Resurrección de latente Daphnia magna: protocolo y aplicaciones

Resumen

Estudios a largo plazo son esenciales para entender el proceso de evolución y los mecanismos de adaptación. Generalmente, estos estudios requieren compromisos más allá de la vida en tiempo de los investigadores. Aquí, un método de gran alcance se describe que avanza dramáticamente la colección de datos para generar datos longitudinales en los sistemas naturales.

Resumen

Estudios a largo plazo permiten la identificación de los procesos eco-evolutivo que se producen durante períodos de tiempo extendidos. Además, proporcionan datos empíricos que pueden utilizarse en la modelización predictiva para la previsión de respuestas evolutivas de los ecosistemas naturales a los cambios ambientales futuros. Sin embargo, excepto algunos casos excepcionales, estudios a largo plazo son escasos debido a las dificultades logísticas asociadas con el acceso a muestras temporales. Dinámica temporal con frecuencia se estudia en el laboratorio o en experimentos de mesocosmos controlados con estudios excepcionales que reconstrucción la evolución de las poblaciones naturales en la naturaleza.

Aquí, se provee un procedimiento de funcionamiento de estándar (SOP) para revivir o resucitar latente Daphnia magna, una especie de clave de zooplancton generalizada en los ecosistemas acuáticos, para avanzar considerablemente en la colección de datos longitudinales en sistemas naturales. El campo de la ecología de la resurrección fue definido en 1999 por Kerfoot y compañeros de trabajo, aunque los primeros intentos en eclosión diapausa zooplancton huevos datan de la década de 1980. Desde papel seminal de Kerfoot, la metodología de resucitar especies de zooplancton se ha aplicado cada vez más frecuentemente, aunque propagada entre los laboratorios sólo a través de transferencia de conocimiento directo. Aquí, se describe una compensación que proporciona un protocolo paso a paso en la práctica de resucitar latente Daphnia magna huevos.

Dos estudios claves son siempre en que la respuesta de la aptitud del Resucitado Daphnia magna las poblaciones se mide el calentamiento, aprovechando la posibilidad de estudiar poblaciones históricas y modernas en la configuración del mismo. Finalmente, se discute la aplicación de tecnologías de secuenciación de próxima generación a etapas restablecidas o aún latentes. Estas tecnologías proporcionan una potencia sin precedentes en los procesos y mecanismos de la evolución si se aplica a poblaciones que han experimentado cambios en la presión de selección en el tiempo de la disección.

Introducción

Estudios a largo plazo son fundamentales para la comprensión de procesos ecológicos y evolutivos en la naturaleza y en la evaluación de cómo las especies responderan a y persisten durante el cambio del medio ambiente¹. Esto es debido a procesos eco-evolutivo ocurren a través de generaciones y cambios en el ambiente durante largo tiempo se extiende. Además, estudios a largo plazo proporcionan datos empíricos claves que mejoran la exactitud del modelo predictivo para pronosticar las respuestas evolutivas de los ecosistemas naturales a cambios ambientales². La precisión de estos modelos es fundamental para implementar estrategias de manejo y conservación para preservar la biodiversidad y los servicios ecosistémicos.

Excepto algunos casos excepcionales (por ejemplo, Galápagos Darwin pinzones algas de³ y⁴), estudios a largo plazo son en gran parte limitados a especies con el tiempo de generación corto que puede ser propagado en el laboratorio^{5,6 , 7 , 8}. por lo tanto, los procesos que sustentan la dinámica evolutiva permanecen fuera de alcance. Debido a dificultades logísticas asociadas con el acceso a las muestras temporales, datos empíricos se estudian con más frecuencia en un espacial que en un contexto temporal, y procesos eco-evolutivo temporales son inferidos o modelados de datos espaciales. Este enfoque se conoce como sustitución de 'espacio de tiempo'⁹, por el que se adopta el espacio como un sustituto para el estudio de la dinámica evolutiva temporal. La principal limitación de la sustitución de 'espacio de tiempo' es que las tasas de adaptación a diferentes escalas espaciales difieren de variación temporal en la misma población; por lo tanto, deducciones basadas en reemplazo de tiempo con el espacio son parciales¹⁰.

Una poderosa alternativa que permite estudiar la dinámica evolutiva de los ecosistemas naturales con el tiempo es el análisis de los cambios ecológicos y genéticos en especies produciendo etapas latentes¹¹. Estas etapas latentes se acumulan de forma estratificada archivos biológicos que pueden ser datados con precisión y paleolimnologically caracteriza^12,13. Importante, estas etapas latentes pueden ser resucitadas y utilizadas en experimentos de laboratorio, donde su respuesta evolutiva a los cambios ambientales puede medirse directamente. Poblaciones históricas pueden compitió contra sus modernos descendientes evolucionados para estudiar cambios de aptitud y la función de genes evolucionando en sintonía con el cambio ambiental^14,15,16.

Etapas latentes incluyen semillas, quistes, esporas y los bancos de huevos. Aunque los primeros estudios en reanimación huevos latentes remonta a los finales del decenio de 1980 de¹⁷y un puñado de estudios han aplicado esta técnica en el decenio de 1990 temprano^18,19, el campo de la ecología de la resurrección ha sido formalmente establecido por el artículo seminal de Kerfoot y colaboradores en 1999²⁰. Esta práctica ha sido aplicada principalmente en reconstrucciones paleolimnológicos de especies de agua dulce^17,21,22. Sin embargo, una concesión aún no está disponible. Aquí, se proporciona una descripción paso a paso el protocolo de resurrección aplicada a los huevos latentes de las especies de zooplancton Daphnia magna , de la toma de muestras de sedimentos para el establecimiento de cultivos clonales de crías. Pasos del SOP que son fácilmente transferibles a otras especies de Dafnia, así como medidas que requieran optimización adicional, se discuten.

Daphnia son zooplankters de agua dulce presentes en la mayoría de los hábitats lóticos²³ . Especies de Daphnia son cualquiera obligan partenógenos asexual o cíclica. D. magna es un parthenogen cíclica que reproduce clonalmente bajo condiciones ambientales favorables²⁴. Cuando se deterioran las condiciones ambientales, ocurre la producción masculina y recombinación sexual conduce a la formación de huevos fertilizados que entran en un estado de latencia que protege contra el ambiente por un caso de quitina llamado ephippium. Una proporción de estos huevos latentes de la portilla cuando vuelven las condiciones ambientales favorables. Sin embargo, una gran proporción de lo Banco de óvulos latentes nunca tiene la oportunidad de eclosionar y así construir archivos biológicos con el tiempo. Etapas latentes permanecen enterradas en el sedimento de lagos y estanques y pueden ser resucitadas para el estudio de la dinámica evolutiva durante períodos de tiempo extendidos. Porque los huevos latentes de D. magna están el resultado de la recombinación sexual, son una buena representación de la diversidad genética natural de la especie²⁵. Por otra parte, se puede mantener mediante reproducción clonal en el laboratorio. Estas características proporcionan la ventaja única de organismos modelo isogénicas, conservando la diversidad genética natural.

Dos estudios claves se presentan para demostrar las ventajas de comparar directamente los descendientes históricos y modernos de la misma población de D. magna experimentando presiones de selección ambiental con el tiempo. D. magna especímenes fueron resucitados del lago anillo (Dinamarca), un poco (5 m de profundidad, superficie 22 hectáreas) estanque mixto que ha experimentado un aumento en la ocurrencia de temperatura y olas de calor promedio en el tiempo. D. magna (sub) poblaciones fueron resucitadas a lo largo de este gradiente temporal que abarca 60 años (1960-2005) y estudios para investigar la respuesta evolutiva al calentamiento de la temperatura. En el primer estudio en un experimento de jardín común, cambios en rasgos de historia de la vida fitness-ligado se midieron en respuesta a un aumento de temperatura de + 6 ° C, en consonancia con las predicciones del Panel Intergubernamental de cambio climático para los próximos 100 años ²⁶. en el segundo estudio, un experimento de mesocosmos se utilizó para medir las capacidades competitivas de las tres poblaciones (sub) bajo calentamiento. Estos experimentos combinados demuestran que en presencia de calentamiento como el estrés único, todos los rasgos de historia de la vida y las poblaciones muestran un alto nivel de plasticidad y tienen iguales habilidades competitivas. Estos resultados sugieren que calienta como un estrés único no impone costes de adecuación significativa, al menos en la población estudiada.

Protocolo

El SOP siguiente proporciona una descripción paso a paso del protocolo usado para resucitar Daphnia magna huevos latentes, incluyendo una descripción detallada del muestreo, aislamiento de efipios del sedimento y establecimiento de cultivos clonales ( Figura 1).

Figura 1: guía paso a paso para la resurrección de Daphnia magna. Sedimento de un hábitat de agua dulce (A) se muestrea con un nucleador de pistón (B). La base del sedimento (C) es cortada en capas incrementales de 1 o 0,5 cm (D). Cada capa de sedimento se guarda en una bolsa de ziplock de muestra (E) en condiciones de oscuras y frío (4 ° C). Cada capa de sedimentos es pesado y tamizado usando tamices geológicos (1 mm y 125 μm malla, F). Bandejas de fondo blanco se utilizan para aislar efipios Daphnia magna (G). Decapsulated huevos latentes (H) se transfirió a cajas Petri y expuestos a los estímulos de luz y temperatura para inducir la eclosión. Crías se transfieren para separar los frascos (yo) para establecer líneas de isoclonal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. muestreo de testigos de sedimentos

1. Sedimento de la muestra de lagos o estanques con un nucleador de pistón. Este protocolo utiliza Big Ben²⁷, un tubo de aproximadamente 1,5 m de longitud con un diámetro interno de 14 cm. Big Ben consta de un pistón en una cuerda y una cabeza de corer, que barras se unen para impulsar el tubo en el sedimento. Un sacatestigos ayuda el apoyo del tubo cuando esté lleno de sedimentos. Para sacar el sedimento, un marco mantiene el tubo vertical y estacionaria, y un gato de botella modificado se utiliza para empujar el pistón hacia arriba durante el proceso de extrusión (Video complementario 1).
   1. Para estanques poco profundos de menos de 1 m de profundidad, use un corer de gravedad de plexiglás de no más de 6 cm de diámetro empujado manualmente en el sedimento.
   2. Para lagos profundos (> 6 m de profundidad), usar Livingston pistón equipos²⁸ o equipos de sedimento de Griffith de una unidad de disco con las ayudas de un barco el pontón anclado. El corer de Livingstone-tipo unidad varilla del pistón puede utilizarse en agua hasta unos 30 m profundidad para recoger sucesivas unidades de un metro de suave al sedimento del lago consolidado. El tubo de Griffith de una unidad de disco consiste en una cabeza de núcleo simple pero robusto que conecta tubos de policarbonato estándar a las barras de accionamiento de Livingstone. Los equipos se empujan en el sedimento con las varillas, y un pistón proporciona la succión necesaria para la recuperación de sedimentos (figura 2).
   3. Para la recuperación continua, corazones, uso vibracoring. Estos equipos trabajan en una variedad de profundidades del agua y pueden recuperar muestras de diferentes longitudes, dependiendo de la litología de los sedimentos. Vibración de baja amplitud que se transfiere de la cabeza vibracore hacia abajo a través del barril conectado o el tubo licua los sedimentos, lo que permite el cañón del núcleo la unidad de vibracore para penetrar en los sedimentos licuados. Algunos vibracorers son pequeño, ligero y portátil, otros son grandes unidades pesadas que sólo pueden ser implementadas de grandes vasos. La elección de los equipos depende de la litología de los sedimentos.
2. Cortar la base horizontalmente en capas incrementales de 1 cm o menos usando una superficie metálica plana (1 vídeo complementario). Equipos de sedimentos como el que se usa aquí están diseñados para reducir presiones hidrostáticas en extrusión, reducción de la perturbación de las capas de sedimento. Cuando se utilizan otros equipos, la corteza exterior de cada capa de sedimento puede ser quitada con una especie de cookie-cutter de cuchilla para limitar la contaminación entre capas.
3. Recoger cada capa de sedimento en una bolsa de muestreo separado (complementario 1 de Video) y almacenar en oscuridad y frío (4 ° C) condiciones.
4. Recoger un mínimo de 5 g de sedimento de todas las capas para la datación radiométrica. Como la datación radiométrica es un protocolo establecido para una descripción detallada de la prueba de datación, consulte existentes publicaciones^12,13.

Figura 2: historieta del pistón metálico procedimiento. Corer de pistón, un tubo hueco con un interno sello deslizante (pistón) que produce un vacío débil. Cuando el pistón toca la interface agua sedimento, el peso empuja el cañón del núcleo en el sedimento y el vacío hace que el sedimento se tubular para entrar y moverse por el tubo sin molestar a las capas de sedimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. tamizado de capas de sedimentos

1. Usando una balanza de precisión, pesar cada capa de sedimento para referencia futura. Utilice el área de la superficie y el peso para calcular la densidad de especies en el lago.
2. Tamiz de cada capa de sedimento utilizando dos tamices geológicos apilados uno encima del otro. El primer tamiz tiene un tamaño de malla de 1 mm y arcilla, invertebrados grandes y partículas, por ejemplo, semillas, plantas e insectos, separa el resto del sedimento. El segundo tamiz tiene una malla de 125 μm y separa el resto del sedimento (Video complementario 2) D. manga efipios y partículas pequeñas.
3. Transferencia de pequeñas alícuotas de la fracción de sedimento recogida en el tamiz de malla de 125 μm en una bandeja de fondo blanco. Dependiendo del tipo de sedimento, alícuotas más pequeñas o más grandes de sedimentos pueden ser transferidos en cada momento.
   1. Añadir volúmenes pequeños (hasta 200 mL) del medio a la bandeja de muestreo blanco para volver a suspender la fracción de sedimento transferido y facilitar ojo manchado de efipios (figura 3). El medio utilizado para Resuspender el sedimento puede ser agua del grifo declorada, agua de pozo, COMBO²⁹o ADaM medio (Aachener Daphnien)³⁰. En lo sucesivo, se utilizará el término 'mediana' para referirse a cualquiera o todas las soluciones mencionadas.

Figura 3: Daphnia magna ephippium. Huevos latentes Daphnia magna inmediatamente después de la desencapsulación. Ephippium (A), la membrana interna del huevo (B) y los huevos latentes (C) se muestran. Barra de escala = 500 μm.

3. desencapsulación de efipios y eclosión

1. Con una pipeta de Pasteur desechable o usar pinzas de microdisección, llenan de efipios individuales de transferencia a cajas Petri con 10 mL de medio. Utilice al menos un plato de Petri por capas de sedimentos.
2. Microscopio estéreo, desencapsulan cada efipios con unas pinzas de microdisección obligando a abrir el caso de la quitina (3 Video complementario). Quitar la membrana interna del huevo descanso delicadamente, prestando atención a no interrumpir los huevos y transferir a la caja Petri con medio utilizando una pipeta Pasteur. Desencapsulación aumenta el éxito de eclosión en D. magna; sin embargo, puede que no sea necesario o puede ser un reto para otras especies de Dafnia produciendo efipios más pequeños.
3. Exponer los huevos decapsulated luz de fotoperíodo de día largo de espectro completo (16:8 luz: oscuridad) y de alta temperatura (20 ± 1 ° C) para inducir la eclosión de un dispositivo de temperatura controlada (incubadora) o una habitación. Eclosión se produce entre 48 horas y varias semanas (hasta cuatro; Video complementario 4). En ausencia de desencapsulación, exponer directamente los efipios a eclosión estímulos (luz de fotoperiodo largo del día (16:8 luz: oscuridad) y alta temperatura (20 ± 1 ° C)).

4. establecer líneas de Isoclonal de Daphnia magna

1. Establecer líneas de isoclonal de crías solo transfiriendo individual D. magna de paso 3.3 para separar los frascos con 200 mL de medio con una pipeta Pasteur desechable. Cada individuo es genéticamente distinto, siendo el resultado de la recombinación sexual.
2. Mantener líneas isoclonal indefinidamente en condiciones de la población que consta de 10 ± 1 ° C, régimen de 16:8 luz: oscuridad, semanalmente alimentaron con 0,2 mg C/L de Chlorella vulgaris u otras algas verdes (p. ej., Scenedesmus obliquus). Renovar el medio de cada tercera semana. Condiciones de la población pueden cambiar con la temperatura, regímenes de alimentación, especies.

5. principales estudios

Nota: Una descripción de dos estudios claves se proporciona en que resucitado D.magna (sub) poblaciones del archivo sedimentaria del lago anillo (Dinamarca) se utilizan para evaluar la respuesta evolutiva al calentamiento. Resucitaron a tres poblaciones de (sub) de los siguientes períodos: 1960-1970, 1970-1985, y > 1999. D. magna eclosión éxito del archivo sedimentario oscilado entre el 11 y el 58% (figura 4). De las crías obtenidas de cada timeperiod, un subconjunto aleatorio fue elegido para los dos principales estudios aquí descritos. Estos estudios fueron diseñados para evaluar si las poblaciones de (sub) resucitadas de diferentes períodos de tiempo a lo largo del gradiente de la temperatura mostraron diferencias en rasgos de historia de la vida fitness-ligado (5.1), y si tenían diferentes habilidades competitivas (5.2) después de la exposición al calentamiento.

Figura 4: éxito en un archivo sedimentario muestreado del lago anillo de eclosión. La proporción de crías exitosas a lo largo del archivo sedimentario del lago anillo utilizado en los principales estudios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Experimentos de jardín común
   1. Transferir diez crías por población (sub) de culturas comunes a condiciones comunes de jardín: 16 ° C; fotoperíodo largo (régimen de 16:8 luz: oscuridad); alimentar diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorella vulgarisy renovar la media cada dos días. Mantener las crías en condiciones comunes de jardín durante al menos dos generaciones (aprox. 45 días). Condiciones comunes de jardín reducen la interferencia del efecto materno y sincronización la reproducción entre crías.
   2. Sobre el lanzamiento de la segunda cría en la cámara de cría, transferencia de hembras adultas de la segunda generación para frascos de 500 mL llenados de medio hasta que suelten la segunda cría de juveniles.
   3. Transferencia al azar individuales juveniles de 24 – 48 h, nacido de la segunda cría de la segunda generación, en frascos de 100 mL llena con medio y expuesto a las siguientes condiciones experimentales: 18 ° C (temperatura actual en el lago) y 24 ° C (calentamiento, temperatura previsto por el IPCC ²⁶ para los próximos 100 años), 16:8 luz: oscuridad régimen y alimentación diaria de 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris.
   4. En cada animal experimental, medir el tamaño en la madurez con un estereomicroscopio como la distancia entre la cabeza y la base de la espina dorsal de la cola (figura 5). Fotografía de cada animal y posteriormente analizar su tamaño utilizando un software de imagen adecuado.
   5. Medir la edad de madurez: el día en que los huevos se observan por primera vez en la cámara de cría.
   6. Medir la mortalidad: el número de individuos a estar extinto durante el experimento.
   7. Medir la fecundidad: el número total de descendientes en primera y segunda clónica reproducción.
   8. Medir la tasa de crecimiento de la población, estimada usando la ecuación de Euler (1):
      (1)
      L_x es la proporción de supervivencia en la edad x, b_x es el número de recién nacidos producidas por individuo sobrevive en la edad x, y r es la tasa intrínseca de incremento natural.
   9. Realizar el análisis estadístico utilizando el software disponible en el mercado. Aquí, utilice R³¹ para trazar normas de reacción (expresión fenotípica de un genotipo único a través de entornos) para cada rasgo de la historia de la vida, utilizando el paquete ggplot2. Calcular las tasas de mortalidad por la población por medio de análisis de supervivencia (R paquete rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Por último, realizar un análisis de varianza (ANOVA, tabla 2) en R³¹ para determinar si el efecto de la temperatura sobre las características puede explicarse por la evolución (diferencias entre poblaciones), plasticidad (respuesta al tratamiento), o la evolución de plasticidad (población x tratamiento).
2. Experimento de competencia
   1. Transferir diez crías por habitantes de culturas comunes a condiciones comunes de jardín: 20 ° C, largo fotoperiodo (régimen de 16:8 luz: oscuridad), alimentar diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorella vulgaris y renovar el medio cada dos días. Mantener condiciones comunes jardín de por lo menos dos generaciones (aprox. 45 días) reducir la interferencia de efectos maternos.
   2. Asignar al azar cinco menores de edad de 24 a 48 h de la segunda cría de la segunda generación de cada eclosión al mesocosmos experimentales (20 L plástico acuarios llenados de medio), en triplicado, con una densidad de 10 animales/L.
   3. Exponer el mesocosmos a 24 ° C, régimen de l: 16:8 y alimentan diariamente con 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris en una cámara de temperatura controlada o en incubadora para un mínimo de cuatro semanas (> 3 generaciones clonales).
   4. Sacrificar cada mesocosmos semanalmente, refrescantes 10% del medio para simular una población dinámica que Daphnia puede encontrar en el medio natural. Imponer el sacrificio mediante la eliminación de un volumen conocido de medio y los animales de cada acuario (1.2 L en este caso) y sustituyendo el volumen sacrificado por medio fresco. Iniciar el régimen de sacrificio después de que los animales alcanzan la madurez (día 10).
   5. Al final de la cuarta semana, la muestra 32 animales de cada mesocosmos para evaluar cambios en la composición genotípica en comparación con el inóculo inicial.
      1. Coloque cada Daphnia en tubos de microcentrífuga y eliminar exceso de líquido con la ayuda de una pipeta Pasteur.
      2. Flash congelar los tubos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C.
      3. Extraer la DNA de genomic de individuos aislados utilizando protocolos disponibles y siguiendo las instrucciones del fabricante.
      4. Amplificar el ADN extraído mediante una serie de marcadores genéticos suficientes para proporcionar un único genotipo multilocus por crías. Aquí, se utilizaron 8 microsatélites dispuestas en un solo múltiplex (M01, tabla 1) siguiendo protocolos establecidos^32,33.
      5. Genotipo amplificaron fragmentos en un analizador de fragmento.
      6. Realizar el análisis del fragmento con un software comercial o libre disponible con un estándar de tamaño adecuado.
      7. Evaluar composición genotípica en el final del experimento por individuos genotyping los 32 con un conjunto de loci microsatélites descrito³³, como calcular la frecuencia de cada genotipo en el final del experimento en comparación con el inóculo inicial.

Figura 5: hembra adulta Daphnia magna. Adulto hembra Daphnia magna con huevos partenogenéticos en la cámara de cría. La distancia entre la cabeza y la base de la espina dorsal de la cola se utiliza para medir el tamaño del animal. Las líneas rojas indican las medidas del tamaño. Barra de escala = 500 μm.

Resultados

Datos empíricos a largo plazo son esenciales para la comprensión de la dinámica evolutiva y persistencia de las poblaciones naturales. Estos datos son generalmente difíciles de obtener debido a las dificultades logísticas asociadas con el acceso a las muestras temporales y el requisito de comprometerse a largo plazo para la recolección de datos. En los dos principales estudios presentados aquí, se ofrece evidencia empírica de la respuesta a la temperatura de una central zooplankter en ecosistemas de agua dulce sobre tiempo evolutivo. Esta opción está activada por el uso de los bancos de huevos latentes capas que proporcionan la oportunidad para estudiar la respuesta de las poblaciones históricas y sus descendientes modernos a la tensión ambiental en común configuración experimental.

Experimento de jardín común
El experimento de jardín común demostró que todos los rasgos de historia de la vida respondieron a la temperatura (figura 6 y figura 7). El análisis de varianza reveló que todas las poblaciones (sub) responden a la temperatura mediante plasticidad (tabla 2), excepción de la mortalidad, que es insensible. Evidencia de cambios evolutivos (diferencias entre poblaciones (sub)) sólo se observó en tasa de crecimiento poblacional (tabla 2), que aumentó significativamente en dos de las tres poblaciones (sub) a 24 ° C (figura 6).

Figura 6: experimento de jardín común. Normas de reacción para rasgos de historia de la vida (fecundidad, tamaño y edad de madurez) y tasa de crecimiento poblacional (r) se muestran para cada población (sub) bajo temperatura calentamiento (24 ° C) en comparación con el jardín común y el actual régimen de temperatura (18 ° C). La tasa de crecimiento de la población 'r' se calcula mediante la ecuación de Eulerian (1). Se muestran los intervalos de confianza. Las poblaciones (sub) están codificadas por color: azul (): 1960-1970; (ii) verde: 1970-1985; (iii) rojo: > 1999. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: mortalidad. Las tasas de mortalidad por población (sub) (1960-1970, 1970-1985; > 1999) aparecen bajo calentamiento (24 ° C) en comparación con los regímenes modernos de temperatura (18 ° C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimento de mesocosmos
Después de cuatro semanas de selección, representada por el calentamiento a 24 ° C, la frecuencia de las tres poblaciones (sub) no cambió significativamente (χ² = 0.55, P = 0.76) en comparación con el inóculo inicial (figura 8). Entre los 30 genotipos inoculados en el experimento de mesocosmos, la mayoría fue identificada después de cuatro semanas de selección (figura 9). Concretamente, el 70% de los genotipos inoculados fueron recuperados, compatible con Poissonian expectativa de recuperar al menos un representante de cada genotipo en una muestra de 32 personas.

Figura 8: experimento de competencia - frecuencia de la población. Promedio de población mediana y cuartiles (25 de^mayo y 75^th), se muestra para las tres poblaciones (sub) de D. magna después de cuatro semanas de selección en los experimentos de competencia de mesocosmos (24 ° C), en comparación con una frecuencia igual inicial (en el comienzo). Las poblaciones (sub) son colores como se muestra en la figura 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: experimento de competencia - frecuencia de genotipo. Frecuencias genotípicas: promedio mediana y cuartiles (25 de^mayo y 75^th), aparecen después de cuatro semanas de exposición al calentamiento (24 ° C) en comparación con una inicial igual frecuencia de genotipos (línea punteada). Nombres en el eje x son el ID de genotipos inoculados, agrupado por población (sub) (azul, 1960-1970; verde, 1970-1985; rojo, > 1999). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Lugar geométrico	UN	Gama del tamaño (bp)	Cebadores (5' - 3')		Etiqueta de tinte	Repetir el motivo	TM
B008	HQ234154	150 – 170	F: TGGGATCACAACGTTACACAA		VIC	(TC) 9	56
			R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030	HQ234160	154-172	F: CCAGCACACAAAGACGAA		MASCOTA	(GA) 11	56
			R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045	HQ234168	118 – 126	F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC		NED	(TG) 8	56
			R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050	HQ234170	234-248	F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC		6FAM	(GAA) 6	56
			R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064	HQ234172	135-151	F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA		6FAM	(TC) 8	56
			R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074	HQ234174	196-204	F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT		NED	(GT) 9	56
			R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096	HQ234181	234-240	F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA		VIC	(AC) 15	56
			R: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107	HQ234184	250-274	F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA		MASCOTA	(CT) 8	56
			R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

Tabla 1: multiplex de Microsatellite. El NCBI adhesión número (AN), la información multiplex, las secuencias de la cartilla PCR, el rango de tamaño de polimerización en cadena, el motivo de repetición, el tinte usado para etiqueta que aparecen el primer avance y la temperatura de recocido (Tm).

Tasa de crecimiento del pop (r)		DF	F	P
Evolución (Pop)		2	30.309	< 0.001
Plasticidad (Temp)		1	531.546	< 0.001
Evol. Plasticidad (Pop x Temp)		2	65.137	< 0.001
Mortalidad		DF	F	P
Evolución (Pop)		2	2.234	0.1162
Plasticidad (Temp)		1	2.679	0.1071
Evol. Plasticidad (Pop x Temp)		2	1.8657	0.164
Fecundidad		DF	F	P
Evolución (Pop)		2	1.8852	0.1633
Plasticidad (Temp)		1	6.8934	0.0117
Evol. Plasticidad (Pop x Temp)		2	1.6511	0.203
Talla de madurez		DF	F	P
Evolución (Pop)		2	0.211	0.8106
Plasticidad (Temp)		1	11.1361	0,0017
Evol. Plasticidad (Pop x Temp)		2	0.6586	0.5225
La edad en la madurez		DF	F	P
Evolución (Pop)		2	0.7811	0.4637
Plasticidad (Temp)		1	8.0764	0.0066
Evol. Plasticidad (Pop x Temp)		2	0.088	0.9159

Tabla 2: Análisis de varianza (ANOVA). Análisis de varianza prueba si cambios en rasgos de historia de la vida y la tasa de crecimiento demográfico de las poblaciones de resucitado (secundaria) expuestos al calentamiento se explican por adaptación evolutiva (poblaciones), plasticidad (tratamiento de temperatura) y su término de interacción (evolución de la plasticidad). Significativas p-valores (p< 0,05) se muestran en negrita.

Video complementario 1: toma de muestras de núcleos de sedimento. Se muestra el uso de un nucleador de Big Ben. Big Ben es un tubo de aproximadamente 1,5 m de longitud con un diámetro interno de 14 cm. Consiste en un pistón en una cuerda y una cabeza de corer, que barras se unen para impulsar el tubo en el sedimento. Un sacatestigos se utilizan para el tubo de base que se implementa desde una pequeña embarcación de apoyo. El pistón es empujado hacia abajo en el sedimento por presión gravitatoria. Un marco se utiliza para apoyar el tubo durante el proceso de extrusión utilizando un gato de botella modificados que empuja el pistón hacia arriba. Cada capa de sedimento se recoge en una superficie plana de metal y transferido a las bolsas de muestreo transparente para almacenamiento a largo plazo [oscuro y frío (4 ° C) condiciones]. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 2: sedimento tamizado. El equipo requerido para tamizar el sedimento es una balanza de precisión, tamices geológicos y bandejas de muestreo blanco. De cada capa de sedimento, por lo menos de 5 g se conservan para la datación radiométrica. El resto del sedimento se utiliza para aislar efipios. El sedimento es tamizado a través de dos tamices geológicos, uno con 1 mm y un segundo con 125 μm tamaño de malla, apilados uno encima del otro. Medio se vierte en el tamiz de malla de 1 mm para separar arcilla, invertebrados grandes y partículas. Medio de vertido en el segundo tamiz con malla de 125 μm separa D. magna efipios y pequeñas partículas. Alícuotas de sedimento se transfieren a una bandeja de muestreo blanco. D. magna efipios son vistos por el ojo en la bandeja de fondo blanco. Efipios de cada capa se recogen en cajas Petri separadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 3: Decapsulation. Bajo un estereomicroscopio, efipios D. magna se abren con pinzas para microdisección mediante la aplicación de presión en el lomo de la caja de la quitina. La membrana interna del huevo se retira delicadamente y huevos de reclinación suavemente transferidos con una pipeta Pasteur a un plato de Petri que contiene 10 mL de medio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario 4: eclosión. Después de la exposición a fotoperiodo largo y 20 ° C, desarrollo del embrión se reanuda entre 48 horas y algunas semanas. Cuando el desarrollo es completo, los embriones liberarse de la cáscara de huevo y nadan libremente en el medio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Debido a la alta conductividad térmica del agua, ecosistemas de agua dulce están en mayor riesgo de pérdida de la biodiversidad de los ecosistemas terrestres ante global calentamiento³⁴. Por lo tanto, es fundamental para entender la respuesta de la especie en estos ecosistemas e identificar mecanismos para sobrevivir el estrés térmico. La comprensión de estos mecanismos a nivel especie y comunidad puede ayudar a predecir cómo las especies se ven afectadas por el calentamiento global y cómo las cascadas del efecto en las especies individuales a otros niveles tróficos. En definitiva, entender mecanismos de respuestas al calentamiento global permite la identificación de estrategias de rehabilitación para mitigar la extinción.

Los estudios de caso presentados aquí demuestran que la respuesta de D. magna a aumento de la temperatura es pervasively mediada por plasticidad en rasgos de historia de la vida y que respuesta al aumento de la temperatura solamente imponer costos fitness claro, al menos en el población estudiada aquí. Alta plasticidad en rasgos de historia de la vida está sustentada en diferencias no significativas en competencia las capacidades de las poblaciones de (sub) en presencia de calentamiento. Sin embargo, experimentos de competencia a largo plazo en poblaciones múltiples pueden ser necesarios para generalizar estos resultados.

Resurrección de etapas latentes proporciona un recurso sin precedentes para estudiar mecanismos de adaptación y trayectorias de evolución de una especie a través de tiempo de¹⁰. Especies de zooplancton se benefician de un tiempo de generación rápido (2 semanas) y la viabilidad de etapas latentes, que permite un antepasado competir enfrentamientos contra sus propios descendientes, o a 'reproducir' evolución que inicia desde diversos Estados últimos. Ecología de resurrección esencialmente permite la investigación de si un resultado evolutivo particular depende de algún acontecimiento previo. La identificación de los elementos genéticos de la evolución es actualmente posible en experimentos de laboratorio con microorganismos para que 'líneas ancestrales' son congeladas y resucitadas para el análisis comparativo con su descendiente evolucionado⁶. Sin embargo, una de las principales limitaciones de trabajar con organismos de laboratorio es que el 'estado ancestral' es una referencia ya cambiada de puesto. El estudio de etapas latentes permite el muestreo de especimenes de tiempo anteriores a cualquier evento de estrés (p. ej., prístinas condiciones ambientales) y para medir trayectorias evolutivas de las condiciones ambientales a distintos Estados últimos hasta tiempos modernos. En los últimos años, el estudio del polimorfismo de la DNA en etapas de zooplancton resucitado o aún latente ha proporcionado importantes conocimientos sobre últimos procesos demográficos y adaptativos que han contribuido a la composición genética de las poblaciones actuales^{14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36}. con la mayor accesibilidad de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, el genoma y transcriptoma de etapas resucitadas o aún latentes pueden ser secuenciados y el tipo y el número de cambios genéticos acumularon en la evolución de las poblaciones en tiempo medido.

La resurrección SOP presentado aquí tiene aplicaciones importantes en el campo de la multi-omics en dos niveles. Las tecnologías multi-ómicas pueden aplicarse a muestras de resucitado, permitiendo un análisis exhaustivo de los elementos moleculares implicados en las respuestas de adaptación a las presiones de selección ambiental. Además, las tecnologías ómicas pueden aplicarse a decapsulated pero etapas todavía latentes. Hasta ahora, la aplicación de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento en etapas de descanso ha sido limitada por la exigencia de una gran cantidad de material de entrada. Estas limitaciones están siendo levantado³⁷. Con los requisitos de descenso para entrada material y el progreso en nanofluídica, secuenciación del genoma entero (WGS) ahora es posible desde tan poco como 1 ng o pg unos de a partir de material³⁸. El uso de amplificación (WGA) de todo el genoma y transcriptoma conjunto técnicas de amplificación (WTA), que permite el enriquecimiento de ADN y ARN de muy pequeñas cantidades de tejido, ha revolucionado la metagenómica^39,40 y médica ⁴¹la investigación. Estas tecnologías aplicadas a los huevos latentes decapsulated permiten superar limitaciones asociadas con viabilidad de etapas latentes y la investigación de los periodos de tiempo prolongado (p. ej., siglos).

La resurrección de las comunidades invertebradas produciendo etapas de reposo permite la alineación de las historias de la comunidad con los conocidos cambios en los paisajes naturales, o con cambios ambientales que se infiere del análisis de los sedimentos orsoils². El análisis de los cambios de la comunidad en respuesta a los cambios ambientales nos proporciona la capacidad de cuantificar eco-evolutivo votos⁴² que tienen consecuencias sustanciales sobre la población persistencia⁴³, interacciones tróficas⁴⁴ , comunidad Asamblea⁴⁵y cambios en el ecosistema funciones y servicios⁴⁶. Finalmente, predicciones exactas acerca de las respuestas biológicas a los cambios ambientales son fundamentales para guiar la protección de la biodiversidad⁴⁷. Los modelos predictivos actuales son inexactos en este sentido porque no tienen en los mecanismos biológicos importantes cuenta como demografía, dispersión, evolución e interacciones de las especies. Entender cómo estos procesos cambian con el tiempo y el uso de esta información como un prior en modelado de pronóstico mejorará nuestra capacidad para predecir la especie y persistencia de la comunidad frente al medio ambiente cambiar².

La aplicación de la compensación presentada aquí no es sin problemas. La limitación principal de reconstruir etapas latentes es la necesidad de equipo especializado para toma de muestras. Además, todo el proceso de tamizado de sedimentos para el establecimiento de cultivos clonales, requiere bastante tiempo de práctico.

Algunas de las medidas de compensación presentadas aquí son fácilmente transferibles a otras especies de Dafnia . Estas son: muestreo, el establecimiento de líneas clonales y diseño experimental. Sin embargo, otras medidas del SOP pueden requerir más optimización adaptado a la especie bajo estudio. Desencapsulación a menudo se aplica a los especímenes de D. magna para mejorar el éxito de eclosión. Sin embargo, este enfoque puede no ser adecuado para los especímenes más pequeños. Estímulos de eclosión puede variar entre especies⁴⁸ y⁴⁹de la misma especie muestra. Por lo tanto, una especial optimización de los pasos de eclosión de la compensación puede ser requerida antes de aplicaciones a otros crustáceos. Mientras que el éxito de eclosión de la población de D. magna resucitado de lago anillo (30,5% en el archivo sedimentario) está en línea con anteriores resultados⁴⁹, éxito de eclosión varía con el estado de conservación de los sedimentos, la especie ^50,51y el origen geográfico de los⁴⁸del sedimento. Futuros estudios sobre los mecanismos que regulan la entrada y la progresión a través de las fases de la diapausa es necesaria para identificar estímulos eclosión óptima adaptados a diferentes especies.

Finalmente, conocimiento del sistema de estudio de fondo, en particular la presencia de las especies de interés con el tiempo, es recomendable. Esto puede lograrse a través de registros históricos. Si no hay registros históricos, muestreo y detección de las capas superficiales de los sedimentos del lago antes de la toma de muestras de núcleo es recomendable, aunque puede proporcionar información sólo sobre la historia más reciente.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
sampling bags	Fisher Scientific	11542783	Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer	ENSIS ltd	na	Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale	Veritas-M124A	TLP-50	Analytical Balance
geological sieve	UKGE limited	SV7521	200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve	UKGE limited	SV7525	200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray	nhbs	http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509	Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette	Globe Scientific inc.	138020B	Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope	nikon	smz800	Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish	EduLab	153-533	Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars	compak	Round Jam Jars 4oz	100 mL jars
glass jars	compak	Atum Jars/ Bonta Jar 10oz	200 mL jars
glass jars	bottlecompanysouth	500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid	500 mL jars
statistical software R	https://cran.r-project.org/	na	Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps	Fisher Scientific	41122405	Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	na	Open source ImageJ image processing toolkit written in Java
mesocosm	amazon	na	Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes	Sigma_Aldrick - Merck	Z606340	premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance	Beckman Coulter	A48705	DNA extraction kit
size standard	Thermo Fisher Scientific	4322682	LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer	ABI	na	Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing