Ressurreição de dormentes Daphnia magna: protocolo e aplicações

Resumo

Estudos de longo prazo são essenciais para a compreensão do processo de evolução e os mecanismos de adaptação. Em geral, estes estudos requerem compromissos para além do tempo de vida dos pesquisadores. Aqui, um poderoso método é descrito que avança dramaticamente a coleta de dados do estado-da-arte para gerar dados longitudinais em sistemas naturais.

Resumo

Estudos de longo prazo permitem a identificação de processos eco-evolutivos que ocorrem durante períodos de tempo prolongado. Além disso, eles fornecem a chaves dados empíricos que podem ser utilizados em modelagem preditiva para previsão de respostas evolutivas dos ecossistemas naturais para futuras mudanças ambientais. No entanto, excluindo alguns casos excepcionais, estudos de longo prazo são escassos devido a dificuldades logísticas associadas acessando amostras temporais. Dinâmica temporal frequentemente é estudada no laboratório ou em experimentos controlados do mesocosmo com estudos excepcionais que reconstruir a evolução de populações naturais em estado selvagem.

Aqui, um procedimento operacional padrão (SOP) é fornecido para reviver ou ressuscitar dormente Daphnia magna, uma espécie de pedra angular do zooplâncton generalizada nos ecossistemas aquáticos, para avançar dramaticamente a coleta de dados longitudinais de estado-da-arte em sistemas naturais. O campo da ecologia da ressurreição foi definido em 1999 por Kerfoot e colegas de trabalho, mesmo que a primeira tentativa de incubação diapausing zooplâncton ovos datam do final dos anos 1980. Desde papel seminal do Kerfoot, a metodologia de ressuscitar espécies de zooplâncton foi cada vez mais frequentemente aplicada, embora propagado entre laboratórios somente via transferência de conhecimento directo. Aqui, um SOP é descrito que fornece um protocolo passo a passo sobre a prática de ressuscitar dormente Daphnia magna ovos.

Dois principais estudos são fornecidos em que a resposta de aptidão do Ressuscitado populações de Daphnia magna para aquecimento é medido, capitalizando sobre a capacidade de estudar populações históricas e modernas nas configurações do mesmas. Finalmente, a aplicação de tecnologias de sequenciamento de próxima geração para estágios revividas ou ainda dormentes é discutida. Estas tecnologias fornecem um poder sem precedentes em dissecando os processos e mecanismos da evolução se aplicado a populações que sofreram mudanças na pressão de seleção ao longo do tempo.

Introdução

Estudos de longo prazo são essenciais para a compreensão de processos ecológicos e evolutivos na natureza e na avaliação como espécie responde e persiste durante mudanças ambientais¹. Isso ocorre porque processos eco-evolutivos acontecem em todas as gerações e ocorrem mudanças no ambiente por longo tempo vãos. Além disso, estudos de longo prazo fornecem chaves dados empíricos que melhoram a precisão de modelagem de previsão, a previsão de respostas evolutivas dos ecossistemas naturais para mudanças ambientais². A precisão desses modelos é fundamental para implementar estratégias de manejo e conservação para preservar a biodiversidade e o ecossistema de serviços.

Excluindo alguns casos excepcionais (por exemplo, os tentilhões de Galápagos Darwin³ e algas⁴), estudos de longo prazo são em grande parte limitados a espécie com o tempo de geração curto que pode ser propagado no laboratório^{5,6 , 7 , 8}. portanto, os processos que sustentam a dinâmica evolutiva permanecem indescritíveis. Devido a dificuldades logísticas associadas acessando temporais amostras, dados empíricos são estudados com mais frequência em um espaço do que em um contexto temporal e processos eco-evolução temporais são inferidos ou modelados de dados espaciais. Essa abordagem é conhecida como 'espaço-para-tempo' substituição⁹, pelo qual o espaço é adotado como um substituto para estudar a dinâmica de evolução temporal. A principal limitação da substituição da 'espaço-para-tempo' é que taxas de adaptação em diferentes escalas espaciais diferem de variação temporal da mesma população; daí, inferências baseadas na substituição de tempo com espaço são tendenciosas¹⁰.

Uma poderosa alternativa que permite estudar a dinâmica evolutiva em ecossistemas naturais ao longo do tempo é a análise das alterações ecológicas e genéticas em espécies produzindo estágios dormentes¹¹. Estes estágios dormentes se acumulam de forma estratificada arquivos biológico que podem ser datados com precisão e paleolimnologically caracterizada^12,13. Importante, esses estágios dormentes podem ser ressuscitados e usados em experimentos de laboratório, onde sua resposta evolucionária à mudança ambiental pode ser medida diretamente. Populações históricas podem ser competiu contra seus descendentes modernos evoluiu para estudar as alterações de aptidão e a função dos genes, evoluindo em sintonia com a mudança ambiental^14,15,16.

Dormentes estágios incluem sementes, cistos, esporos e bancos de ovo. Embora os primeiros estudos sobre ovos dormentes ressuscitada datam do final da década de 1980¹⁷e um punhado de estudos aplicaram esta técnica no início da década de 1990^18,19, campo da ecologia da ressurreição foi formalmente estabelecido pelo livro seminal Kerfoot e colaboradores em 1999,²⁰. Esta prática tem sido aplicada principalmente em reconstruções de paleolimnological de espécies de água doce^17,21,22. No entanto, um SOP ainda não está disponível. Aqui, uma descrição passo a passo do protocolo ressurreição aplicado a ovos dormentes as espécies de zooplâncton Daphnia magna é fornecida, a partir da amostragem de sedimentos para o estabelecimento de culturas clonais de filhotes. Etapas do SOP que são facilmente transferíveis para outras espécies de Daphnia, bem como as etapas que podem exigir a otimização adicional, são discutidas.

As dáfnias são zooplankters de água doce presentes na maioria dos habitats lóticos²³ . Espécies Daphnia são também obrigatórios parthenogens assexuadas ou cíclicas. D. magna é um parthenogen cíclico que reproduz uma relação clonal sob condições ambientais favoráveis²⁴. Quando as condições ambientais se deterioram, ocorre produção masculina e recombinação sexual conduz à formação de ovos fertilizados que entrar em um estado de dormência, protegido contra o meio ambiente por um caso de quitina chamado ephippium. Uma parte desses ovos dormentes eclodem quando retornam de condições ambientais favoráveis. No entanto, uma grande proporção do banco ovo latente nunca tem uma chance para chocar e, portanto, construir arquivos biológicos ao longo do tempo. Estágios dormentes permanecem enterrados no sedimento de lagos e lagoas e podem ser ressuscitados para o estudo da dinâmica evolutiva durante períodos de tempo prolongado. Porque ovos dormentes de d. magna são o resultado de recombinação sexual, eles são uma boa representação da natural diversidade genética das espécies²⁵. Além disso, eles podem ser mantidos através de reprodução clonal em laboratório. Estas características fornecem a vantagem exclusiva de organismos-modelo isogénicas, mantendo a diversidade genética natural.

Dois principais estudos são apresentados para demonstrar as vantagens de comparar diretamente descendentes históricos e modernos da mesma população de d. magna enfrentando a pressão de seleção ambiental ao longo do tempo. D. magna espécimes foram ressuscitados do Lago anel (Dinamarca), um raso (5 m de profundidade; superfície 22 ha) lagoa mista que tem experimentado um aumento na ocorrência de ondas de calor e a temperatura média ao longo do tempo. D. magna (sub) populações foram ressuscitadas ao longo deste gradiente temporal abrangendo 60 anos (1960-2005) e estudou para investigar a resposta evolutiva para o aquecimento da temperatura. No primeiro estudo de uma experiência comum de jardim, mudanças nas características de aptidão-ligada a história de vida foram medidas em resposta ao aumento de temperatura de + 6 ° C, em conformidade com as previsões do Painel Intergovernamental para mudança climática nos próximos 100 anos ²⁶. no segundo estudo, uma experiência do mesocosmo foi usada para medir a capacidade competitiva dos três (sub) populações sob aquecimento. Estas experiências combinadas mostram que na presença de aquecimento como o único estresse, todos os traços da história de vida e as populações mostram um elevado nível de plasticidade em têm habilidades competitivas iguais. Estes achados sugerem que o aquecimento como um esforço único não impõe custos significativos de aptidão, pelo menos na população estudada aqui.

Protocolo

O SOP a seguir fornece uma descrição passo a passo do protocolo usado para ressuscitar a Daphnia magna ovos dormentes, incluindo uma descrição detalhada da amostragem, isolamento de ephippia do sedimento e estabelecimento de culturas clonais ( Figura 1).

Figura 1: guia passo a passo, a ressurreição de Daphnia magna. Sedimento de um habitat natural de água doce (A) é amostrado com um corer do pistão (B). O núcleo de sedimentos (C) é cortado em camadas incrementais de 1 ou 0,5 cm (D). Cada camada de sedimento é armazenada em um saco de fechamento do fecho de correr de amostra (E) em condições de escuras e frias (4 ° C). Cada camada de sedimento é pesada e peneirada usando peneiras geológicas (1 mm e 125 µm malhagens, F). Bandejas de fundo branco são usadas para isolar ephippia Daphnia magna (G). Decapsulated ovos dormentes (H) são transferidos para placas de Petri e expostos a estímulos de luz e temperatura para induzir a eclosão. Os filhotes são transferidos para separar os frascos (eu) para estabelecer linhas de isoclonal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. amostras de sedimento núcleos

1. Sedimentos de amostra de lagos ou lagoas usando um corer do pistão. Este protocolo utilizado Big Ben²⁷, um tubo de núcleo de aproximadamente 1,5 m de comprimento com um diâmetro de tubo interno de 14 cm. Big Ben consiste de um pistão em uma corda e uma cabeça de batata, para que as hastes são anexadas para conduzir o tubo no sedimento. Um apanhador de núcleo auxilia o apoio do tubo núcleo quando cheio de sedimentos. Para expulsar o sedimento, um quadro mantém o tubo de núcleo na posição vertical e estacionária, e jack um frasco modificado é usado para empurrar o pistão para cima durante o processo de extrusão (complementar vídeo 1).
   1. Para lagoas rasas de menos de 1 m de profundidade, use uma sonda de gravidade de plexiglass de não mais de 6 cm de diâmetro manualmente empurrado para o sedimento.
   2. Para lagos profundos (> 6 m de profundidade), use Livingston pistão descaroçadores²⁸ ou descaroçadores de sedimentos de Griffith single-drive com as aids de um barco ancorado do pontão. A sonda de pistão Livingstone-tipo haste de movimentação pode ser usada em água até cerca de 30 m profundo para coletar unidades sucessivas de um metro de soft de sedimentos do Lago consolidada. A sonda de Griffith única unidade consiste de uma cabeça de núcleo simples, porém robusta que conecta os tubos em policarbonato padrão para hastes de unidade de Livingstone. Os descaroçadores são empurrados para o sedimento com as barras, e um pistão fornece a sucção necessária para a recuperação de sedimentos (Figura 2).
   3. Para a recuperação contínua, núcleos imperturbáveis, use vibracoring. Estes descaroçadores trabalham em uma variedade de profundidades de água e podem recuperar amostras de comprimentos diferentes, dependendo da litologia de sedimentos. Vibração de baixa amplitude que é transferida de vibracore cabeça para baixo através do cano anexado ou tubo de núcleo liquefaz sedimentos, permitindo que o núcleo barril anexado à unidade vibracore para penetrar os sedimentos liquefeitos. Alguns vibracorers são pequenas, leves e portáteis, outros são grandes unidades pesadas que só podem ser implantadas de grandes vasos. A escolha dos descaroçadores depende a litologia de sedimentos.
2. Corte o núcleo horizontalmente em camadas incrementais de 1 cm ou menos usando uma superfície metálica plana (complementar vídeo 1). Descaroçadores de sedimento, como o usado aqui são projetados para reduzir a pressão hidrostática em extrusão, reduzindo a perturbação das camadas de sedimentos. Quando são utilizados outros descaroçadores, a casca exterior de cada camada de sedimentos pode ser removida com um tipo de bolinho-cortador de lâmina para limitar a contaminação entre camadas.
3. Coletar cada camada de sedimentos em um saco de recolha separada (complementar Video 1) e armazenar no escuro e frio (4 ° C) condições.
4. Recolha um mínimo de 5 g de sedimentos de todas as camadas para a datação radiométrica. Como datação radiométrica é um protocolo estabelecido para uma descrição detalhada do ensaio namoro, consulte existentes publicações^12,13.

Figura 2: desenho do pistão dielétrico procedimento. Sonda de pistão, um tubo oco com um selo de deslizamento interno (o pistão) que produz um vácuo fraco. Quando o pistão toca a interface sedimento-água, o peso empurra o cano do núcleo para o sedimento e o vácuo faz com que o sedimento sendo tubular para entrar e subir o tubo sem perturbar as camadas de sedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. peneirar de camadas de sedimento

1. Usando uma balança de precisão, pese cada camada de sedimento para referência futura. Use a área de superfície e peso para calcular a densidade de espécies no lago.
2. Peneira de cada camada de sedimentos usando duas peneiras geológicas empilhadas uns sobre os outros. A primeira peneira tem um tamanho de malha de 1 mm e argila, grandes invertebrados e partículas em suspensão, por exemplo, sementes, plantas e insetos, separa o restante dos sedimentos. A segunda peneira tem uma malha de 125 µm e separa o restante dos sedimentos (vídeo complementar 2) mangá d. ephippia e pequenas partículas.
3. Transferi pequenas alíquotas da fração de sedimentos coletados para a peneira de malha de 125 µm para uma bandeja de fundo branco. Dependendo do tipo de sedimento, alíquotas menores ou maiores de sedimentos podem ser transferidas a cada momento.
   1. Adicionar volumes pequenos (até 200 mL) de meio para a bandeja de amostragem branco para re-suspender a fração de sedimentos transferidos e facilitar o olho mancha do ephippia (Figura 3). O meio utilizado para Ressuspender o sedimento pode ser água de torneira sem cloro, água de poço, COMBO²⁹ou ADaM médio (Aachener Daphnien)³⁰. Daqui por diante, o termo 'médio' será usado para se referir a uma ou todas as soluções listadas.

Figura 3: Daphnia magna ephippium. Ovos dormentes Daphnia magna imediatamente após o desencapsulamento. A ephippium (A), a membrana interior do ovo (B) e os ovos dormentes (C) são mostrados. Barra de escala = 500 µm.

3. o desencapsulamento de Ephippia e incubação

1. Com uma pipeta Pasteur descartável ou usando microdissection fórceps, ephippia individuais de transferência para placas de Petri cheia de 10 mL de meio. Use pelo menos um prato de Petri por camada de sedimentos.
2. Sob um microscópio estéreo, decapsulate cada ephippia usando fórceps microdissection forçando abrir o caso de quitina (3 de vídeo suplementar). Remover a membrana interna do ovo descanso delicadamente, prestando atenção para não perturbar os ovos e transferi-los para a placa de Petri preenchida com médio usando uma pipeta Pasteur. Desencapsulamento aumenta o sucesso da incubação em d. magna; no entanto, não pode ser exigido ou pode ser desafiador para outras espécies Daphnia produzindo ephippia menor.
3. Expor os ovos congelada para uma luz de fotoperíodo longo dia todo o espectro (16:8 luz: escuro) e alta temperatura (20 ± 1 ° C) para induzir a eclosão de um quarto ou um dispositivo de temperatura controlada (incubadora). Para incubação ocorre entre 48 h e várias semanas (até quatro; Vídeo complementar 4). Na ausência de desencapsulamento, expor diretamente o ephippia de incubação estímulos (longo fotoperíodo luz do dia (16:8 luz: escuro) e alta temperatura (20 ± 1 ° C)).

4. estabelecer linhas de Isoclonal de Daphnia magna

1. Estabelece linhas de isoclonal de filhotes único Transferindo individual d. magna de passo 3.3 para separar os frascos cheios de 200 mL de meio, utilizando uma pipeta de Pasteur descartável. Cada indivíduo é geneticamente distinto, sendo o resultado de recombinação sexual.
2. Manter linhas isoclonal indefinidamente em condições de estoque que consiste de 10 ± 1 ° C, regime de luz: escuro 16:8, alimentado semanalmente com 0,2 mg C/L de Chlorella vulgaris ou outras algas verdes (por exemplo, Scenedesmus obliquus). Renove o meio toda terceira semana. Condições das ações podem muda com a temperatura, alimentação, espécies e regimes.

5. principais estudos

Nota: Uma descrição dos dois principais estudos é fornecida no qual ressuscitado D.magna (sub) populações do arquivo sedimentar do Lago anel (Dinamarca) são usadas para avaliar a resposta evolutiva para o aquecimento. Três populações de (sub) foram ressuscitadas de períodos de tempo a seguir: 1960-1970, 1970-1985, e > 1999. D. magna do arquivo sedimentar variou entre 11 e 58% (Figura 4) o sucesso da incubação. Dos filhotes obtidos de cada timeperiod, um subconjunto aleatório foi escolhido por dois principais estudos descritos aqui. Estes estudos foram projetados para avaliar se as populações (sub) ressuscitadas de períodos de tempo diferentes ao longo do gradiente de temperatura mostraram diferenças nos traços de história de vida ligada a aptidão (5.1), e se eles tinham diferentes habilidades competitivas (5.2) após a exposição ao aquecimento.

Figura 4: o sucesso em um arquivo sedimentar amostrado do Lago anel da incubação. A proporção de filhotes bem sucedidas ao longo do arquivo sedimentar do Lago anel usado nos estudos de chave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Experimentos de jardim comuns
   1. Transferência de dez filhotes por população (sub) de culturas-mãe para condições comuns de jardim: 16 ° C; fotoperíodo longo (regime de luz: escuro 16:8); alimentar-se diariamente com 0,8 mg C/L de Chlorella vulgarise renovar médio cada segundo dia. Manter os filhotes em condições comuns de jardim para pelo menos duas gerações (ca. 45 dias). Condições de jardim comuns reduzem a interferência do efeito materno e sincronizar a reprodução entre os filhotes.
   2. Após a liberação da segunda ninhada na câmara incubadora, transferi fêmeas adultas de segunda geração para frascos 500ml cheios de médio até que eles liberam a segunda ninhada de juvenis.
   3. Aleatoriamente de transferência individuais juvenis de 24 – 48 h, nascido da segunda ninhada da segunda geração, 100ml frascos cheios de médio e expostos às seguintes condições experimentais: 18 ° C (temperatura atual no lago) e 24 ° C (aquecimento, temperatura previsto pelo IPCC ²⁶ para os próximos 100 anos), regime de luz: escuro 16:8 e alimentação diária 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris.
   4. Em cada animal experimental, medir o tamanho na maturidade com um estereomicroscópio como a distância entre a cabeça e a base da coluna vertebral de cauda (Figura 5). Fotografar cada animal e posteriormente analisar seu tamanho usando um software de imagem adequada.
   5. Medir a idade na data de vencimento: o dia em que os ovos são observados pela primeira vez na câmara incubadora.
   6. Medir a taxa de mortalidade: número de indivíduos extintos durante o experimento.
   7. Medir a fecundidade: o número total de descendentes lançados em primeira e segundo clonal de reprodução.
   8. Medir a taxa de crescimento da população, estimada através da equação de Euler (1):
      (1)
      Onde a proporção de sobrevivência na idade x, l_x b_x é o número de neonatos produzido por indivíduo sobrevivente na idade x, e r é a taxa intrínseca de aumento natural.
   9. Realizar análise estatística utilizando o software disponível comercialmente. Aqui, use R³¹ para traçar normas de reação (expressão fenotípica de um genótipo único em ambientes) para cada traço de história de vida, usando o pacote de ggplot2. Calcule as taxas de mortalidade por população através de análise de sobrevivência (R pacote rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Finalmente, realizar uma análise de variância (ANOVA, tabela 2) em R³¹ para avaliar o efeito da temperatura sobre as características pode ser explicado pela evolução (diferenças entre as populações), plasticidade (resposta ao tratamento), ou a evolução da plasticidade (população x tratamento).
2. Experiência de competição
   1. Transferência de dez filhotes por habitantes de culturas-mãe para condições comuns de jardim: 20 ° C, longo fotoperíodo (regime de luz: escuro 16:8), alimentar-se diariamente com 0,8 mg C/L de Chlorella vulgaris e renovar médio cada segundo dia. Manter condições comuns de jardim para pelo menos duas gerações (ca. 45 dias) reduzir a interferência de efeitos maternos.
   2. Aleatòria atribuir cinco juvenis de 24 a 48 h da segunda ninhada de segunda gerações de cada filhote mesocosmos experimentais (20 L plástico aquários cheios de médio), em triplica, com uma densidade de 10 animais/L.
   3. Expor os mesocosmos a 24 ° C, regime de L:D 16:8 e alimentar-se diariamente com 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris em uma câmara de temperatura controlada ou incubadora para um mínimo de quatro semanas (> 3 gerações clonais).
   4. Abate cada do mesocosmo semanalmente, refrescante de 10% do meio para simular uma população dinâmica que Daphnia pode encontrar no ambiente natural. Impor o abate através da remoção de um volume conhecido de médio e de animais de cada aquário (1,2 L neste caso) e substituindo o volume abatido por meio fresco. Inicie o regime de abate após os animais experimentais atingem a maturidade (dia 10).
   5. No final da quarta semana, 32 animais de cada do mesocosmo para avaliar mudanças na composição genotípica em comparação com o inóculo inicial da amostra.
      1. Coloque individuais Daphnia em tubos microcentrifuga e remover o excesso de líquido com a ajuda de uma pipeta Pasteur.
      2. Flash congelar tubos individuais em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C.
      3. Extrai DNA genômico de únicos indivíduos utilizando protocolos disponíveis e seguindo as instruções do fabricante.
      4. Amplifica o DNA extraído usando um número de marcadores genéticos suficientes para fornecer um único genótipo multilocus por filhote. Aqui, 8 microsatélites, arranjados em um único multiplex (M01, tabela 1) foram utilizados seguindo protocolos estabelecidos^32,33.
      5. Genótipo amplificados fragmentos em um analisador de fragmento.
      6. Realizar análise de fragmento com um software comercial ou livremente disponível, usando um padrão de tamanho adequado.
      7. Avalie a composição genotípica ao final do experimento por indivíduos de genotipagem a 32, com um conjunto de microsatellite loci como descrito,³³e calcular a frequência de cada genótipo no final do experimento em comparação com o inóculo inicial.

Figura 5: fêmea adulta Daphnia magna. Adulto feminino Daphnia magna com partenogenéticas ovos na câmara incubadora. A distância entre a cabeça e a base da coluna vertebral de cauda é usada para medir o tamanho do animal. As linhas vermelhas indicam as medições de tamanho. Barra de escala = 500 µm.

Resultados

Dados empíricos a longo prazo são essenciais para a compreensão da dinâmica evolutiva e persistência de populações naturais. Esses dados são geralmente difíceis de obter devido a dificuldades logísticas associadas acessando amostras temporais e a exigência de cometer a longo prazo para coleta de dados. Em dois principais estudos aqui apresentados, evidências empíricas da resposta à temperatura de um zooplankter central em ecossistemas de água doce é fornecida vezes evolutiva. Isto é permitido o uso de bancos de ovo latente em camadas que fornecem a oportunidade de estudar a resposta das populações históricas e seus descendentes modernos ao estresse ambiental em configurações comuns experimentais.

Experimento de jardim comum
O experimento de jardim comum mostrou que todos os traços da história de vida responderam a temperatura (Figura 6 e Figura 7). A análise ANOVA revelou que todas as populações (sub) respondem a temperatura através de plasticidade (tabela 2), com exceção de mortalidade, que não está respondendo. Evidência de mudanças evolutivas (diferenças entre populações (sub)) observou-se apenas na taxa de crescimento de população (tabela 2), que aumentou significativamente em duas das três populações de (sub) a 24 ° C (Figura 6).

Figura 6: experimento de jardim comum. Normas de reação para traços de história de vida (fecundidade, tamanho e idade na data de vencimento) e taxa de crescimento populacional (r) são mostradas para cada população (sub) sob a temperatura de aquecimento (24 ° C) em comparação com o jardim comum e o regime de temperatura atual (18 ° C). A taxa de crescimento de população 'r' é calculada usando a equação de Eulerian (1). Intervalos de confiança são mostrados. (Sub) populações são codificados por cores: (i) azul: 1960-1970; (ii) verde: 1970-1985; (iii) vermelho: > 1999. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: mortalidade. Taxas de mortalidade por população (sub) (1960-1970, 1970-1985; > 1999) são mostrados sob aquecimento (24 ° C) em comparação com os regimes de temperatura moderno (18 ° C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Experimento do mesocosmo
Após quatro semanas de seleção, representada por aquecimento a 24 ° C, a frequência dos três (sub) populações não se alterou significativamente (χ² = 0,55, P = 0,76) em comparação com o inóculo inicial (Figura 8). Entre os 30 genótipos inoculados no experimento do mesocosmo, a maioria foi identificada após quatro semanas de seleção (Figura 9). Especificamente, 70% dos genótipos inoculados foram recuperados, compatível com Poissonian expectativa de recuperação de pelo menos um representante de cada genótipo em uma amostra de 32 indivíduos.

Figura 8: experimento de competição - frequência população. População-em média, mediana e quartis (25^th e^thde 75), é mostrado para os três (sub) populações de d. magna após quatro semanas de seleção em experimentos de competição do mesocosmo (24 ° C), em comparação com uma frequência igual inicial (no o início). (Sub) populações são cor codificada conforme mostrado na Figura 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: experimento de competição - frequência genótipo. Frequências genotípicas — em média mediana e quartis (25^th e 75^th), são mostrados após quatro semanas de exposição ao aquecimento (24 ° C) em comparação com uma frequência igual inicial de genótipos (linha pontilhada). Nomes do eixo x são o ID de genótipos inoculados, agrupado por população (sub) (1960-1970-azul, verde, 1970-1985; vermelho, > 1999). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Locus	UM	Faixa de tamanho (bp)	Cartilhas (5' - 3')		Rótulo de tintura	Repita o motivo	TM
B008	HQ234154	150-170	F: TGGGATCACAACGTTACACAA		VIC	(TC) 9	56
			R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030	HQ234160	154-172	F: CCAGCACACAAAGACGAA		ANIMAL DE ESTIMAÇÃO	(GA) 11	56
			R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045	HQ234168	118-126	F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC		NED	(TG) 8	56
			R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050	HQ234170	234-248	F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC		6FAM	(GAA) 6	56
			R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064	HQ234172	135-151	F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA		6FAM	(TC) 8	56
			R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074	HQ234174	196-204	F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT		NED	(GT) 9	56
			R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096	HQ234181	234-240	F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA		VIC	(AC) 15	56
			R: TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107	HQ234184	250 – 274	F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA		ANIMAL DE ESTIMAÇÃO	(CT) 8	56
			R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

Tabela 1: multiplex de Microsatellite. O NCBI adesão número (AN), as informações multiplex PCR primer sequências, a escala do tamanho do PCR, motivo de repetição, o corante usado para rotular que o primer para a frente e a temperatura do recozimento (Tm) são mostrados.

Taxa de crescimento pop (r)		DF	F	P
Evolução (Pop)		2	30.309	< 0,001
Plasticidade (Temp)		1	531.546	< 0,001
EVOL. Plasticidade (Pop x Temp)		2	65.137	< 0,001
Mortalidade		DF	F	P
Evolução (Pop)		2	2.234	0.1162
Plasticidade (Temp)		1	2.679	0.1071
EVOL. Plasticidade (Pop x Temp)		2	1.8657	0.164
Fecundidade		DF	F	P
Evolução (Pop)		2	1.8852	0.1633
Plasticidade (Temp)		1	6.8934	0.0117
EVOL. Plasticidade (Pop x Temp)		2	1.6511	0.203
Tamanho na maturidade		DF	F	P
Evolução (Pop)		2	0.211	0.8106
Plasticidade (Temp)		1	11.1361	0,0017
EVOL. Plasticidade (Pop x Temp)		2	0.6586	0.5225
Idade na data de vencimento		DF	F	P
Evolução (Pop)		2	0.7811	0.4637
Plasticidade (Temp)		1	8.0764	0.0066
EVOL. Plasticidade (Pop x Temp)		2	0.088	0.9159

Tabela 2: análise de variância (ANOVA). Análise de variância testar se as mudanças nos traços de história de vida e taxa de crescimento populacional das populações Ressuscitado (sub) expostos ao aquecimento são explicadas pela adaptação evolutiva (populações), plasticidade (tratamento de temperatura) e seus termo de interação (evolução de plasticidade). Significativa p-valores (p< 0,05) são mostradas em negrito.

Complementar Video 1: amostragem de núcleos de sedimento. O uso de uma sonda de Big Ben é mostrado. Big Ben é um tubo de núcleo de aproximadamente 1,5 m de comprimento com um diâmetro de tubo interno de 14 cm. Consiste de um pistão em uma corda e uma cabeça de batata, para que as hastes são anexadas para conduzir o tubo no sedimento. Um apanhador de núcleo é usado para suportar o tubo de núcleo que é implantado a partir de um pequeno vaso. O pistão é empurrado para baixo para os sedimentos pela pressão gravitacional. Um quadro é usado para suportar o tubo do núcleo durante o processo de extrusão realizado usando um garrafa modificados jack que empurra o pistão para cima. Cada camada de sedimento é coletada em uma superfície metálica plana e transferida para sacos de recolha transparente para armazenamento a longo prazo [escuro e frio (4 ° C) condições]. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementares vídeo 2: sedimento peneirando. Os equipamentos necessários para peneirar o sedimento é uma balança de precisão, bandejas de amostragem branco e peneiras geológicas. De cada camada de sedimentos, pelo menos 5 g são retidos para a datação radiométrica. O restante dos sedimentos é usado para isolar ephippia. O sedimento é peneirado por dois crivos geológicos, uma com 1 mm e uma segunda com 125 µm de malha tamanho, empilhados uns sobre os outros. Médio é derramado no peneiro de malha de 1 mm para separar o barro, grandes invertebrados e partículas em suspensão. Meio que derramou sobre a segunda peneira com 125 µm de malha separa ephippia d. magna e pequenas partículas. Alíquotas de sedimentos são então transferidas para uma bandeja branca de amostragem. D. magna ephippia estão manchados pelo olho na bandeja de fundo branco. Ephippia de cada camada são recolhidos em separado de Petri. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo complementar 3: desencapsulamento. Sob um estereomicroscópio, d. magna ephippia são abertos com fórceps microdissection aplicando pressão sobre a coluna vertebral do caso quitina. A membrana interior do ovo é removida delicadamente e descansar ovos delicadamente transferido com uma pipeta Pasteur para uma placa de Petri contendo 10 mL do meio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo complementar 4: incubação. Após a exposição a um fotoperíodo longo e 20 ° C, desenvolvimento do embrião retoma entre 48h e algumas semanas. Quando o desenvolvimento estiver concluído, os embriões libertar a casca do ovo e nadam livremente no meio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Devido a alta condutividade térmica da água, os ecossistemas de água doce estão em maior risco de perda de biodiversidade de ecossistemas terrestres, em face da global aquecimento³⁴. É, portanto, fundamental para entender a resposta da espécie trapezoide destes ecossistemas e identificar mecanismos para sobreviver o estresse térmico. A compreensão desses mecanismos nos níveis de espécies e a Comunidade pode ajudar a prever como espécie é afetado pelo aquecimento global e como o efeito em espécies individuais cascatas para outros níveis tróficos. Em última análise, compreender mecanismos de respostas para o aquecimento global permite a identificação de estratégias de remediação para mitigar extinções.

Os estudos de caso aqui apresentados mostram que a resposta de d. magna ao aumento de temperatura é comodamente mediada por plasticidade em traços da história de vida e que resposta a aumento de temperatura sozinho não impõe custos de aptidão clara, pelo menos na população estudada aqui. Alta plasticidade em traços da história de vida é suportada pelo não-significativas diferenças em habilidades concorrentes das populações (sub) na presença de aquecimento. No entanto, experimentos de competição mais longo prazo em várias populações podem ser necessários generalizar estas conclusões.

Ressurreição dos estágios dormentes fornece um recurso sem precedentes para estudar os mecanismos de adaptação e trajetórias de evolução de uma espécie através de tempo de¹⁰. Espécies de zooplâncton beneficiam de um tempo de geração rápida (cerca de 2 semanas) e a viabilidade dos estágios dormentes, que permite que um antepassado para competir bateres contra seus próprios descendentes, ou evolução que começa a partir de vários Estados últimos ' Repetir '. Ecologia de ressurreição essencialmente permite que a investigação se um determinado resultado evolucionário é contingent em eventos anteriores. A identificação dos elementos genéticos da evolução é atualmente possível em experimentos de laboratório usando microorganismos para os quais 'linhas ancestrais' são congeladas e ressuscitadas para a análise comparativa com seus descendentes evoluídos⁶. No entanto, uma das principais limitações de trabalhar com organismos de laboratório é que o estado' ancestral' é uma linha de base já deslocada. O estudo dos estágios dormentes permite a recolha de amostras de espécimes do tempo anterior a qualquer evento de estresse (por exemplo, condições ambientais intocadas) e medir trajetórias evolutivas de condições ambientais não perturbadas para vários Estados últimos até os tempos modernos. Nos últimos anos, o estudo de polimorfismo de DNA nas fases de zooplâncton ressuscitado ou ainda dormentes forneceu insights importantes sobre últimos processos demográficos e adaptáveis que contribuíram para a composição genética de populações atuais^{14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36}. com a maior acessibilidade das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, o genoma e transcriptoma das fases ressuscitados ou ainda dormentes podem ser sequenciados e o tipo e o número de alterações genéticas acumularam em populações a evoluir ao longo o tempo medido.

A ressurreição SOP apresentado aqui tem importantes aplicações no campo da multi-omics em dois níveis. Multi-omics tecnologias podem ser aplicadas aos espécimes ressuscitados, permitindo uma análise exaustiva dos elementos moleculares envolvidos em respostas adaptativas à pressão de seleção ambiental. Além disso, omics tecnologias podem ser aplicadas a congelada mas fases ainda dormentes. Até agora, a aplicação de tecnologias de sequenciamento de alto throughput para descansando estágios tem sido limitada pela exigência de uma grande quantidade de material de entrada. Estas limitações estão sendo levantada³⁷. Com as exigências de redução para entrada de material e progresso em nanofluidics, sequenciamento do genoma inteiro (WGS) agora é possível a partir de tão pouco quanto 1 ng ou alguns pg de material³⁸a começar. O uso de amplificação do genoma inteiro (WGA) e técnicas de amplificação (WTA) toda transcriptoma, permitindo o enriquecimento de DNA e RNA de pequenas quantidades de tecido, revolucionou tanto metagenomics^39,40 e o médico pesquisa⁴¹. Estas tecnologias aplicadas aos ovos dormente decapsulated permitem a ultrapassagem das limitações associadas a viabilidade dos estágios dormentes e a investigação dos períodos de tempo prolongado (por exemplo, séculos).

A ressurreição de comunidades de invertebrados produzindo descanso fases permite o alinhamento de histórias da Comunidade com conhecido mudanças nas paisagens naturais, ou com mudanças ambientais inferidas a partir de análises dos sedimentos orsoils². A análise das mudanças da Comunidade em resposta a mudanças ambientais nos proporciona a capacidade de quantificar gabaritos eco-evolutivo⁴² que têm consequências importantes na população persistência⁴³, interações tróficas⁴⁴ , comunidade Assembleia⁴⁵e mudanças no⁴⁶, de funções e serviços do ecossistema. Finalmente, previsões precisas sobre respostas biológicas às mudanças ambientais são fundamentais para orientar a proteção da biodiversidade⁴⁷. Modelos de previsão atuais são imprecisos a este respeito, porque eles não levam em conta importantes biológico mecanismos tais como demografia, dispersão, evolução e interações de espécies. Entender como estes processos mudam ao longo do tempo e usar esta informação como um prior em modelagem de previsão irão melhorar a nossa capacidade de prever a espécie e persistência da Comunidade face ambiental mudar².

A aplicação do SOP apresentado aqui não é sem desafios. A principal limitação de ressuscitar estágios dormentes é a necessidade de equipamento especializado para amostragem. Além disso, todo o processo, de sedimentos peneirando para estabelecimento de culturas clonais, requer um tempo considerável hands-on.

Algumas das etapas SOP aqui apresentadas são facilmente transferíveis para outras espécies Daphnia . Estas são: amostragem, estabelecimento de linhas clonais e delineamento experimental. No entanto, outras etapas do SOP podem requerer novas otimização sob medida para as espécies em estudo. Desencapsulamento é muitas vezes aplicado para d. magna espécimes para melhorar o sucesso da incubação. No entanto, esta abordagem pode não ser adequada para amostras pequenas. Incubação de estímulos também pode variar entre espécies⁴⁸ e entre espécime coespecíficas⁴⁹. Assim, uma otimização ad hoc , as etapas de incubação da SOP pode ser necessária antes de aplicativos de outros crustáceos. Enquanto o sucesso da incubação da população d. magna ressuscitada anel Lago (30,5% em todo o arquivo sedimentar) está em consonância com os anteriores resultados⁴⁹, o sucesso da incubação varia com o estado de preservação dos sedimentos, as espécies ^50,,⁵¹e a origem geográfica do sedimento⁴⁸. Estudos futuros sobre os mecanismos que regulam a entrada e progressão através das fases de diapausa é necessário para identificar estímulos ideal para incubação adaptados às diferentes espécies.

Finalmente, fundo conhecimento do sistema de estudo, em particular a presença das espécies de interesse ao longo do tempo, é aconselhável. Isto pode ser conseguido através de registros históricos. Se não existem registros históricos, amostragem e triagem das camadas superficiais do sedimento do lago antes da amostragem de núcleo é aconselhável, embora pode fornecer informações apenas sobre a história mais recente.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
sampling bags	Fisher Scientific	11542783	Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer	ENSIS ltd	na	Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale	Veritas-M124A	TLP-50	Analytical Balance
geological sieve	UKGE limited	SV7521	200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve	UKGE limited	SV7525	200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray	nhbs	http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509	Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette	Globe Scientific inc.	138020B	Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope	nikon	smz800	Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish	EduLab	153-533	Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars	compak	Round Jam Jars 4oz	100 mL jars
glass jars	compak	Atum Jars/ Bonta Jar 10oz	200 mL jars
glass jars	bottlecompanysouth	500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid	500 mL jars
statistical software R	https://cran.r-project.org/	na	Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps	Fisher Scientific	41122405	Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	na	Open source ImageJ image processing toolkit  written in Java
mesocosm	amazon	na	Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes	Sigma_Aldrick - Merck	Z606340	premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance	Beckman Coulter	A48705	DNA extraction kit
size standard	Thermo Fisher Scientific	4322682	LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer	ABI	na	Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing