100 ng/mL) per ottenere i campioni di urina a spillo. Preparare tre campioni paralleli per ogni soluzione di analita. Contare la concentrazione a spillo come la quantità di composti target a spillo nel campione di urina. Definire questo valore come uns.
    2. Stock DHBA diluito a 100 ng/mL, come descritto al punto 5.1.2.
    3. Elaborare ogni soluzione di esempio da 5.3.1 secondo la fase 3 (procedure di estrazione di PFSPE) e iniettare il 20 µ l di ogni eluente corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere il risultato di cromatogramma. Il valore di analiti verrà conteggiato come una quantità di composti target quantificati nel campione di urina a spillo. Definire questo valore come unt.
    4. Iniettare 20 µ l di campione di urina nel sistema HPLC-ECD (come al punto 3) per ottenere il risultato di cromatogramma. Il valore di analiti verrà conteggiato come una quantità iniziale di composti target quantificati nel campione di urina. Definire questo valore come unio.
    5. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. La percentuale di recupero è stimato come recupero metodologico % = (unat - aimi) × 100 / (unas). I valori medi sono riportati nella tabella 1.
  4. Valutare l'imprecisione
    1. Preparare i campioni di urina artificiale a spillo per 5, 50 e 100 ng/mL concentrazioni come descritto al punto 5.3.1. Preparare sei campioni paralleli per ogni soluzione di analita. Preparazione di campioni sperimentali freschi ogni giorno.
    2. Diluire stock DHBA a 100 ng/mL come descritto al punto 5.1.2.
    3. Valutare la precisione intra-giorno (n = 6). Elaborare ogni soluzione del campione in 5.4.1 secondo passaggio 3 e iniettare il 20 µ l di ogni eluente corrispondente nel sistema HPLC-ECD per ottenere il cromatogramma. Fare la stessa operazione sei volte nello stesso giorno.
    4. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. Sotto la stessa concentrazione dello stesso composto, la deviazione standard relativa (RSD) dei sei saggi in un giorno è determinata come precisione intra-day. I valori medi sono riportati nella tabella 1.
    5. Valutare la precisione inter-giorno (n = 6). Allo stesso tempo ogni giorno nei sei giorni sequenziali, preparare i campioni di urina artificiale a spillo per tre concentrazioni di 5, 50, 100 ng/mL, come in 5.4.1 e 5.4.2. ed elaborare ogni soluzione di campione di analita secondo passaggio 3.
    6. Iniettare il 20 µ l di ciascun eluato corrispondente da 5.4.5 nel sistema HPLC-ECD per ottenere risultati di cromatogramma ogni giorno. Calcolare la quantità di composti di destinazione nei campioni dall'equazione della curva standard. Precisione Inter-giorno è espressa dalla RSD della quantità dai campioni di urina artificiale a spillo alle tre concentrazioni saggi in sei giorni sequenziali. I valori medi sono riportati nella tabella 1.

Risultati

Questo protocollo è un metodo semplice e conveniente di PFSPE per pretrattare i campioni di urina e arricchire le cinque catecolamine per il rilevamento tramite un sistema di HPLC-ECD; un diagramma del processo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo comprende principalmente quattro passaggi-attivazione, caricamento, risciacquo e medicati - accoppiato con una piccola quantità di nanofibre PCE-PS e un dispositivo semplice estrazione in fase solida. La mo...

Discussione

Il metodo PFSPE proposto nel presente documento può essere significativi e significativi per quanto riguarda la sua rapidità, semplicità e convenienza. Gli adsorbenti utilizzati nel protocollo sono le nanofibre elettrofilate, che hanno elevati rapporti superfici di zona-volume e assorbono gli analiti con alta efficienza. La procedura solo ha bisogno di pochi milligrammi di nanofibra e un piccolo volume di solvente eluente e non richiedono un passaggio di evaporazione per concentrare gli analiti. Qui, abbiamo presentat...

Divulgazioni

Gli autori certificano che non esiste alcun conflitto di interessi con qualsiasi organizzazione finanziaria per quanto riguarda il materiale descritto in questo articolo.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dal National Foundation Science of China (No.81172720, n. 81673230), sociale sviluppo ricerca programma di Jiangsu Province scienza e dipartimento di tecnologia (No. BE2016741), scienza & tecnologia progetto di Cina Amministrazione generale della supervisione della qualità, ispezione e quarantena (2015QK055), il programma di progetto aperto del laboratorio chiave di sviluppo del bambino e l'apprendimento della scienza del Ministero dell'istruzione, Southeast University (CDLS-2016-04). Riconosciamo sinceramente Song Yuan e Ping Liu, che ci ha aiutato nella raccolta di campioni.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipcolumn to contain nanofibers
PCE-PS nanofibersmaterial for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter)fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml)compress solution into the end of the tip
methanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408complex reagent
norepinephrine(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyte
epinephrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyte
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781interior label
acetonitrileSigma-Aldrich.Inc75-05-8eluriant and mobile phase
phosphoric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriant
uric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2artifical urine
creatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5artifical urine
trisodium citrateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3artifical urine
KClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7447-40-7artifical urine
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9artifical urine
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326artifical urine
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0artifical urine
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6artifical urine
disodium hydrogen phosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4artifical urine
ureaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6artifical urine
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5artifical urine
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artifical urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8artifical urine
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0artifical urine
citric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9artifical urine and mobile phase
EDTA disodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6mobile phase
monometallic sodium orthophosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6mobile phase
sodium hydroxideSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column)Aglilent12102018PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm columnDikma5020-06731HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACauto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid ChromatographyShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detectorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60Adetector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAsurface and porosity analyzer 

Riferimenti

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy?. Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress?. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

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