Risurrezione di dormienti Daphnia magna: protocollo e applicazioni

Riepilogo

Studi a lungo termine sono essenziali per comprendere il processo di evoluzione e i meccanismi di adattamento. In generale, questi studi richiedono impegni oltre la durata dei ricercatori. Qui, un potente metodo è descritto che avanza drammaticamente la raccolta dei dati di stato-of-the-art per generare dati longitudinali nei sistemi naturali.

Abstract

Studi a lungo termine permettono l'identificazione dei processi eco-evolutivi che si verificano nel corso di lunghi periodi di tempo. Inoltre, essi forniscono chiavi dati empirici che possono essere utilizzati nella modellazione predittiva per prevedere risposte evolutive degli ecosistemi naturali ai futuri cambiamenti ambientali. Tuttavia, escludendo alcuni casi eccezionali, studi a lungo termine sono scarsi a causa di difficoltà logistiche associate all'accesso ai campioni temporali. Dinamiche temporali sono frequentemente studiati in laboratorio o in esperimenti controllati mesocosmo con studi eccezionali che ricostruire l'evoluzione delle popolazioni naturali allo stato brado.

Qui, una procedura operativa standard (SOP) viene fornita a rivivere o resuscitare dormienti Daphnia magna, una specie di chiave di zooplancton diffusa negli ecosistemi acquatici, per avanzare drammaticamente la raccolta di dati longitudinali state-of-the-art in sistemi naturali. Campo dell'ecologia di risurrezione è stato definito nel 1999 da Kerfoot e colleghi di lavoro, anche se i primi tentativi a Cova data di uova di zooplancton diapausing torna alla fine degli anni 1980. Dal carta seminale di Kerfoot, la metodologia di resuscitare specie di zooplancton è stata applicata sempre più spesso, se propagato tra laboratori solo tramite il trasferimento di conoscenza diretta. Qui, un contentino è descritto che fornisce un protocollo dettagliato sulla pratica della Resurrezione dormienti Daphnia magna della uova.

Due studi chiave sono la condizione in cui la risposta di fitness del resuscitato Daphnia magna popolazioni di riscaldamento viene misurato, capitalizzando sulla capacità di studiare popolazioni storiche e moderne nelle stesse impostazioni. Infine, l'applicazione di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione alle fasi di riprese o ancora dormiente è discussa. Queste tecnologie forniscono potenza senza precedenti a dissezionare i processi e i meccanismi dell'evoluzione se applicato a popolazioni che hanno vissuto cambiamenti nella pressione di selezione nel corso del tempo.

Introduzione

Studi a lungo termine sono fondamentali per la comprensione dei processi ecologici ed evolutivi in natura e nella valutazione come specie rispondere agli e persistono durante i cambiamenti ambientali¹. Questo è perché i processi eco-evolutivo avvengono attraverso le generazioni e cambiamenti nell'ambiente si verificano nel corso di lunghi intervalli di tempo. Inoltre, gli studi a lungo termine forniscono chiavi dati empirici che migliorano la precisione della modellazione predittiva per prevedere risposte evolutive degli ecosistemi naturali a cambiamenti ambientali². La precisione di questi modelli è fondamentale per attuare strategie di gestione e di conservazione per preservare la biodiversità e servizi ecosistemici.

Escludendo alcuni casi eccezionali (ad es., Galapagos Darwin finches³ e alghe⁴), studi a lungo termine sono in gran parte limitati alle specie con tempo di generazione brevi che possa essere propagato in laboratorio^{5,6 , 7 , 8}. quindi, i processi alla base della dinamica evolutiva rimangono evasivi. A causa di difficoltà logistiche associate all'accesso ai campioni temporali, i dati empirici sono stati studiati più frequentemente in un spaziale rispetto a un contesto temporale e temporali processi eco-evolutivi sono dedotte o modellati dai dati spaziali. Questo approccio è noto come 'spazio-per-ora' sostituzione⁹, per cui lo spazio è adottato come un surrogato per studiare la dinamica evolutiva temporale. La principale limitazione della sostituzione 'spazio-per-ora' è che i tassi di adattamento alle diverse scale spaziali differiscono da variazione temporale nella stessa popolazione; quindi, inferenze sulla sostituzione di tempo con lo spazio della base sono prevenuto¹⁰.

Una potente alternativa che permette di studiare le dinamiche evolutive negli ecosistemi naturali nel corso del tempo è l'analisi dei cambiamenti ecologici e genetici in specie producendo dormienti fasi¹¹. Queste fasi dormienti si accumulano modulo stratificato archivio biologico che può essere accuratamente datata e caratterizzato paleolimnologically^12,13. D'importanza, queste fasi dormienti possono essere rianimate e utilizzate negli esperimenti del laboratorio, dove loro risposta evolutiva al cambiamento ambientale possa essere misurata direttamente. Popolazioni storiche possono essere gareggiati contro loro discendenti moderni evoluti per studiare i cambiamenti di fitness e la funzione dei geni in evoluzione al passo con i cambiamenti ambientali^14,15,16.

Dormienti fasi includono semi, spore, cisti e banche di uova. Sebbene i primi studi su uova dormienti rianimato fa risalire la fine degli anni 1980 di¹⁷e una manciata di studi hanno applicato questa tecnica a inizio anni 1990^18,19, il campo dell'ecologia di risurrezione è stato formalmente stabilito dalla carta seminale di Kerfoot e collaboratori nel 1999²⁰. Questa pratica è stata applicata principalmente nelle ricostruzioni di paleolimnological di specie d'acqua dolce^17,21,22. Tuttavia, una SOP non è ancora disponibile. Qui, viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo risurrezione applicata al dormiente uova delle specie di zooplancton Daphnia magna , dal campionamento di sedimento all'istituzione delle culture clonale da hatchlings. Passi del SOP prontamente trasferibili ad altre specie di dafnie, così come passaggi che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione, sono discussa.

Daphnia sono d'acqua dolce zooplankters presente nella maggior parte dei habitat lotici²³ . Specie di Daphnia sono entrambi obbligano altre asessuale o ciclica. D. magna è una partenogenesi ciclica che riproduce clonally sotto condizioni ambientali favorevoli²⁴. Quando le condizioni ambientali si deteriorano, produzione maschio si verifica e ricombinazione sessuale conduce alla formazione di uova fecondate che entrare in uno stato di dormienza protetto dall'ambiente da un caso di chitina chiamato ephippium. Una parte di queste uova dormienti si schiudono quando ritorno di condizioni ambientali favorevoli. Tuttavia, una parte consistente della banca dormienti uovo non ha mai una probabilità a schiudersi e così costruire archivi biologici nel tempo. Fasi dormienti rimangono sepolti nei sedimenti di laghi e stagni e possono essere ripristinati per lo studio delle dinamiche evolutive nel corso di lunghi periodi di tempo. Poiché le uova dormienti di d. magna sono il risultato della ricombinazione sessuale, sono una buona rappresentazione della naturale diversità genetica delle specie²⁵. Inoltre, essi possono essere gestiti tramite riproduzione clonale in laboratorio. Queste caratteristiche forniscono il vantaggio unico di organismi modello isogeniche, pur mantenendo la naturale diversità genetica.

Due studi chiave sono presentati per dimostrare i vantaggi di confrontare direttamente discendenti di storici e moderni della stessa popolazione di d. magna vivendo pressione di selezione ambientale nel corso del tempo. D. magna esemplari furono resuscitati dall'anello di lago (Danimarca), un poco profonde (5 m di profondità; superficie 22 ettari) stagno misto che ha sperimentato un aumento nell'avvenimento di temperatura e ondate di calore medio nel tempo. D. magna (sotto) popolazioni sono stati resuscitati lungo questo gradiente temporale che dura da 60 anni (1960-2005) e studiati per studiare la risposta evolutiva al temperatura riscaldamento. Nel primo studio in un esperimento di giardino comune, cambiamenti nei tratti di storia di life fitness-collegato sono stati misurati in risposta ad un aumento della temperatura di + 6 ° C, in linea con le previsioni dell'Intergovernmental Panel for Climate Change per i prossimi 100 anni ²⁶. nel secondo studio, un esperimento di mesocosmo fu utilizzato per misurare la capacità competitiva dei tre (sotto) popolazioni sotto il riscaldamento. Questi esperimenti combinati mostrano che in presenza di riscaldamento come lo stress solo, tutti i tratti di storia di vita e popolazioni mostrano un elevato livello di plasticità e hanno uguale abilità competitiva. Questi risultati suggeriscono che il riscaldamento come un singolo stress non imponga costi significativi fitness, almeno nella popolazione studiato qui.

Protocollo

Il SOP seguente fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per resuscitare Daphnia magna uova dormienti, compresa una descrizione dettagliata del campionamento, isolamento di efippi dal sedimento e istituzione di culture clonale ( Figura 1).

Figura 1: Guida passo passo alla resurrezione di Daphnia magna. Sedimenti da un habitat d'acqua dolce naturale (A) viene campionato con un carotiere a pistone (B). Il nucleo di sedimento (C) viene affettato in livelli incrementali di 1 o 0,5 cm (D). Ogni strato di sedimenti è memorizzato in un sacchetto a chiusura zip campione (E) in condizioni di buia e fredde (4 ° C). Ogni strato di sedimenti viene pesato e setacciata utilizzando setacci geologici (1 mm e 125 µm maglie, F). Vassoi di sfondo bianco sono utilizzati per isolare efippi Daphnia magna (G). Decapsulate dormienti (H) sono trasferiti a capsule di Petri ed esposto a stimoli di luce e temperatura per indurre la schiusa. Hatchlings sono trasferiti per separare i barattoli (io) per stabilire le linee di isoclonal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. i prelievi di carote di sedimento

1. Sedimento del campione da laghi o stagni utilizzando un carotiere a pistone. Questo protocollo utilizzato Big Ben²⁷, un tubo di centro di circa 1,5 m di lunghezza con un diametro del tubo interno di 14 cm. Big Ben è costituito da un pistone su una corda e una testa di carotiere, a cui sono attaccati canne per guidare il tubo nel sedimento. Un catcher di core aiuta il supporto del tubo core quando è pieno di sedimenti. Per estrudere il sedimento, un quadro mantiene il tubo carotiere verticale e stazionario, e un jack di bottiglia modificate viene utilizzato per spingere il pistone verso l'alto durante il processo di estrusione (complementare Video 1).
   1. Per stagni poco profondi di meno di 1 m di profondità, è necessario utilizzare un carotiere di gravità in plexiglass di non più di 6 cm di diametro spinto manualmente nel sedimento.
   2. Per laghi profondi (> 6 m di profondità), utilizzare Livingston pistone carotatori²⁸ o carotatori sedimento di singola unità Griffith con gli aiuti di una barca del pontone ancorato. Il Carotiere a pistone di Livingstone-tipo unità asta utilizzabile in acqua fino a circa 30 m profondo per raccogliere successivi un metro unità di morbido al lago consolidato sedimento. Il carotiere di Griffith di singola unità è costituito da una testa di base semplice ma robusto che collega i tubi in policarbonato standard ai coni retinici di unità di Livingstone. I carotatori sono spinti nel sedimento con le aste, e un pistone fornisce l'aspirazione necessaria per il recupero di sedimenti (Figura 2).
   3. Per il recupero continuo, nuclei indisturbati, utilizzare vibracoring. Questi carotatori lavorano su una varietà di profondità dell'acqua e possono recuperare campioni di carote di diverse lunghezze, a seconda della litologia di sedimento. Vibrazione bassa ampiezza che viene trasferito da vibracore testa in giù attraverso il barile annesso o tubo carotiere liquefa sedimenti, consentendo il carotiere collegato all'unità di vibracore di penetrare i sedimenti liquefatti. Alcuni vibracorers sono piccoli, leggeri e portatili, altri sono grandi unità pesanti che possono essere distribuiti solo da grandi vasi. La scelta di carotatori dipende la litologia dei sedimenti.
2. Affettare il nucleo orizzontalmente in livelli incrementali di 1 cm o meno usando una superficie metallica piana (complementare Video 1). Carotatori sedimento come quella usata qui sono progettati per ridurre pressioni idrostatiche a estrusione, riduzione disturbo degli strati di sedimenti. Quando vengono utilizzati altri carotatori, la scorza esterna di ogni strato di sedimento può essere rimosse con una sorta di biscotto-taglierina della lama per limitare la contaminazione tra i livelli.
3. Ogni strato di sedimenti in un sacchetto di campionamento separato (complementare Video 1) di raccogliere e memorizzare nel buio e freddo (4 ° C) condizioni.
4. Raccogliere un minimo di 5 g di sedimento da tutti i livelli per la datazione radiometrica. Datazione radiometrica è un protocollo stabilito per una descrizione dettagliata del dosaggio datazione, si riferiscono alle attuali pubblicazioni^12,13.

Figura 2: Cartoon del pistone carotaggio procedura. Carotiere a pistone, un tubo vuoto con una guarnizione scorrevole interna (il pistone) che produce un vuoto debole. Quando il pistone tocca l'interfaccia acqua-sedimento, il peso spinge il carotiere nel sedimento e il vuoto provoca il sedimento viene animato per immettere e spostare il tubo senza disturbare gli strati di sedimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. setacciatura di strati di sedimenti

1. Utilizzando una scala di precisione, pesare ogni strato del sedimento per riferimento futuro. Utilizzare la superficie ed il peso per calcolare la densità di specie nel lago.
2. Passare al setaccio ogni strato di sedimenti utilizzando due setacci geologici accatastati uno sopra l'altro. Il primo setaccio ha una dimensione di maglie di 1 mm e separa argilla, grandi invertebrati e particolato, ad es. semi, piante e insetti, dal resto del sedimento. Il secondo setaccio ha una maglia di 125 µm e separa d. manga efippi e particolato piccolo e dal resto del sedimento (complementare Video 2).
3. Trasferimento piccole aliquote della frazione sedimento raccolto sul setaccio con maglie 125 µm a un vassoio di sfondo bianco. A seconda del tipo di sedimento, maggiori o minori aliquote di sedimento possono essere trasferite in ogni momento.
   1. Aggiungere piccoli volumi (fino a 200 mL) di medie e il vassoio di campionamento bianco per risospendere la frazione di sedimento trasferiti e facilitare occhio spotting di efippi (Figura 3). Il mezzo utilizzato per risospendere il sedimento può essere declorurata acqua di rubinetto, acqua di pozzo trivellato, COMBO²⁹o ADaM medio (Aachener Daphnien)³⁰. Qui di seguito, il termine 'medium' verrà essere utilizzato per fare riferimento a una o tutte le soluzioni elencate.

Figura 3: Ephippium di Daphnia magna . Dormiente Daphnia magna uova subito dopo decapsulamento. L'ephippium (A), la membrana interna dell'uovo (B) e le uova dormienti (C) sono riportate. Barra della scala = 500 µm.

3. decapsulation di efippi e schiusa

1. Con una pipetta Pasteur o usando il microdissection forcipe, trasferimento efippi individuali di Petri riempito con 10 mL di terreno. Utilizzare almeno una capsula Petri per strato di sedimento.
2. Microscopio stereo, estrae ogni efippi usando il microdissection forcipe forzando aperto il caso di chitina (complementare Video 3). Rimuovere delicatamente la membrana interna dell'uovo che riposa, prestando attenzione a non interferire con le uova e trasferirli di Petri riempito con medium facendo uso di una pipetta Pasteur. Decapsulamento aumenta il successo di schiusa in d. magna; tuttavia, non può essere richiesto o può essere difficile per le altre specie di Daphnia producendo efippi più piccoli.
3. Esporre i decapsulate per una luce a spettro completo lunga giornata fotoperiodo (16:8 luce: scuro) e ad alta temperatura (20 ± 1 ° C) per indurre la schiusa in una camera o un dispositivo a temperatura controllata (incubatore). Schiusa delle uova avviene tra 48h e diverse settimane (fino a quattro; Complementare dei Video 4). In assenza di decapsulation, esporre direttamente l'efippi alla schiusa stimoli (lunga giornata fotoperiodo luce (luce: scuro 16:8) e ad alta temperatura (20 ± 1 ° C)).

4. stabilire linee di Isoclonal di Daphnia magna

1. Stabilire le linee di isoclonal da singolo hatchlings trasferendo individuale d. magna da passo 3.3 per separare vasi pieni di 200 mL di terreno utilizzando una pipetta Pasteur. Ogni individuo è geneticamente distinta, essendo il risultato della ricombinazione sessuale.
2. Mantenere linee di isoclonal a tempo indeterminato in condizioni d'archivio che consiste di 10 ± 1 ° C, regime di luce: scuro 16:8, alimentati settimanalmente con 0,2 mg C/L di Chlorella vulgaris o altre alghe verdi (ad es., Scenedesmus obliquus). Rinnovare il mezzo ogni terza settimana. Condizioni d'archivio può cambiare con temperatura, regimi e specie di alimentazione.

5. principali studi

Nota: È fornita una descrizione di due studi principali in cui risorto D.magna (sotto) popolazioni dall'archivio sedimentario del lago anello (Danimarca) sono utilizzati per valutare la risposta evolutiva al riscaldamento. Tre (sotto) popolazioni furono resuscitati nei seguenti periodi: 1960-1970, 1970-1985, e > 1999. D. magna da cova successo dall'archivio sedimentaria ha variato fra 11 e 58% (Figura 4). Dalle hatchlings ottenute da ogni timeperiod, un sottoinsieme casuale è stato scelto per i due studi chiavi descritti qui. Questi studi sono stati progettati per valutare se (sotto) popolazioni resuscitati da periodi di tempo differenti lungo il gradiente di temperatura hanno evidenziato differenze nei tratti di storia di life fitness-collegato (5.1), e se avevano diverse abilità competitiva (5,2) dopo l'esposizione al riscaldamento.

Figura 4: da cova di successo in un archivio sedimentario campionato dal lago anello. La percentuale di successo hatchlings lungo l'archivio sedimentario del lago anello utilizzato negli studi chiavi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Esperimenti di giardino comuni
   1. Trasferimento dieci hatchlings per popolazione (sub) da colture di riserva a condizioni giardino comuni: 16 ° C; fotoperiodo lungo (regime di luce: scuro 16:8); nutrono ogni giorno con 0,8 mg C/L di clorella vulgarise rinnovare medio ogni secondo giorno. Mantenere le covate in condizioni comuni giardino per almeno due generazioni (ca. 45 giorni). Condizioni giardino comuni riducono l'interferenza dall'effetto materno e sincronizzare la riproduzione tra hatchlings.
   2. Al momento del rilascio della seconda nidiata nella camera di covata, trasferire le femmine adulte dalla seconda generazione 500ml vasi pieni di medie in fino a quando non rilasciano la seconda nidiata del novellame.
   3. Trasferire in modo casuale i singoli giovani di 24 – 48 h, Nato dalla seconda nidiata di seconda generazione, per 100 mL barattoli pieni di medie ed esposti alle seguenti condizioni sperimentali: 18 ° C (temperatura attuale nel lago) e 24 ° C (il riscaldamento, la temperatura previsto dal IPCC ²⁶ per i prossimi 100 anni), regime di luce: scuro 16:8 e alimentazione quotidiano 0,8 mg C/L del Chlorellavulgaris.
   4. Su ogni animale sperimentale, misurare le dimensioni a maturità con uno stereomicroscopio come la distanza tra la testa e la base della colonna vertebrale di coda (Figura 5). Fotografare ogni animale e successivamente analizzare le dimensioni utilizzando un software di immagine adatta.
   5. Misurare l'età alla maturità: il giorno in cui le uova sono osservate per la prima volta nella camera di covata.
   6. Misurare la mortalità: il numero di individui estinti durante l'esperimento.
   7. Misurare la fecondità: il numero totale della prole rilasciato in prima e in secondo luogo clonale di riproduzione.
   8. Misurare il tasso di crescita della popolazione, stimato utilizzando l'equazione di Eulero (1):
      (1)
      Dove l_x è la percentuale di sopravvivenza alle età x, b_x è il numero di neonati prodotti per ogni individuo sopravvivente all'età x, e r è il tasso intrinseco di aumento naturale.
   9. Effettuare analisi statistiche, utilizzando il software disponibile in commercio. Qui, è possibile utilizzare R³¹ per tracciare le norme di reazione (espressione fenotipica di un singolo genotipo attraverso ambienti) per ogni tratto di storia di vita, utilizzando il pacchetto ggplot2. Calcolare i tassi di mortalità per la popolazione attraverso l'analisi di sopravvivenza (R pacchetto rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Infine, eseguire un'analisi della varianza (ANOVA, tabella 2) in R³¹ per valutare se l'effetto della temperatura sulle caratteristiche può essere spiegato da evoluzione (differenze tra popolazioni), plasticità (risposta al trattamento), o l'evoluzione di plasticità (popolazione x trattamento).
2. Esperimento di concorrenza
   1. Trasferimento dieci hatchlings per popolazione da colture di riserva a condizioni giardino comuni: 20 ° C, lunga fotoperiodo (regime di luce: scuro 16:8), nutrire quotidianamente con 0,8 mg C/L di clorella vulgaris e rinnovare medio ogni secondo giorno. Mantenere condizioni di giardino comune per almeno due generazioni (ca. 45 giorni) per ridurre le interferenze da effetti materni.
   2. Assegnare casualmente i cinque giovani di 24-48 h dalla seconda nidiata di seconda generazione di ogni cucciolo a mesocosmi sperimentali (20 L plastica degli acquari pieni di medie), in triplici copie, con una densità di 10 animali/L.
   3. Esporre il mesocosmi a 24 ° C, regime di L:D 16:8 e nutrono ogni giorno con 0,8 mg C/L di Chlorellavulgaris in una camera a temperatura controllata o in un incubatore per un minimo di quattro settimane (> 3 generazioni clonale).
   4. Abbattere ogni mesocosmo settimanale, rinfrescante 10% del mezzo per simulare una dinamica di popolazione che Daphnia possono incontrare nell'ambiente naturale. Imporre l'abbattimento rimuovendo un volume noto di medium e animali da ogni acquario (1,2 L in questo caso) e sostituendo il volume abbattuto con medium fresco. Avviare il regime di abbattimento dopo gli animali raggiungono la maturità (giorno 10).
   5. Alla fine della quarta settimana, campione 32 animali da ogni mesocosmo per valutare i cambiamenti nella composizione genotipica rispetto l'inoculo iniziale.
      1. Inserire singoli Daphnia in microcentrifuga e rimuovere il liquido in eccesso con l'aiuto di una pipetta Pasteur.
      2. Flash congelare tubi singoli in azoto liquido e conservare a-80 ° C.
      3. Estrarre il DNA genomico da singoli individui utilizzando protocolli disponibili e seguendo le istruzioni del produttore.
      4. Amplificare il DNA estratto utilizzando un numero di marcatori genetici sufficienti a fornire un unico genotipo multilocus al cucciolo. Qui, 8 microsatelliti disposti in un singolo multiplex (M01, tabella 1) sono stati utilizzati seguendo i protocolli stabiliti^32,33.
      5. Genotipo amplificato frammenti su un analizzatore di frammento.
      6. Condurre l'analisi del frammento con un software commerciale o liberamente disponibile utilizzando uno standard di dimensioni adeguate.
      7. Valutare la composizione genotipica alla fine dell'esperimento da parte di individui di genotipizzazione del 32 con un insieme di luoghi del microsatellite come descritto³³e calcolando la frequenza di ciascun genotipo alla fine dell'esperimento rispetto l'inoculo iniziale.

Figura 5: femmina adulta Daphnia magna. Adulto femmina Daphnia magna con uova partenogenetiche nella camera di covata. La distanza tra la testa e la base della spina dorsale della coda viene utilizzata per misurare le dimensioni dell'animale. Le linee rosse indicano le misure di dimensione. Barra della scala = 500 µm.

Risultati

Dati empirici a lungo termine sono fondamentali per la comprensione delle dinamiche evolutive e persistenza delle popolazioni naturali. Tali dati sono generalmente difficili da ottenere a causa di difficoltà logistiche associate all'accesso ai campioni temporali e l'obbligo di impegnarsi a lungo termine alla raccolta dei dati. In due studi chiavi presentati qui, evidenza empirica della risposta alla temperatura di un zooplankter centrale negli ecosistemi d'acqua dolce è fornito sopra evolutivi volte. Questo è abilitato per l'utilizzo delle banche a strati uovo dormienti che forniscono l'opportunità di studiare la risposta di popolazioni storiche ed i loro discendenti moderni allo stress ambientale in impostazioni sperimentali comuni.

Esperimento di giardino comune
L'esperimento di giardino comune ha mostrato che tutti i tratti di storia di vita, ha risposto a temperatura (Figura 6 e Figura 7). L'analisi ANOVA ha rivelato che tutte le (sotto) popolazioni reagiscono alla temperatura tramite plasticità (tabella 2), ad eccezione di mortalità, che è insensibile. Prova dei cambiamenti evolutivi (differenze tra (sotto) popolazioni) è stata osservata solo nel tasso di crescita della popolazione (tabella 2), che ha significativamente aumentato in due dei tre (sotto) popolazioni a 24 ° C (Figura 6).

Figura 6: esperimento di giardino comune. Norme di reazione per tratti di storia di vita (fecondità, dimensioni ed età alla scadenza) e tasso di crescita (r) sono indicate per ogni popolazione (sub) sotto la temperatura di riscaldamento (24 ° C) rispetto al giardino comune e l'attuale regime di temperatura (18 ° C). Il tasso di crescita della popolazione 'r' viene calcolato utilizzando l'equazione di Eulero (1). Sono indicati gli intervalli di confidenza. (Sotto) popolazioni sono codificati a colori: (i) blu: 1960-1970; (ii) verde: 1970-1985; (iii) rosso: > 1999. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: mortalità. I tassi di mortalità per popolazione (sub) (1960-1970; 1970-1985; > 1999) sono mostrati sotto riscaldamento (24 ° C) rispetto ai regimi di temperatura moderna (18 ° C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esperimento di mesocosmo
Dopo quattro settimane di selezione, rappresentata dal riscaldamento a 24 ° C, la frequenza dei tre (sotto) popolazioni non sono cambiato significativamente (χ² = 0,55, P = 0.76) rispetto l'inoculo iniziale (Figura 8). Tra i 30 genotipi inoculati nell'esperimento mesocosmi, la maggior parte è stata identificata dopo quattro settimane di selezione (Figura 9). In particolare, il 70% dei genotipi inoculati sono stati recuperati, compatibile con aspettativa Poissoniano di recuperare almeno un rappresentante di ciascun genotipo in un campione di 32 individui.

Figura 8: esperimento di concorrenza - frequenza popolazione. Una media di popolazione mediana e quartili (25^th e 75^th), è indicato per i tre (sotto) popolazioni di d. magna dopo quattro settimane di selezione in esperimenti di competizione mesocosmi (24 ° C), rispetto ad una frequenza uguale iniziale (a l'inizio). (Sotto) popolazioni sono colore codificato come mostrato nella Figura 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: esperimento di concorrenza - frequenza del genotipo. Frequenze del genotipo — media mediana e quartili (25^th e 75^th), vengono mostrati dopo quattro settimane di esposizione al riscaldamento (24 ° C) rispetto ad un iniziale uguale frequenza dei genotipi (linea tratteggiata). I nomi sull'asse x sono l'ID di genotipi inoculati, raggruppato per popolazione (sub) (blu, 1960-1970; verde, 1970-1985; rosso, > 1999). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Locus	UN	Intervallo di grandezza (bp)	Primer (5' - 3')		Etichetta di tintura	Ripetere il motivo	TM
B008	HQ234154	150 – 170	F: TGGGATCACAACGTTACACAA		VIC	(TC) 9	56
			R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030	HQ234160	154 – 172	F: CCAGCACACAAAGACGAA		ANIMALE DOMESTICO	(GA) 11	56
			R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045	HQ234168	118 – 126	F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC		NED	(TG) 8	56
			R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050	HQ234170	234 – 248	F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC		6FAM	(GAA) 6	56
			R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064	HQ234172	135-151	F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA		6FAM	(TC) 8	56
			R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074	HQ234174	196 – 204	F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT		NED	(GT) 9	56
			R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096	HQ234181	234-240	F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA		VIC	(AC) 15	56
			R: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107	HQ234184	250 – 274	F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA		ANIMALE DOMESTICO	(CT) 8	56
			R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

Tabella 1: multisala del Microsatellite. La NCBI adesione numero (AN), le informazioni multisala, le sequenze dell'iniettore PCR, l'intervallo di grandezza PCR, il motivo di ripetizione, il colorante usato per etichetta che il primer in avanti e la temperatura di annealing (Tm) sono mostrati.

Tasso di crescita pop (r)		DF	F	P
Evoluzione (Pop)		2	30.309	< 0,001
Plasticità (Temp)		1	531.546	< 0,001
Evol. Plasticità (Pop x Temp)		2	65.137	< 0,001
Mortalità		DF	F	P
Evoluzione (Pop)		2	2,234	0,1162
Plasticità (Temp)		1	2.679	0.1071
Evol. Plasticità (Pop x Temp)		2	1.8657	0,164
Fecondità		DF	F	P
Evoluzione (Pop)		2	1.8852	0.1633
Plasticità (Temp)		1	6.8934	0.0117
Evol. Plasticità (Pop x Temp)		2	1,6511	0.203
Dimensioni a maturità		DF	F	P
Evoluzione (Pop)		2	0,211	0.8106
Plasticità (Temp)		1	11.1361	0.0017
Evol. Plasticità (Pop x Temp)		2	0.6586	0.5225
Età alla scadenza		DF	F	P
Evoluzione (Pop)		2	0.7811	0.4637
Plasticità (Temp)		1	8.0764	0.0066
Evol. Plasticità (Pop x Temp)		2	0,088	0.9159

Tabella 2: analisi della varianza (ANOVA). Analisi della varianza, verificare se le modifiche nei tratti di storia di vita e tasso di crescita delle popolazioni risorto (sub) esposti al riscaldamento sono spiegate da adattamento evolutivo (popolazioni), plasticità (temperatura di trattamento) e loro termine di interazione (evoluzione di plasticità). Significativa p-valori (p< 0,05) vengono visualizzati in grassetto.

Supplementare Video 1: campionamento di carote di sedimento. L'uso di un carotiere di Big Ben è indicato. Big Ben è un tubo di centro di circa 1,5 m di lunghezza con un diametro del tubo interno di 14 cm. Si compone di un pistone su una corda e una testa di carotiere, a cui sono attaccati canne per guidare il tubo nel sedimento. Un catcher di nucleo viene utilizzato per supportare il tubo carotiere che viene distribuito da una piccola nave. Il pistone è spinto verso il basso nel sedimento di pressione gravitazionale. Un quadro viene utilizzato per supportare il tubo carotiere durante il processo di estrusione effettuato utilizzando una presa della bottiglia modificate che spinge il pistone verso l'alto. Ogni strato del sedimento è raccolto su una superficie metallica piana e trasferito in sacchetti di campionamento trasparente per immagazzinaggio a lungo termine [buio e freddo (4 ° C) condizioni]. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Video 2: sedimento setacciatura. Le attrezzature necessarie per la setacciatura di sedimento sono una scala di precisione, vassoi di campionamento bianco e setacci geologici. Da ogni strato del sedimento, almeno 5 g vengono mantenute per la datazione radiometrica. Il resto del sedimento è utilizzato per isolare efippi. Il sedimento è setacciato attraverso due setacci geologiche, una con 1 mm e una seconda con dimensioni di maglia 125 µm, accatastati uno sopra l'altro. Medio viene versato sul setaccio maglia 1mm per separare l'argilla, grandi invertebrati e particolato. D. magna efippi e particolato piccolo separa medio versato sul secondo setaccio con maglie di 125 µm. Le aliquote di sedimenti vengono poi trasferite a un vassoio di campionamento bianco. D. magna efippi sono macchiati dall'occhio nel vassoio di sfondo bianco. Efippi da ogni strato sono raccolti in piatti separati di Petri. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare dei Video 3: Decapsulation. Sotto un microscopio stereoscopico, d. magna efippi vengono aperti con il forcipe di microdissection applicando pressione sul dorso del caso chitina. La membrana interna dell'uovo viene delicatamente rimosso e uova durature delicatamente trasferiti con una pipetta Pasteur in una piastra Petri contenente 10 mL di terreno. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare dei Video 4: cova. Dopo l'esposizione a un fotoperiodo lungo e 20 ° C, lo sviluppo dell'embrione si riprende tra 48h e poche settimane. Quando lo sviluppo è completo, gli embrioni rompono il guscio d'uovo e nuotare liberamente nel mezzo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Dovuto l'alta conducibilità termica dell'acqua, ecosistemi d'acqua dolce sono a più alto rischio di perdita di biodiversità di ecosistemi terrestri a fronte di global warming³⁴. È, pertanto, fondamentale per capire la risposta della specie trapezoidale in questi ecosistemi e identificare meccanismi di adattamento per sopravvivere lo stress termico. La comprensione di questi meccanismi a livello di specie e Comunità può aiutare a predire come specie sono influenzati dal riscaldamento globale e come l'effetto sulle singole specie a cascata ad altri livelli trofici. In ultima analisi, comprensione dei meccanismi di risposte al riscaldamento globale consente l'identificazione delle strategie di bonifica per mitigare le estinzioni.

Gli studi di caso presentati qui mostrano che la risposta di d. magna per aumento della temperatura è pervasively mediata dalla plasticità nei tratti di storia di vita e che risposta all'aumento di temperatura da solo non imponga costi fitness chiaro, almeno per il popolazione studiata qui. Elevata plasticità nei tratti di storia di vita è supportato da non significative differenze nelle capacità concorrenti delle popolazioni (sub) in presenza di riscaldamento. Tuttavia, esperimenti di competizione a più lungo termine su popolazioni multiple potrebbero essere necessari di generalizzare questi risultati.

Risurrezione di dormienti fasi fornisce una risorsa senza precedenti per studiare i meccanismi di adattamento e le traiettorie dell'evoluzione di una specie attraverso tempo¹⁰. Specie di zooplancton beneficiano di un tempo di generazione rapida (circa 2 settimane) e la redditività delle fasi dormienti, che permette un antenato di competere headtohead contro propri discendenti, o a 'replay' evoluzione che inizia da vari stati passati. Ecologia di resurrezione essenzialmente consente l'indagine se un particolare risultato evolutivo è contingente su un certo evento precedente. L'identificazione degli elementi genetici dell'evoluzione è attualmente possibile negli esperimenti del laboratorio utilizzando microrganismi per i quali 'linee ancestrali' sono congelate e rianimate per analisi comparata con i loro discendenti evoluti⁶. Tuttavia, uno dei principali limiti di lavorare con organismi di laboratorio è che lo 'stato ancestrale' è una previsione già spostata. Lo studio delle fasi dormienti permette il campionamento degli esemplari da tempo anticipando qualsiasi evento di stress (ad es., ottime condizioni ambientali) e per misurare le traiettorie evolutive da condizioni ambientali indisturbate a vari stati passati fino ai tempi moderni. Negli ultimi anni, lo studio del polimorfismo del DNA nelle fasi di zooplancton risorto o ancora dormiente ha fornito le comprensioni importanti in passato processi demografici e adattivi che hanno contribuito per il corredo genetico di odierna popolazione^{14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36}. con la maggiore accessibilità di tecnologie di sequenziamento ad alta resa, può essere sequenziati genoma e del trascrittoma di fasi risorti o ancora dormiente e il tipo e il numero di cambiamenti genetici accumulato in continua evoluzione di popolazioni sopra tempo misurato.

La risurrezione SOP presentato qui ha importanti applicazioni nel campo della multi-omics su due livelli. Multi-omics tecnologie possono essere applicate agli esemplari risorti, permettendo un'analisi esaustiva degli elementi molecolari coinvolti nelle risposte adattative a pressione di selezione ambientale. Inoltre, omics tecnologie possono essere applicate a decapsulato ma fasi ancora dormienti. Finora, l'applicazione di tecnologie di sequenziamento ad alta resa a fasi di riposo è stato limitato dal requisito di una grande quantità di materiale in ingresso. Queste limitazioni sono essere sollevato³⁷. Con i requisiti di abbassamento per materiale in ingresso e progresso in nanofluidica, sequenziamento dell'intero genoma (WGS) è ora possibile da appena 1 ng o pochi pg di avviamento del materiale³⁸. L'uso dell'intero genoma amplificazione (WGA) e tecniche di amplificazione (WTA) intero trascrittoma, permettendo l'arricchimento di DNA e RNA da piccole quantità di tessuto, ha rivoluzionato sia metagenomica^39,40 e medical ricerca⁴¹. Queste tecnologie applicate al dormiente decapsulate consentono il superamento delle limitazioni associate attuabilità delle fasi dormienti e le indagini di lunghi periodi di tempo (ad es., secoli).

La risurrezione di invertebrati marini comunità producono riposo fasi consente l'allineamento dei dati storici di comunità con i noti cambiamenti nei paesaggi naturali, o con i cambiamenti ambientali dedotti dall'analisi dei sedimenti orsoils². L'analisi dei cambiamenti di comunità in risposta ad un cambiamento ambientale ci fornisce con la capacità di quantificare eco-evolutivo feedback⁴² che avere notevoli conseguenze sulla popolazione persistenza⁴³, interazioni trofiche⁴⁴ , comunità Assemblea⁴⁵ed i cambiamenti nelle funzioni e servizi di ecosistema⁴⁶. Infine, previsioni accurate sui risposte biologiche al cambiamento ambientale sono di fondamentale importanza per guidare la tutela della biodiversità⁴⁷. Attuali modelli predittivi sono imprecisi al riguardo perché non tengono in meccanismi biologici importanti conto come la demografia, dispersione, evoluzione e le interazioni di specie. Capire come questi processi cambiano nel tempo e utilizzando queste informazioni come un priore in Modellistica previsionale migliorerà la nostra capacità di prevedere specie e persistenza di comunità a fronte dell'ambiente cambiare².

L'applicazione di SOP qui presentato non è senza sfide. Il limite principale di resuscitare dormienti fasi è la necessità di attrezzature specializzate per il campionamento. Inoltre, l'intero processo, dal sedimento setacciatura allo stabilimento delle culture clonale, richiede parecchio tempo hands-on.

Alcuni dei passaggi SOP qui presentati sono facilmente trasferibili ad altre specie di Daphnia . Queste sono: campionamento, istituzione di linee clonali e disegno sperimentale. Tuttavia, altri passi il SOP possono richiedere ulteriore ottimizzazione su misura per le specie oggetto di studio. Decapsulamento è spesso applicato ai campioni di d. magna per migliorare il successo di schiusa. Tuttavia, questo approccio potrebbe non essere adatto per gli esemplari più piccoli. Da cova stimoli possa variare anche tra specie⁴⁸ e tra conspecifici esemplare⁴⁹. Quindi, un'ottimizzazione ad hoc delle tappe da cova il SOP può essere richiesta prima di applicazioni di altri crostacei. Mentre il successo di schiusa della popolazione d. magna resuscitato dal lago anello (30,5% attraverso l'archivio sedimentaria) è in linea con precedenti risultati⁴⁹, successo di schiusa varia con lo stato di conservazione dei sedimenti, la specie ^50,51e l'origine geografica del sedimento⁴⁸. Futuri studi sui meccanismi che regolano l'entrata e la progressione attraverso le fasi della diapausa è richiesta per identificare gli stimoli di schiusa ottimale su misura per le diverse specie.

Infine, sfondo conoscenza del sistema di studio, in particolare la presenza delle specie di interesse nel corso del tempo, è consigliabile. Ciò sarà possibile tramite annotazioni storiche. Se non sono disponibili record storici, di campionamento e di screening degli strati superficiali del sedimento lago prima del campionamento di nucleo è consigliabile, anche se può fornire informazioni solo sulla storia più recente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
sampling bags	Fisher Scientific	11542783	Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer	ENSIS ltd	na	Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale	Veritas-M124A	TLP-50	Analytical Balance
geological sieve	UKGE limited	SV7521	200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve	UKGE limited	SV7525	200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray	nhbs	http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509	Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette	Globe Scientific inc.	138020B	Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope	nikon	smz800	Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish	EduLab	153-533	Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars	compak	Round Jam Jars 4oz	100 mL jars
glass jars	compak	Atum Jars/ Bonta Jar 10oz	200 mL jars
glass jars	bottlecompanysouth	500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid	500 mL jars
statistical software R	https://cran.r-project.org/	na	Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps	Fisher Scientific	41122405	Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	na	Open source ImageJ image processing toolkit  written in Java
mesocosm	amazon	na	Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes	Sigma_Aldrick - Merck	Z606340	premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance	Beckman Coulter	A48705	DNA extraction kit
size standard	Thermo Fisher Scientific	4322682	LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer	ABI	na	Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing