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Resumo

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

Resumo

Vamos demonstrar um método usando Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo para estudar a interação microbiana. Micróbios são introduzidos através da dieta, tornando o intestino o local principal para a doença. O nematoide intestino estrutural e funcionalmente imita os intestinos de mamíferos e é transparente, tornando-se passível de estudo microscópico da colonização. Aqui nós mostramos que patógenos podem causar doenças e morte. Somos capazes de identificar microbianos mutantes que mostram a virulência alterada. Sua resposta inata conservada a estresses bióticos faz c. elegans , um excelente sistema para sondar as facetas de interações imune inata do hospedeiro. Mostramos que hosts com mutações no gene oxidase dual não podem produzir espécies reactivas de oxigénio e são incapazes de resistir insulto microbiano. Vamos demonstrar ainda mais a versatilidade do ensaio apresentado sobrevivência, mostrando que ele pode ser usado para estudar os efeitos de inibidores do crescimento microbiano. Este ensaio também pode ser usado para descobrir os fatores de virulência de fungos como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, bem como fornecer uma oportunidade para descobrir novas interações do anfitrião-micróbio. O design deste teste se presta bem para alta taxa de transferência do inteiro-genoma telas, enquanto a capacidade de vermes de crio-preservação para uso futuro torna um modelo todo animal rentável e atraente para estudar.

Introdução

C. elegans tem sido usado como um organismo modelo poderoso para mais de 50 anos. Na década de 1960, o biólogo Sul-Africano Sydney Brenner foi pioneira no uso de c. elegans , para estudar o desenvolvimento neuronal, pavimentando o caminho para uma longa linhagem de cientistas para estudar os vários aspectos da biologia celular e animal em nematoides. Esta linhagem inclui Prêmio Nobel laureates Craig Mello e Andrew Fire para o seu trabalho de RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston por seu trabalho no desenvolvimento de órgãos e apoptose2,3,4e Martin Chalfie por seu trabalho na proteína fluorescente verde5. Embora este organismo modelo tem sido tradicionalmente usado para estudar a biologia molecular e do desenvolvimento, nos últimos 15 anos, os pesquisadores começaram a usar c. elegans para investigar a biologia de vários patógenos humanos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureuse Salmonella typhi6,7,8,9,10. Estes estudos revelaram que muitos dos mecanismos envolvidos na interação humano-patógeno são conservados em nematódeos, mas também que existem alguns mecanismos de imunidade que são exclusivos para este organismo de modelo11,12. Na natureza, c. elegans encontra uma variedade de ameaças de patógenos ingeridos presentes no solo e isso proporcionou uma forte pressão seletiva para evoluir e manter um sofisticado sistema imune inato no seu lúmen intestinal. Muitos dos genes e mecanismos envolvidos na proteção do lúmen intestinal são orquestrados por elementos altamente conservada que também existem em maior mamíferos11,13. C. elegans , portanto, representa um grande modelo para estudar a patógenos gastrointestinais como a Salmonella typhi14, Shigella boydii15ou Vibrio cholera16.

Aqui destacamos a versatilidade notável de c. elegans como um host de modelo para o estudo de agentes infecciosos, tais como c. albicans. C. elegans como um anfitrião modelo permite o rastreio de alto rendimento de virulência que é menos caro e demorado do que um modelo do rato, que é comumente usado para estudar a candidíase42.

Neste estudo, mostramos que este modelo e o ensaio de sobrevivência de assosiated podem ser confiável usados para estudar inata efetores hospedeiro imune importantes para combater infecções, determinantes do patógeno que impulsionam a virulência, e compostos farmacológicos que podem intervir na patogênese. Diferentes tipos de ensaios descritos anteriormente, este método fornece um meio de exposição a um agente patogénico a estudar sobre a vida do animal, desde a fase larval para a idade adulta, ao invés de apenas idade adulta a morte de43,44. Em resumo, nosso c. elegans - modelo de c. albicans é uma ferramenta versátil e poderosa que pode ser usada não somente para estudar as bases genéticas que levam a infecção e imunidade, mas também para identificar novos compostos para a intervenção terapêutica.

Protocolo

1. preparação de nematódeo crescimento médio (NGM)

  1. para 1 L de mídia, combinar agar 20g, fonte de nitrogênio orgânico de 2,5 g (por exemplo, bacto peptona) e 3 g de cloreto de sódio em um frasco de 2 L. 975 ml de água estéril.
    1. Adicionar em uma barra de agitação estéril. Se usando um dosador automático de mídia, tubulação de autoclave e mídia por 15 min; mídia deve ser autoclavada para mais se for feito um maior volume.
  2. Conjunto de mídia na placa de agitação e deixe arrefecer.
    1. Uma vez que a mídia está quente ao toque (aproximadamente 60 ° C) em condições de esterilidade, adicione 1 mL de 1m MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25ml de KPO 4 e 1 mL de colesterol de 0,5% em etanol.
    2. Despeje mídia (manualmente ou por bomba automática) sob fluxo laminar em 35 x 10 mm pratos de petri estéril. Deixe para secar sob o capô, por 1-2 dias antes do uso.
      Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar a contaminação.

2. Fazendo um Worm Pick

  1. corte um pedaço de 1,5 cm de fio de alumínio. Introduza cuidadosamente cerca de 0,5 cm de comprimento na ponta de uma pipeta Pasteur.
    1. Usando um bico de Bunsen ou lâmpada de álcool, derreter a ponta da pipeta de vidro, lentamente, girando-o na chama até que o fio é firmemente aderido a pipeta, sem comprometer a forma original da ponta da pipeta.

3. Preparação da cultura de e. coli

  1. utilizando uma ansa estéril, inocular a colônia única da estirpe de Escherichia coli OP50 em 200 mL de caldo de Luria. Incubar durante uma noite com tremor em 37 ° C.
  2. a cultura do líquido está pronta para o uso no dia seguinte e podem ser armazenada a 4 ° C, quando não estiver em uso.
    Nota: A cepa de Escherichia coli, OP50, é usada como fonte de alimento para c. elegans. Esta cultura pode ser utilizada para até vários meses, quando armazenado a 4 ° C.

4. Essencial manutenção de c. elegans

  1. semente preparado placas de ágar NGM com e. coli manchando aproximadamente 50-100 µ l de cultura líquida de OP50 preparada no centro da placa.
  2. Placas de cobre e deixe-os secar à temperatura ambiente por 24 h. Depois de seco, coloque as placas a 37 ° C durante a noite para crescimento rápido ou manter à temperatura ambiente, se for desejado crescimento mais lento.
  3. Adicionar minhocas à placa por qualquer " a fragmentação, " (ver protocolo passo 5 " Chunking e pegando vermes "), pegar vermes individualmente ou colocação worm ovos diretamente sobre a placa (ver protocolo passo 6 " ovo preparação ").

5. CHUNKING e pegando vermes

Nota: " Chunking, " refere-se a uma prática que é comum em manutenção de c. elegans. Isto envolve cortar uma secção da placa de ágar de NGM que contém vermes e transferir esta peça em um prato novo, assim também transferência de grande quantidade de vermes no processo. Contaminação também pode ser cortada da placa dessa maneira. Ao escolher os vermes, é importante manter a integridade do ágar, pois vermes podem ser perdidos em buracos de agar. Além disso, é importante para permitir que o escolhido para esfriar antes de tocar no prato para evitar derretimento o ágar ou queimando os vermes.

  1. Para transferir rapidamente grandes quantidades de vermes nas novas chapas, corte um pedaço de ágar NGM contendo os sem-fins selecionados usando uma espátula. Retire o pedaço e coloque a cara no chão à beira do gramado de OP50 num prato novo.
  2. Transferência individualmente conforme descrito abaixo, na etapa de protocolo 8.2, vermes " ensaio de sobrevivência, " usando um verme escolher. Chama o fio no worm escolher até o vermelho. Removê-lo da chama e deixe-a esfriar por alguns segundos.
  3. Usando o fio sobre a palheta, lixe ligeiramente o gramado da cultura OP50 crescido na placa nova, cobrindo o fio sobre o pick.
  4. a cultura viscosa cobrindo a ponta do fio faz vermes furar a ponta da palheta, assim suavemente pegar vermes selecionados usando um movimento percorrendo.
  5. Uma vez selecionados vermes reunidos, colocá-los em um prato novo swiping suavemente a cultura através de agar. Coloque o fio na chama para remover o restante cultura sobre o pick.

6. Preparação de ovos

  1. Coloque aproximadamente 20 animais adultos (aproximadamente 2-3 dias após a eclosão, quando cultivada a 20 ° C) por escolher ou fragmentação conforme descrito na etapa de protocolo 5, " Chunking e escolhendo Worms, " em um prato, inoculado com 50 µ L da estirpe de Escherichia coli, OP50.
  2. Para recolher os ovos, inundar a placa com 10 mL de tampão de M9 após 1-2 dias. Usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar ovos presos OP50 ou animais adultos. Recolher todo o líquido contendo os ovos e adultos.
  3. Transferência M9 e OP50 solução em um 15ml cónico tubo. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 2.100 x g por 2 min.
  4. Aspire aproximadamente 9 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento OP50.
  5. Resuspenda o pellet em 2 mL de água estéril, 1 mL de água sanitária e 1 mL de NaOH 0,25 de M.
  6. Misture suavemente por inversão, até que a maioria (aproximadamente 70 por cento) dos animais adultos aparece lisada; normalmente, ovos permanecem intactos durante este tratamento de lixívia curto por causa de seu escudo. Centrifugar o tubo cônico a 990 x g por 2 min.
  7. Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender o pellet em 10 mL de tampão de M9.
  8. Centrifugar o tubo cônico em 990 x g por 2 min. aspirado sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com 200 µ l de tampão de M9.
    Nota: A preparação do ovo pode exigir vários ensaios. Os ovos podem ser destruídos se eles são expostos para branquear por muito tempo. Se os ovos não eclodem, diminuir a concentração de água sanitária em solução ou diminuir a duração da exposição para branquear.

7. Configuração de placa de infecção

  1. dispensar 3-5 mL de YPD num tubo de ensaio estéril e inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans utilizando uma ansa estéril.
    1. Colocar o tubo sobre um tambor rotatórios para aproximadamente 16-18 h em 30 ° C.
  2. Rótulo um 1,5 mL microcentrífuga tubo para conter a c. albicans e outra para conter OP50. Registrar o peso de cada tubo vazio.
    1. Lugar 500 µ l de noite cultura de c. albicans em tubo rotulado de c. albicans e 1.500 µ l da cultura OP50 durante a noite (a partir de passo 3.1) no tubo rotulado OP50.
    2. Centrifugar durante 10 minutos a 16.100 x sobrenadante de g. aspirado sem sedimento perturbador.
    3. Re-suspender cada pellet com 500 µ l de água estéril. Centrifugar durante 5 min à 16.100 g. x
    4. Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Gravar o peso final dos tubos de microcentrífuga.
    5. Determinar o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final.
  3. Usando água estéril, Ressuspender o sedimento de c. albicans a 10 mg/mL e a pelota OP50 a 200 mg/mL. Fazer uma infecção mestre mix pela combinação de 7 µ l de água estéril, 2,5 µ l de OP50 cultura, 0,5 µ l de cultura de c. albicans e 10 µ l de uma solução de 50 mg/mL de estreptomicina.
    1. Para placas de controle, criar uma mistura de mestre, substituindo o volume da cultura de c. albicans com água estéril. Sementes de 20 µ l de mistura de infecção ou solução de controle OP50 nas chapas de centro de NGM usando uma micropipeta.
      Nota: Aproximadamente 100 minhocas são necessários para determinar a significância estatística durante a análise. Este ensaio é executado normalmente em triplicado. Assim, feita uma 3.2 x mistura de infecção, bem como um 3.2 x solução de controle. Estas misturas são feitas para serem ligeiramente mais de 3 x o original para garantir que um total de 20 µ l é semeada em cada prato, permitindo espaço para erros. Esta mistura de mestre é criada porque a faringe do worm é muito pequena, durante os estágios larvais iniciais (L1-L3) para consumir c. albicans. Para exposição a agentes farmacológicos tais como fluconazol ( Figura 3B), o agente é introduzido à mistura de infecção. A concentração do agente é determinada empiricamente. Por exemplo, na Figura 3B, 50 µM Fluconazole é representada, no entanto 0, 12.5, 25, 50 e 100 µM fluconazol também foram testados usando o mesmo protocolo.

8. Análise do fenótipo deformado região Anal (Dar) e sobrevivência do ensaio

  1. Visualize o fenótipo de Dar
    Nota: Dar é melhor visualizado na fase L3 e além. Dar apresenta-se como uma pequena saliência na região anal post do worm ( Figura 2A), que se torna mais proeminente ao longo do tempo.
    1. Confirmar se um animal tem Dar tocando rapidamente a placa no palco do microscópio dissecação; animais sem Dar vontade de mover para trás imediatamente, enquanto animais com Dar serão necessário repetidas rodadas de escutas para reverter sua direção, ou eles Não vai fazê-lo em tudo.
  2. Ensaio de sobrevivência
    1. preparação de ovo completo conforme descrita anteriormente na etapa de protocolo 6, " ovo preparação ". Conte com o ovo no âmbito de dissecação e diluir a solução de ovo com M9 até que seja alcançada uma concentração de aproximadamente 5-6 ovos saudáveis por µ l. Utilizando uma pipeta, dispensar 20 µ l da amostra contendo aproximadamente 30 ovos na chapa de NGM preparado, na área entre a cultura bacteriana e do lado da placa (ovos e comida de verme, OP50, estão em dois pontos distintos).
      2. Incubar as placas a 20 ° C, durante 48 h de
    2. . Sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes vivos e mortos adultos em cada prato, bem como o número de minhocas com a Dar. Gravar a porcentagem com Dar.
    3. Considerar um animal morto, se ele não responder a ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou toque na placa.
    4. Todos os dias, transferir germes adultos restantes por colheita conforme descrito na etapa de protocolo 5, " Chunking e escolhendo Worms, " em um prato novo de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realizar um ensaio de sobrevivência do número de vermes vivos, mortos e desaparecidos de rastreamento de cada dia.
      Nota: Este ensaio poderá ser executada por duas semanas, começando com a preparação do ovo. Além disso, a solução de ovo não deve ser dispensada para a cultura bacteriana, como a solução pode conter vestígios de água sanitária que pode matar o OP50. A solução também deve ser dispensado de aproximadamente 0,5 cm da borda da placa, como ovos podem ficar preso entre os lados da placa e o ágar-ágar. Além disso, devido à rápida proliferação de vermes, transferência de adultos nas novas chapas é fundamental para separá-los dos seus descendentes.
  3. Sobrevivência analisar
    1. analisar resultados usando software de análise de curva de sobrevivência (consulte a lista de materiais).
    2. Compare sobrevivência curvas usando o método Grehan-Breslow-Wilcoxon (supondo que os dados dos primeiros tempos de sobrevivência são mais precisos do que tempos mais tarde, peso adequadamente os dados) bem como de ferramentas estatísticas de Logrank 45.
      Nota: Por exemplo, na Figura 4B -C, a sobrevivência das minhocas tratados com mutante c. albicans é comparada com aqueles tratados com controles de tipo selvagem isogénicas ou complementarystrains.

Resultados

Um ensaio de patogênese (Figura 1) usando a c. albicans e c. elegans tem sido descrito anteriormente por nosso laboratório17,18 e outros laboratórios19,20. Demonstramos a acessibilidade de usando o c. elegans para estudar a virulência de c. albicans , mostrando que as células de c. albicans sã...

Discussão

Os métodos para análise do c. elegans infecção e sobrevivência sobre exposição de vida a c. albicans que descrevemos podem ser modificados para testar outro patógeno. Culturas líquidas de outra bactéria ou fungo podem ser feitas e alimentadas a c. elegans de forma semelhante. Além disso, infecções seriais podem ser analisadas primeiro, expondo a larva de um patógeno conforme descrito, e depois transferir os animais para uma nova placa contendo um patógeno separado depois de ating...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado no e apoiado pelo Instituto Politécnico de Worcester.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar (granulated, bacterilogical grade)Apex BioResearch Products20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted MicroscopeAxiovision Zeiss
Bacto-PeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans strain Bli-3Caenorhabditis Genetics CenterBli-3(e767) CB767
Calcium ChlorideFisher ScientificBP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%SigmaC8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)GraphPad Software
LB Broth (Miller's)Apex BioResearch Products11-120
Magnesium SulfateFisher Scientific10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)Falcon353001
Potassium Phosphate monobasicSigmaP0662-500G
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-1
Sodium PhosphateFisher ScientificBP332-500
Wildtype C. albicans SC5314ATCCSC5314
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2

Referências

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