Diriliş uyuyan Daphnia magna: Protokolü ve uygulamaları

Özet

Uzun vadeli çalışmalar evrim süreci ve adaptasyon mekanizmaları anlamak için gerekli. Genel olarak, bu çalışmalar araştırmacıların ömür boyu ötesinde taahhütleri gerektirir. Burada, güçlü bir yöntem büyük ölçüde doğal sistemlerinde boyuna verileri oluşturmak için state-of--art veri toplama gelişmeler açıklanmıştır.

Özet

Uzun vadeli çalışmalar uzun süreler içinde oluşan Eko-evrimsel süreçleri tanımlaması etkinleştirin. Buna ek olarak, onlar akıllı modelleme evrimsel doğal ekosistemlerin yanıt-e doğru gelecekteki çevresel değişiklikler tahmin etmek için kullanılan önemli ampirik veri sağlar. Ancak, birkaç istisnai durumlar, uzun vadeli çalışmalar zamansal örnekleri erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle azdır. Zamansal dinamiği sık vahşi doğal nüfus evrimi yeniden olağanüstü çalışmaları ile laboratuvar veya kontrollü mesocosm deneyler incelenmektedir.

Burada, Standart prosedür (SOP) canlandırmak veya önemli ölçüde state-of--art boyuna veri koleksiyonunda ilerlemek için uyuyan Daphnia magna, sucul ekosistemler, bir yaygın plankton kilittaşı türler diriltmek için sağlanmıştır. doğal sistemlerin. İlk diapausing plankton yumurta tarihe geri 1980'lerin kuluçkalık çalışır halde diriliş ekoloji alanında Kerfoot ve iş arkadaşları tarafından 1999 yılında tanımlanmıştır. Kerfoot'ın seminal gazeteden beri plankton türler resurrecting metodoloji giderek daha sık, doğrudan bilgi transferi yoluyla sadece laboratuvarlar arasında yayılır rağmen uygulanmıştır. Burada, bir SOP uyuyan Daphnia magna resurrecting uygulaması üzerinde adım adım bir protokol sağlayan anlatılan yumurta.

Hangi fitness tepki Daphnia magna nüfus için yeniden canlandırmak olarak ısınma ölçülür, iki anahtar çalışma tarihi ve modern nüfus aynı ayarları çalışma yeteneği üzerinde sermaye sağlanmaktadır. Son olarak, sonraki nesil sıralama teknolojileri uygulamaya canlandı veya hala atıl aşamaları ele alınmıştır. Bu teknolojiler süreçleri ve seçim basınç değişiklikleri zaman içinde yaşamış nüfus uyguladıysanız evrim mekanizmaları dissekan benzeri görülmemiş güç sağlar.

Giriş

Uzun vadeli çalışmalar doğada ve ne tür yanıt ve çevresel değişimin¹sırasında kalıcı değerlendirirken ekolojik ve evrimsel süreçleri anlamak için kritik öneme sahiptir. Eko-evrimsel süreçleri nesiller boyunca oldu ve uzun zaman açıklıklı üzerinde ortamındaki değişiklikler meydana olmasıdır. Ayrıca, uzun vadeli çalışmalar evrimsel doğal ekosistemlerin yanıt-e doğru çevre değişiklikleri²tahmin etmek için akıllı modelleme doğruluğunun geliştirilmesine önemli ampirik veriler sağlar. Bu modeller doğruluğunu biyolojik çeşitlilik ve ekosistem hizmetleri korumak için yönetimi ve koruma stratejileri uygulamak için çok önemlidir.

Birkaç istisnai durumlar (örneğin, Galapagos Darwin ispinozları³ ve yosun⁴), uzun vadeli çalışmalar büyük ölçüde türe laboratuvar^5,6 ' türetilebilecek kısa oluşturma süresi ile sınırlıdır ^{, 7 , 8}. bu nedenle, evrimsel dynamics destek süreçleri zor kalır. Zamansal örnekleri erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle ampirik veri daha sık olarak bir uzamsal-zamansal bir bağlamda incelendiği ve zamansal Eko-evrimsel süreçleri anlaşılmaktadır veya uzamsal verilerden modellenmiştir. Bu yaklaşım 'uzay-için-zaman' ikame⁹sayede alanı zamansal evrimsel dynamics eğitim için bir vekil olarak kabul edilen, olarak bilinir. 'Uzay-için-zaman' ikame ana sınırlandırılması kayma farklı ölçeklerde uyum oranları aynı nüfus zamansal değişim farklı olduğunu; Bu nedenle, yedek zaman alanı olan temel çıkarımlar önyargılı¹⁰vardır.

Zaman içinde doğal ekosistemler evrimsel dinamiklerini eğitim sağlayan güçlü bir alternatif uyuyan aşamaları¹¹üreten türlerin ekolojik ve genetik değişimler analizidir. Uyuyan bu aşamaların doğru tarihli olabilir tabakalı form biyolojik arşive birikir ve^12,13paleolimnologically ile karakterizedir. Önemlisi, bu uyuyan aşamaları resüsite ve nerede çevre değişim evrimsel onların yanıt doğrudan ölçülebilir laboratuvar deneylerinde kullanılan. Tarihsel nüfus fitness değişiklikleri ve adım çevresel değişimin^14,15,16ile gelişen genlerin fonksiyonun çalışmaya modern gelişmiş torunları karşı yarıştı.

Uyuyan aşamaları dahil tohumları, kistler, sporlar ve bankalar yumurta. Her ne kadar geç 1980'lerde¹⁷ve çalışmalar bir avuç geri yaşama uyuyan yumurta tarihleri üzerinde ilk çalışmalar erken 1990'larda^18,19Bu teknikte uygulamış, diriliş ekoloji alanında resmen olmuştur Kerfoot ve iş arkadaşları 1999²⁰seminal kağıt tarafından kuruldu. Bu uygulama içinde ağırlıklı olarak rekonstrüksiyonlar paleolimnological tatlı türler^17,21,22uygulanmıştır. Ancak, bir SOP henüz kullanılabilir değil. Burada, plankton türlerinin Daphnia magna uyuyan yumurta uygulanan diriliş protokolü, adım adım açıklamasını, yavru üzerinden klonal kültürler kurulması için tortu örnekleme üzerinden sağlanır. Daphniadiğer türler için kolayca transfer edilebilir SOP adımlardan yanı sıra ek optimizasyon, gerektirebilir adımları ele alınmıştır.

Daphnia tatlı su zooplankters lotic habitatları²³ çoğunda mevcut vardır. Daphnia türü ya da zorunlu aseksüel veya döngüsel parthenogens bulunmaktadır. D. magna clonally uygun çevre koşulları²⁴altında üretir döngüsel bir parthenogen var. Çevre koşullarının bozulmasına, erkek üretim oluşur ve cinsel rekombinasyon uyuşukluk çevreden ephippium denilen bir kitin durumunda tarafından korunan bir devlet girin döllenmiş yumurta oluşumu yol açar. Bir kısmı atıl bu yumurta yumurtadan uygun çevre koşulları döndüğünüzde. Ancak, uyuyan yumurta banka büyük bir kısmı hiç yumurtadan ve böylece biyolojik Arşivler kurmak zaman içinde oluşturmak için bir şansı var. Uyuyan aşamaları göller ve göletler tortu gömülü kalır ve evrimsel dinamikler çalışma için uzun süreler içinde yeniden canlandırmak. D. magna uyuyan yumurta cinsel rekombinasyon sonucudur çünkü türler²⁵doğal genetik çeşitliliğin iyi bir temsil vardır. Ayrıca, laboratuvarda klonal üreme yoluyla korunabilir. Bu özellikleri doğal genetik çeşitlilik koruyarak isogenic canlılar, benzersiz avantaj sağlarlar.

İki önemli çalışmalar çevre seçimi basınç zaman içinde yaşıyor doğrudan karşılaştırma D. magna aynı nüfus tarihi ve modern torunları avantajları göstermek için sunulmaktadır. D. magna numuneler Gölü yüzüğünden (Danimarka), sığ bir yeniden canlandırmak (5 m Derinlik; yüzey 22 ha) Zaman içinde ortalama sıcaklık ve ısı dalgaları oluşumu bir artış yaşanmıştır karışık gölet. D. magna (alt) nüfus 60 yıl (1960-2005) kapsayan bu zamansal degrade yeniden canlandırmak ve evrimsel yanıt-e doğru sıcaklık ısınma araştırmak için okudu. Ortak bir bahçe deneyi ilk çalışmada,'hayat Tarih fitness bağlantılı özellikleri değişiklikleri yanıt predictions Hükümetlerarası Panel iklim değişikliği için yaklaşan 100 yıl doğrultusunda 6 ° c sıcaklık artışı olarak ölçüldü ²⁶. ikinci çalışmada, mesocosm deney üç rekabetçi yeteneklerini ölçmek için kullanılan ısınma altında (alt) nüfus. Kombine bu deneyler huzurunda, sadece stres ısınma tüm yaşam öyküsü özellikleri ve nüfus plastisite yüksek düzeyde göstermek ve eşit rekabet yetenekleri olduğunu göstermektedir. Bu bulgular tavsiye ederim tek bir stres önemli fitness maliyeti, en azından kalabalıkta empoze etmez gibi ısınma burada okudu.

Protokol

Aşağıdaki SOP Daphnia magna diriltmek için kullanılan iletişim kuralı, adım adım açıklamasını uyuyan yumurta, örnekleme, yalıtım ephippia tortu ve klonal kültürler ( kurulması, ayrıntılı bir açıklama da dahil olmak üzere sağlar. Şekil 1).

Şekil 1: adım adım kılavuzu diriliş Daphnia magna. Tortu doğal tatlı su ortamına(a)üzerinden bir piston corer (B) ile örneklenir. Tortu çekirdek (C) 1 veya 0.5 cm (D) artımlı katmanlar halinde dilimlenmiş. Tortu her katman bir örnek zip kilit torba (E) içinde karanlık ve soğuk koşullarda (4 ° C) depolanır. Tortu her tabakası ağırlığında ve jeolojik elekler (1 mm ve 125 µm kafes boyutları, F) kullanarak elenmiş. Beyaz arka plan tepsiler Daphnia magna ephippia (G) izole etmek için kullanılır. Decapsulated uyuyan yumurta (H) Petri yemekler için transfer ve damızlık ikna etmek için ışık ve sıcaklık uyaranlara maruz. Yavru isoclonal satırları oluşturmak üzere kavanozlar (Ben) ayırmak için transfer edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. örnekleme tortu çekirdek

1. Göl ve göletler piston corer kullanarak üzerinden örnek tortu. Big Ben²⁷bu protokolü kullanılan, yaklaşık 1.5 m uzunluğunda bir iç boru çapları, 14 cm. Big Ben ile bir çekirdek tüp bir piston bir ip ve çubuklar tüp tortu sürücüye bağlı bir corer kafa oluşur. Bir çekirdek alıcı çekirdek tüp zaman tam destek yardımları, tortu. Tortu Yükselt için bir çerçeve çekirdek tüp dik ve sabit tutar ve değiştirilmiş şişe jack pistonu yukarı ekstrüzyon sürecinde (ek Video 1) itmek için kullanılır.
   1. İçin sığ gölet az 1 m derinlemesine bir pleksiglas yerçekimi corer en fazla 6 cm çapında el ile tortu itti kullanın.
   2. Derin göl için (> 6 m Derinlik), Livingston piston soyucular²⁸ veya tek sürücülü Griffith tortu soyucular bir bağlantılı duba tekne AIDS ile kullanın. Livingstone tipi sürücü çubuk piston corer yaklaşık 30 m kadar su derin birbirini izleyen bir metrelik götürmek-in yumuşak konsolide Gölü tortu toplamak için kullanılabilir. Livingstone sürücü çubuklar için standart polikarbonat borular bağlayan bir basit ama güçlü çekirdek kafa, tek sürücülü Griffith corer oluşur. Soyucular tortu çubuklar ile içine itilir ve bir piston tortu (Şekil 2) kurtarma için gerekli emiş gücü sağlar.
   3. Rahatsız edilmeden çekirdek, sürekli almak için vibracoring kullanın. Bu soyucular su derinlikleri çeşitli üzerinde çalışmak ve çekirdek örnekleri, tortu lithology bağlı olarak farklı uzunlukta alabilirsiniz. Vibracore baş aşağı ekli varil veya çekirdek tüp yoluyla aktarıldığı düşük genlik titreşim çökeller, sıvılaştırılmış çökeller nüfuz vibracore birimine bağlı çekirdek namlu etkinleştirme liquefies. Bazı vibracorers küçük, hafif ve taşınabilir, diğerleri yalnızca büyük gemilerin dağıtılabilir büyük ağır birimleri vardır. Soyucular seçim tortu lithology üzerinde bağlıdır.
2. Çekirdek yatay olarak 1 cm veya daha az düz metal yüzeylere (ek Video 1) kullanarak artımlı katmanlarında dilim. Burada kullanılan bir tortu soyucular ekstrüzyon, rahatsızlık sediman katmanların azaltılması, hidrostatik basıncı azaltmak için tasarlanmıştır. Diğer soyucular kullanıldığında, dış kabuğu her tortu katmanın katmanlar arasında kirlenme sınırlamak için bıçak bir çerez kesici tür kaldırılmış olabilir.
3. Her bir ayrı örnekleme çanta (ek Video 1) tortu katmanda toplar ve karanlık ve soğuk (4 ° C) koşulları saklarız.
4. Radyometrik tarihleme için tüm katmanlardan en az 5 g tortu toplamak. Radyometrik çıkıyor uzanan tahlil ayrıntılı bir açıklaması için oluşturulmuş protokol için varolan yayınlar^12,13bakın.

Şekil 2: yordam Asitleme piston karikatür. Piston corer, zayıf bir vakum oluşturur bir iç sürgülü mühür (piston) ile içi boş bir tüp. Piston tortu-su arabirimi dokunduğunda, ağırlığı iter ve çekirdek namlu tortu ve vakum girin ve sediman katmanların bozmadan tüp taşımak için özlü tortu neden olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. eleme sediman katmanların

1. Bir duyarlılık ölçeği kullanarak, her bir tortu katman ileride başvurmak için tartmak. Yüzey alanı ve ağırlık göl türler dansitesi hesaplamak için kullanın.
2. Birbiri üstüne yığılmış iki jeolojik elekler kullanarak her tortu katman elek. İlk elek bir kafes boyutu 1 mm ve kil, büyük omurgasızlar ve Partiküler madde, örneğin tohumlar, bitkiler ve böcekler, tortu kalan ayırır. İkinci elek 125 µm örgü vardır ve D. manga ephippia ve küçük partikül tortu (ek Video 2) kalan ayırır.
3. Küçük aliquots 125 µm mesh elek toplanan tortu fraksiyonunun bir beyaz arka plan tepsiye aktarın. Tortu türüne bağlı olarak, tortu, küçük veya büyük aliquots her zaman transfer edilebilir.
   1. Küçük birimleri ekleyin (ilâ 200 mL) orta transfer edilen tortu kesir yeniden askıya almak ve göz ephippia (şekil 3) lekelenme kolaylaştırmak için örnekleme beyaz tepsi için. Tortu resuspend için kullanılan orta dechlorinated musluk suyu, sondaj su, açılan²⁹veya ADaM orta (Aachener Daphnien)³⁰olabilir. Bundan sonra terim 'orta' ya da tüm listelenen çözümleri için başvurmak için kullanılır.

Şekil 3: Daphnia magna ephippium. Uyuyan Daphnia magna yumurta hemen sonra kapsülden çıkarma. Ephippium(a), (B) iç yumurta membran ve uyuyan yumurta (C). gösterilir Ölçek çubuğu 500 µm =.

3. Ephippia ve damızlık kapsülden çıkarma

1. Bir tek kullanımlık Pasteur pipet veya mikrodiseksiyon forseps kullanarak transfer bireysel ephippia Petri yemekler için orta 10 mL ile dolu. En az bir petri çökelti tabakası başına kullanın.
2. Stereo mikroskop, decapsulate altında mikrodiseksiyon forseps açık zorlayarak kitin durum (ek Video 3) kullanarak her ephippia. Dinlenme yumurta iç zarı ince kaldırmak için değil yumurta bozabilir ve Petri kabına aktarmak için dikkat ile Pasteur pipet kullanarak ortam dolu. Kapsülden çıkarma D. magna; tarama başarı ancak artırır, bu gerekli olmayabilir veya daha küçük ephippia üreten diğer Daphnia türler için zor olabilir.
3. Decapsulated yumurta tam spektrum uzun gün photoperiod ışık (16:8 ışık: karanlık) ve damızlık ikna etmek için yüksek sıcaklık (20 ± 1 ° C) için bir ısı kontrollü aygıt (kuluçka) veya oda içinde maruz. 48 h ve (en fazla dört; birkaç hafta arasında damızlık olur Takıma giren Video 4). Kapsülden çıkarma yokluğunda, doğrudan uyaranlara (uzun gün photoperiod ışık (16:8 ışık: karanlık) ve yüksek sıcaklık (20 ± 1 ° C)) çıkım için ephippia ortaya çıkarmak.

4. Daphnia magna Isoclonal satırları oluşturma

1. Tek yavru satırlarından isoclonal adım 3.3 200 mL tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak orta ile dolu kavanoz ayırmak için bireysel D. magna aktararak kurmak. Her bireyin genetik olarak cinsel rekombinasyon sonucu olarak farklıdır.
2. İsoclonal satırları süresiz olarak hisse senedi koşullarında oluşan 10 ± 1 ° C, 16:8 ışık: karanlık rejimi, haftalık 0.2 mg C/M Chlorella vulgaris veya diğer yeşil algler (örneğin, Scenedesmus obliquus) ile beslenen korumak. Orta üçüncü haftada yenilemek. Hisse senedi koşullarında beslenme rejimleri ve türler sıcaklık ile değişebilir.

5. anahtar çalışmalar

Not: Hangi dirilen D.magna içinde (alt) tortul Arşiv veri gruplarından Gölü halka (Danimarka) ısınma için evrimsel yanıtı değerlendirmek için kullanılan iki temel çalışmalar için bir açıklama sağlanmıştır. Üç (alt) nüfus aşağıdaki süreler yeniden canlandırmak: 1960-1970, 1970-1985, ve > 1999. 11 ile %58 (şekil 4) arasında değişmekteydi tortul Arşivi'nden başarı kuluçkalık D. magna . Her timeperiod elde edilen yavru rastgele bir alt burada açıklanan iki anahtar çalışmalar için seçildi. Bu çalışmalar (alt) nüfus dönemleri boyunca sıcaklık değişimi üzerinden yeniden canlandırmak fitness bağlı yaşam öyküsü özellikleri (5.1) farklılıkları gösterdi ve onlar farklı rekabetçi yetenek (5.2) vardı değerlendirmek için tasarlanmıştır ısınmaya maruz kaldıktan sonra.

Şekil 4: başarı Gölü yüzüğünden örneklenmiş bir tortul arşivindeki kuluçkalık. Göl anahtar çalışmalarda kullanılan yüzük tortul Arşiv boyunca başarılı yavru oranı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. Ortak Bahçe deneyler
   1. On yavru (alt) nüfus başına hisse senedi kültürleri ortak Bahçe koşulları için transfer: 16 ° C; uzun photoperiod (16:8 ışık: karanlık rejimi); Her gün 0,8 mg C/L Chlorella vulgarisile besleme ve orta iki günde yenilemek. En az iki kuşak (ca. 45 gün) için ortak Bahçe koşullarında yavru korumak. Ortak Bahçe koşulları anne etkisi müdahalelerden azaltmak ve üreme yavru arasında eşitleyin.
   2. İkinci damızlık damızlık odasına serbest bırakılmasıyla yetişkin kadın gençlere ikinci damızlık bırakana orta ile dolu 500 mL kavanoz için ikinci nesilden aktarın.
   3. Rastgele 24-48 h, orta ile dolu ve aşağıdaki deneysel koşullar için maruz 100 mL kavanoz ikinci nesil kuluçka ikinci dünyaya bireysel gençlere aktarım: 18 ° C (göl geçerli sıcaklık) ve (ısınma, sıcaklığı 24 ° C IPCC ²⁶ tarafından yaklaşan 100 yıldır tahmini), 16:8 ışık: karanlık rejimi ve besleme günlük 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris.
   4. Her deneysel hayvan üzerinde baş ve omurganın kuyruk (şekil 5) arasındaki mesafe olarak bir stereomicroscope ile Vadesinde boyutunu ölçmek. Her hayvan fotoğraf ve daha sonra boyutuna uygun görüntü yazılımı kullanarak çözümleyebilirsiniz.
   5. Olgunluk yaşta ölçmek: içinde yumurta ilk defa kuluçka odasında günü kutlanan.
   6. Ölüm ölçmek: deney sırasında soyu tükenmiş sayisi.
   7. Verimlilik ölçmek: birinci ve ikinci klonal üreme yayımlanan yavru toplam sayısı.
   8. Euler denklem (1) kullanarak tahmini nüfus artış hızı tedbir:
      (1)
      L_x yaş xhayatta kalma oranı, b_x Yenidoğan Bebeklerin sayısı yaş xhayatta kalan tek tek başına üretilen ve r iç doğal artış oranıdır nerede.
   9. Piyasada bulunan yazılım kullanarak istatistiksel çözümleme gerçekleştirme. Burada, R³¹ tepki normları (ortamlar arasında tek bir genotip fenotipik ifade) ggplot2 paketi kullanarak her hayat Tarih özelliği için çizmek için kullanın. Mortalite oranları Sağkalım analizi (R paket rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf) üzerinden başına hesaplayın. Son olarak, sıcaklık etkisi özellikleri (nüfus arasında farklılıklar), evrim tarafından açıklanabilir olup olmadığını değerlendirmek için R³¹ yılında bir Varyans analizi (ANOVA, Tablo 2) gerçekleştirmek plastisite (tedaviye yanıt) veya evrimi plastisite (nüfus tedavi x).
2. Yarışma deneme
   1. Nüfus başına on yavru hisse senedi kültürleri ortak Bahçe koşulları için transfer: 20 ° C, uzun photoperiod (16:8 ışık: karanlık rejimi), günlük 0,8 mg C/L Chlorella vulgaris, yem ve orta iki günde yenilemek. Ortak Bahçe koşulları müdahalelerden anne etkileri azaltmak en az iki kuşak (ca. 45 gün) için korumak.
   2. Rastgele beş gençlere 24-48 h 10 hayvanlar/L. yoğunluğu, triplicates içinde deneysel mesocosms 20 L (plastik aquaria), orta ile dolu her yavru ikinci nesil ikinci damızlık atama
   3. 24 ° c, 16:8 L:D rejimi, mesocosms ortaya çıkarmak ve günlük 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris ısı kontrollü odası veya en az dört hafta için kuluçka makinesi ile besleme (> 3 klonal nesiller).
   4. Her mesocosm haftalık, Daphnia Doğal ortamında karşılaşabileceğiniz bir nüfus dinamik benzetimi yapmak için orta yüzde 10'u yenileme itlaf. Bilinen hacmi orta ve her akvaryum (Bu durumda 1.2 L) hayvanlardan kaldırma ve toplandılar birim ile taze orta yerine itlaf empoze. Deneysel hayvan olgunluğa (10 gün) sonra culling rejimi başlatın.
   5. Dördüncü haftanın sonunda, vardiya ile karşılaştırıldığında ilk inoculum genotypic bileşiminde değerlendirmek için her mesocosm 32 hayvanlardan örnek.
      1. Bireysel Daphnia microcentrifuge tüplerde yerleştirin ve aşırı sıvı Pasteur pipet yardımıyla kaldırın.
      2. Flaş dondurma bireysel tüpler sıvı azot ve-80 ° C'de store
      3. Genomik DNA kullanılabilir iletişim kurallarını kullanarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek tek bireylerin ayıklayın.
      4. Ayıklanan DNA genetik işaretler civciv başına benzersiz bir multilocus genotip sağlamak için yeterli sayıda kullanarak yükseltmek. Burada, tek bir multiplex (M01, Tablo 1) düzenlenmiş 8 mikrosatelit kurulan iletişim kuralları^32,33takip kullanılmıştır.
      5. Genotip bir parçası analyzer parçaları güçlendirilmiş.
      6. Parça analizi uygun boyutu standart kullanarak ticari veya serbestçe elde edilebilir ile a bilgisayar yazılımı yapmak.
      7. Genotypic düzenleme microsatellite loci bir dizi deney Genotipleme 32 bireyler tarafından sonunda açıklanan³³ve deney ile karşılaştırıldığında ilk inoculum sonunda her genotip sıklığı hesaplama olarak değerlendirmek.

Şekil 5: yetişkin kadın Daphnia magna. Yetişkin kadın Daphnia magna parthenogenetic yumurta kuluçka odasında. Baş ve kuyruk omurganın arasındaki mesafe hayvan boyutunu ölçmek için kullanılır. Kırmızı çizgiler, boyut ölçümleri gösteriyor. Ölçek çubuğu 500 µm =.

Sonuçlar

Uzun vadeli ampirik veri anlama evrimsel dinamikler ve sebat doğal nüfus için kritik öneme sahiptir. Bu gibi veriler geçici örnekleri ve veri toplama için uzun vadeli taahhütte bulunmadan şartı erişme ile ilgili lojistik zorluklar nedeniyle elde etmek için genellikle zor. Burada sunulan iki önemli çalışmalarda temiz su ekosistemleri içinde merkezi bir zooplankter sıcaklığını yanıt ampirik kanıtlar üzerinde evrimsel kez sağlanır. Bu tarihsel nüfus ve modern torunları cevaben ortak deneysel ayarlarında çevresel stres çalışma fırsatı sağlar katmanlı uyuyan yumurta bankalar kullanılarak etkinleştirilir.

Ortak Bahçe deney
Tüm yaşam öyküsü özellikleri sıcaklık için yanıt ortak Bahçe deneme gösterdi (şekil 6 ve Şekil 7). ANOVA çözümleme tüm (alt) örneğin alınma olasılığını yanıt vermeyen ölüm dışında yanıt sıcaklığa plastisite (Tablo 2), üzerinden ortaya. Evrimsel değişiklikler ((alt) nüfus arasındaki farklar) kanıtı iki üç önemli ölçüde artış sadece nüfus artış hızı (Tablo 2), içinde gözlenen (alt) nüfus 24 ° c (şekil 6).

Şekil 6: ortak Bahçe deney. Reaksiyon normları yaşam öyküsü özellikleri (verimlilik, boyutu ve yaş Vadesinde) ve nüfus artış hızı (r) için ortak Bahçe ve geçerli sıcaklık rejimi (18 ° C) ile karşılaştırıldığında (24 ° C) ısınma sıcaklık altında her (alt) nüfus için gösterilir. Nüfus artış hızı 'r' (1) Eulerian Denklem kullanılarak hesaplanır. Güven aralıkları gösterilmiştir. (Sub) nüfus are renk kodlu: (i) mavi: 1960-1970; (ii) yeşil: 1970-1985; (iii) kırmızı: > 1999. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: ölüm. Mortalite oranları (alt) nüfus başına (1960-1970; 1970-1985; > 1999) ısınma (24 ° C altında) modern sıcaklık rejimleri (18 ° C) ile karşılaştırıldığında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Mesocosm deneyi
Seçimin dört hafta sonra temsil 24 ° C, frekans üç ısınma tarafından (alt) nüfus değişmedi (χ² 0,55, P = 0,76 =) ile karşılaştırıldığında ilk inoculum (şekil 8). Mesocosm deneyde aşısını 30 genotip arasında çoğunluk seçim (Şekil 9) dört hafta sonra tespit edilmiştir. Özellikle, %70 inoculated genotip kurtarılan, her bir örnek 32 bireylerin genotip en az bir temsilcisi kurtarma Poissonian beklenti ile uyumlu idi.

Şekil 8: yarışma deneme - nüfus sıklığı. Nüfus ortalama medyan ve Dörttebirlikler (25^inci ve 75^inci), üç için gösterilen D. magna (alt) nüfus mesocosm rekabet deneyler (24 ° C), bir başlangıç eşit frekansta (karşılaştırıldığında seçimde dört hafta sonra başlangıç). (Sub) nüfus renk şekil 6' da gösterildiği gibi kodlarına sahiptir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 9: yarışma deneme - genotip sıklığı. Genotip Frekanslar — ortalama medyan ve Dörttebirlikler (25^inci ve 75^inci), ısınma (24 ° C) ile karşılaştırıldığında genotip (noktalı çizgi) bir başlangıç eşit sıklığını maruz dört hafta sonra gösterilir. X ekseni üzerinde isimleri (alt) nüfus gruplandırılmış aşısını genotip kimliği (mavi, 1960-1970; yeşil, 1970-1985; kırmızı, > 1999). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Odağı	BİR	Boyut aralığı (bp)	Astar (5' - 3')		Boya etiket	Tekrar motifi	TM
B008	HQ234154	150-170	F: TGGGATCACAACGTTACACAA		VIC	(TC) 9	56
			BİLGİ: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030	HQ234160	154-172	F: CCAGCACACAAAGACGAA		EVDE BESLENEN HAYVAN	(GA) 11	56
			BİLGİ: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045	HQ234168	118-126	F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC		NED	(TG) 8	56
			BİLGİ: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050	HQ234170	234-248	F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC		6FAM	(GAA) 6	56
			BİLGİ: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064	HQ234172	135-151	F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA		6FAM	(TC) 8	56
			BİLGİ: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074	HQ234174	196-204	F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT		NED	(GT) 9	56
			BİLGİ: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096	HQ234181	234-240	F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA		VIC	(AC) 15	56
			BİLGİ: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107	HQ234184	250-274	F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA		EVDE BESLENEN HAYVAN	(CT) 8	56
			BİLGİ: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

Tablo 1: Microsatellite multiplex. NCBI katılım numarası (AN), çok katmanlı bilgi, PCR astar dizileri, PCR boyutu aralığı, tekrar motifi, ileri astar ve tavlama sıcaklığı (Tm) gösterilen etiket için kullanılan boya.

Pop büyüme oranı (r)		DF	F	P
Evrim (Pop)		2	30.309	< 0,001
Plastisite (Temp)		1	531.546	< 0,001
Evol. Plastisite (Pop x Temp)		2	65.137	< 0,001
Mortalite		DF	F	P
Evrim (Pop)		2	2.234	0.1162
Plastisite (Temp)		1	2.679	0.1071
Evol. Plastisite (Pop x Temp)		2	1.8657	0.164
Verimlilik		DF	F	P
Evrim (Pop)		2	1.8852	0.1633
Plastisite (Temp)		1	6.8934	0.0117
Evol. Plastisite (Pop x Temp)		2	1.6511	0,203
Vadesinde boyutu		DF	F	P
Evrim (Pop)		2	0,211	0.8106
Plastisite (Temp)		1	11.1361	0.0017
Evol. Plastisite (Pop x Temp)		2	0.6586	0.5225
Vade sonunda yaş		DF	F	P
Evrim (Pop)		2	0.7811	0.4637
Plastisite (Temp)		1	8.0764	0.0066
Evol. Plastisite (Pop x Temp)		2	0.088	0.9159

Tablo 2: Varyans analizi (ANOVA). Hayat Tarih özellikleri ve nüfus artış hızı ısınmaya maruz dirilen (alt) örneğin alınma olasılığını değişiklikler evrimsel adaptasyon (nüfus), plastisite (sıcaklık tedavi), tarafından açıklanmıştır mi test Varyans analizi ve onların etkileşim dönem (plastisite evrimi). Önemli p-değerleri (p< 0,05) kalın olarak gösterilir.

Ek Video 1: tortu çekirdek örnekleme. Big Ben corer kullanımı gösterilmiştir. Big Ben 14 cm bir iç tüp çapı yaklaşık 1,5 m uzunluğunda bir çekirdek boru var. Bir ip ve çubuklar tüp tortu sürücüye bağlı bir corer kafa, bir piston oluşur. Bir çekirdek alıcı küçük bir gemi dağıtılan çekirdek tüp desteklemek için kullanılır. Piston yerçekimi basıncı ile tortu aşağı itti. Bir çerçeve çekirdek tüp pistonu yukarı doğru iter bir değiştirilmiş şişe jack kullanarak yapılan ekstrüzyon işlemi sırasında desteklemek için kullanılır. Her tortu katmanı düz metal bir yüzeye dokunarak toplanan ve uzun süreli depolama için şeffaf örnekleme çanta transfer [karanlık ve soğuk (4 ° C) koşulları]. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Video 2: Sediment eleme. Sediment eleme için gerekli duyarlılık ölçeği, beyaz örnekleme tepsiler ve jeolojik elekler cihazıdır. Her tortu katmandan en az 5 g radyometrik flört için korunur. Tortu kalan ephippia izole etmek için kullanılır. Tortu ile iki jeolojik elekler, 1 mm ile bir ve ikinci birbiri üstüne yığılmış 125 µm Kafes boyutu ile elenmiş. Orta kil, büyük omurgasızlar ve Partiküler madde ayırmak için 1 mm mesh elek dökülür. 125 µm fileli ikinci elek üzerine döküp orta D. magna ephippia ve küçük partikül madde ayırır. Tortu aliquots sonra bir beyaz örnekleme tepsiye aktarılır. D. magna ephippia göz beyaz arka plan tepsisinde tarafından farkedildi. Ephippia her katmandan ayrı Petri yemeklerinde toplanır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Video 3: kapsülden çıkarma. Bir stereomicroscope altında D. magna ephippia açılan mikrodiseksiyon Forseps ile kitin durumda omurga üzerinde basınç uygulayarak. İç yumurta membran ince kaldırılır ve yumurta hafifçe dinlenme Pasteur pipet ile orta 10 mL içeren bir Petri kabına aktarılır. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Video 4: çıkım. Uzun photoperiod ve 20 ° C maruz kaldıktan sonra embriyo gelişimi 48 h ile birkaç hafta arasında devam eder. Geliştirme tamamlandığında, embriyo yumurta kabuğu'arın ve serbestçe ortamda yüz. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Nedeniyle yüksek ısı iletkenliği su, temiz su ekosistemleri küresel karşısında karasal ekosistemler daha biyolojik çeşitlilik kaybı daha yüksek risk altındadır³⁴ısınma. Bu, bu nedenle, bu ekosistemleri içinde kilit taşı tür yanıt anlamak ve termal stres hayatta kalmak için başa çıkma mekanizmaları belirlemek için önemlidir. Bu mekanizmalar, türler ve topluluk düzeyde anlayış nasıl tür küresel ısınma tarafından etkilenen ve nasıl bireysel türler üzerinde etkisi diğer trophic seviyelere basamaklandırır tahmin yardımcı olabilir. Sonuçta, küresel ısınma yanıt-e doğru mekanizmaları anlama yok olma azaltmak için düzeltme stratejilerini tanımlamasını sağlar.

Burada sunulan örnek çalışmalar D. magna cevaben sıcaklık artışı pervasively plastisite'hayat Tarih özellikleri tarafından aracılık ettiği ve yanıt-e doğru sıcaklık artışı yalnız açık fitness maliyeti, empoze etmez göstermek en az olarak nüfus burada okudu. ' Hayat Tarih özellikleri yüksek plastisite ısınma varlığında (alt) örneğin alınma olasılığını rakip yeteneklerine önemli olmayan farklılıklar tarafından desteklenmektedir. Ancak, birden fazla nüfus üzerinde uzun vadeli rekabet deneyler bu bulgular genelleştirmek gerekli olabilir.

Uyuyan aşamaları dirilişi adaptasyon mekanizmaları ve yörüngeleri ile saat¹⁰bir tür evrim çalışmaya benzeri görülmemiş bir kaynak sağlar. Plankton tür bir hızlı oluşturma süresi (yaklaşık 2 hafta) ve bir üst headtohead kendi alt öğelerin karşı rekabet etmek veya çeşitli geçmiş Amerika'dan başlar evrim ' yeniden ' sağlayan uyuyan aşamaları, canlılığı yararlanın. Diriliş ekoloji aslında belirli bir evrimsel sonuca bazı önceki olayda şarta olup araştırma sağlar. Evrim genetik unsurları kimlik laboratuvar deneyleri için 'atalarının lines' donmuş ve resüsite mikroorganizmaların onların Gelişmiş alt⁶ile karşılaştırmalı analizi için kullanma içinde şu anda mümkün değildir. Ancak, bir laboratuvar organizmalar ile çalışmanın ana sınırlamaları 'atalarının devlet' zaten değiştirdi bir temel olmasıdır. Uyuyan aşamaları çalışma örneklerin zaman herhangi bir stres olay (örneğin, bozulmamış çevre koşulları) öncesine ve çeşitli son durumları için bozulmamış çevre koşullarından evrimsel yörüngeleri ölçmek için örnekleme sağlar Modern zamanlara kadar. Son yıllarda, bugünkü nüfusu¹⁴ genetik katkıda bulunmuştur son demografik ve edinilmiş süreçleri önemli anlayışlar dirilen veya hala atıl plankton aşamaları DNA polimorfizmi çalışmanın sağlamıştır ^{, 16 , 25 , 33 , 35 , 36}. yüksek işlem hacmi sıralama teknolojileri daha yüksek erişilebilirlik ile genom ve dirilen veya hala atıl etap transcriptome sıralı ve genetik değişiklik sayısını ve türünü birikmiş nüfus üzerinde gelişen süre ölçülür.

Diriliş burada sunulan SOP iki düzeyde multi-omics alanında önemli uygulamaları vardır. Multi-omics teknolojileri dirilen numuneler, moleküler öğeleri ayrıntılı bir analizini çevresel seçim basınç adaptif yanıt katılan izin uygulanabilir. Buna ek olarak, omics teknolojileri decapsulated ama hala atıl aşamaları için uygulanabilir. Şimdiye kadar yüksek işlem hacmi sıralama teknolojilerinin uygulanması aşamalarında istirahat için giriş malzeme büyük miktarda ihtiyaç tarafından sınırlıdır. Bu sınırlamalar kaldırdı³⁷davranıyorsun. Giriş malzeme ve nanofluidics devam eden düşürücü gereksinimleri ile tüm genom sıralama (WGS) Şimdi mümkün olduğunca az 1 ng veya malzeme³⁸başlayan bir kaç pg. Tüm genom amplifikasyon (WGA) ve tüm transcriptome güçlendirme (WTA) teknikleri, DNA ve RNA doku, çok küçük tutarlar üzerinden zenginleştirme sağlayan kullanımı metagenomics^39,40 ve tıp devrim yarattı ⁴¹araştırma. Decapsulated uyuyan yumurta için uygulanan bu teknolojiler uyuyan aşamaları canlılığı ve Genişletilmiş zaman dönemleri (örneğin, yüzyıllar) soruşturma ile ilgili sınırlamaları aşan etkinleştirin.

Omurgasız topluluklar dinlenme aşamaları üreten dirilişi topluluk geçmişleri bilinen doğal manzara değişimler ya da çevresel değişiklikler çökeller orsoils²analizleri anlaşılmaktadır hizalamasını sağlar. Topluluk değişiklikleri yanıt olarak çevresel değişimin analizi bize yeteneği önemli sonuçlara yol nüfus sebat⁴³at, trofik etkileşimleri^{44 Eko-evrimsel yorumlarından42 ölçmek için sağlar} , toplum derleme⁴⁵ve ekosistem işlevleri ve Hizmetleri⁴⁶değişimler. Son olarak, çevresel değişimin biyolojik yanıt hakkında doğru Öngörüler biyolojik çeşitlilik⁴⁷korunması rehberlik olağanüstü vardır. Geçerli tahmin modelleri bu açıdan yanlış olduklarından onlar hesap önemli biyolojik mekanizmaları demografi, dağılma, evrim ve tür etkileşimleri gibi içine almayın. Nasıl bu işlemlerin zaman içinde değişim anlama ve tahmin modelleme içinde bir rahip olarak bu bilgileri kullanarak tür tahmin yeteneğimizi artıracak ve topluluk sebat karşısında çevre değiştirmek².

Burada sunulan SOP uygulama zorlukları değildir. Uyuyan aşamaları resurrecting birincil sınırlaması örnekleme için özel ekipman ihtiyacı var. Ayrıca, tortu klonal kültürlerin kurulması için eleme üzerinden tüm süreci önemli bir uygulamalı zaman gerektirir.

Burada sunulan SOP adımlardan bazıları diğer Daphnia türler için kolayca transfer edilebilir. Bunlar: örnekleme, klonal hatları ve deneysel tasarım kurulması. Ancak, SOP diğer adımları daha fazla en iyi duruma getirme türü altında eğitim için özel olarak tasarlanmış gereken. Kapsülden çıkarma kez tarama başarı geliştirmek için D. magna numuneler için uygulanır. Ancak, bu yaklaşım küçük örnekler için uygun olmayabilir. Uyaranlara yumurtadan da türler⁴⁸ ve conspecific numune⁴⁹arasında değişebilir. Bu nedenle, SOP çıkım adımlardan geçici bir optimizasyon uygulamaları diğer kabuklular için önce gerekli olabilir. Önceki sonuçları⁴⁹doğrultusunda tarama başarıdır Gölü yüzük (tortul Arşiv genelinde %30,5) üzerinden yeniden canlandırmak D. magna nüfusunun iken başarı kuluçkalık tortu, türler ^{koruma durumu ile değişir 50,51}ve tortu⁴⁸coğrafi kökeni. Giriş ve ilerleme diapause aşamalarında düzenleyen mekanizmalar gelecekteki çalışmaları farklı türler için özel olarak tasarlanmış en iyi damızlık uyaranlara tanımlamak için gereklidir.

Son olarak, bilgi eğitim sisteminin arka plan, özellikle ilgi zamanla, türlerin varlığı tavsiye. Bu tarihi yazmak yolu ile elde edilebilir. Tarihsel kayıtlar mevcut değilse, yalnızca en son tarih bilgileri sağlayabilir, ancak örnekleme ve göl tortu çekirdek örnekleme önce yüzey kat eleme, önerilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
sampling bags	Fisher Scientific	11542783	Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer	ENSIS ltd	na	Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale	Veritas-M124A	TLP-50	Analytical Balance
geological sieve	UKGE limited	SV7521	200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve	UKGE limited	SV7525	200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray	nhbs	http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509	Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette	Globe Scientific inc.	138020B	Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope	nikon	smz800	Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish	EduLab	153-533	Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars	compak	Round Jam Jars 4oz	100 mL jars
glass jars	compak	Atum Jars/ Bonta Jar 10oz	200 mL jars
glass jars	bottlecompanysouth	500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid	500 mL jars
statistical software R	https://cran.r-project.org/	na	Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps	Fisher Scientific	41122405	Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	na	Open source ImageJ image processing toolkit written in Java
mesocosm	amazon	na	Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes	Sigma_Aldrick - Merck	Z606340	premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance	Beckman Coulter	A48705	DNA extraction kit
size standard	Thermo Fisher Scientific	4322682	LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer	ABI	na	Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing