Résurrection de dormance Daphnia magna: Protocole et Applications

Résumé

Études à long terme sont essentielles pour comprendre le processus d’évolution et les mécanismes d’adaptation. Généralement, ces études nécessitent des engagements au-delà de la durée de vie des chercheurs. Une méthode puissante est décrit ici, qui avance considérablement de collecte de données de l’état-of-the-art pour générer les données longitudinales dans les systèmes naturels.

Résumé

Les études à long terme permettent l’identification de processus d’éco-évolution qui se produisent sur une période de temps prolongée. En outre, ils fournissent des données empiriques clées pouvant servir à la modélisation prédictive pour prévoir les réponses évolutives des écosystèmes naturels aux changements environnementaux à venir. Toutefois, si l'on exclut quelques cas exceptionnels, les études à long terme sont rares en raison des difficultés logistiques associées pour accéder aux échantillons temporelles. La dynamique temporelle est fréquemment étudiée en laboratoire ou dans des expériences contrôlées en mésocosme avec études exceptionnelles que reconstituer l’évolution des populations naturelles à l’état sauvage.

Ici, un mode opératoire normalisé (SOP) est fourni pour raviver ou ressusciter dormants Daphnia magna, une espèce très répandue de zooplancton dans les écosystèmes aquatiques, pour avancer considérablement la collecte de données longitudinales state-of-the-art dans systèmes naturels. Le domaine de l’écologie de la résurrection a été défini en 1999 par Kerfoot et collègues de travail, même si la première tente à l’éclosion de diapause zooplancton oeufs datent de la fin des années 1980. La méthodologie de ressusciter des espèces de zooplancton a été plus en plus fréquemment appliquée depuis livre séminal de Kerfoot, quoique propagées entre les laboratoires uniquement via le transfert de la connaissance directe. Ici, une PON est décrite qui fournit un protocole étape par étape sur la pratique de ressusciter dormants Daphnia magna oeufs.

Deux principales études sont fournis en qui la réponse de remise en forme du ressuscité des populations de Daphnia magna à réchauffement est mesuré, capitalisant sur la possibilité d’étudier des populations historiques et modernes dans les mêmes paramètres. Enfin, l’application de technologies de séquençage de génération suivante aux stades reconstituées ou encore en dormance est discutée. Ces technologies offrent une puissance sans précédent en disséquant les processus et les mécanismes de l’évolution si appliqué aux populations qui ont vécu des changements de pression de sélection au fil du temps.

Introduction

Études à long terme sont essentielles à la compréhension des processus écologiques et évolutionnaires dans la nature et pour évaluer comment les espèces répondent aux et persistent au cours de changements environnementaux¹. C’est parce que le processus d’éco-évolution se produisent à travers les générations et les changements dans l’environnement se produisent sur des long temps portées. En outre, les études à long terme prévoir clées données empiriques qui permettent d’améliorer la précision de la modélisation prédictive pour prévoir les réponses évolutives des écosystèmes naturels aux changements environnementaux². L’exactitude de ces modèles est essentiel d’appliquer des stratégies de gestion et de conservation pour préserver la biodiversité et aux services écosystémiques.

Si l'on exclut quelques cas exceptionnels (par exemple, Galapagos Darwin pinsons algues et^{3 4}), les études à long terme sont en grande partie limitées aux espèces avec des temps de génération court lesquelles peuvent être propagées dans le laboratoire^{5,6 , 7 , 8}. par conséquent, les processus qui sous-tendent la dynamique évolutive demeurent insaisissables. En raison des difficultés logistiques associées pour accéder aux échantillons temporelles, données empiriques sont étudiées plus fréquemment dans un espace que dans un contexte temporel, et les processus éco-évolution temporelles sont déduites ou modélisés de données spatiales. Cette approche s’appelle « espace-for-time » substitution⁹, par lequel l’espace est adoptée comme substitut pour étudier la dynamique d’évolutive temporelle. La principale limitation de la substitution de « espace-for-time » est que les taux d’adaptation à différentes échelles spatiales diffèrent de la variation temporelle de la même population ; inférences fondées sur le remplacement du temps avec l’espace sont donc partiales¹⁰.

Une alternative puissante qui permet d’étudier la dynamique évolutive dans les écosystèmes naturels au fil du temps est l’analyse des changements écologiques et génétiques chez les espèces produisant des stades dormants¹¹. Ces phases de sommeil s’accumulent en forme stratifiée archives biologiques qui peuvent être datés avec précision et paleolimnologically caractérisée^12,13. Ce qui est important, ces phases de sommeil peuvent être ressuscitées et utilisés en laboratoire, où leur réponse évolutive aux changements environnementaux peut être mesuré directement. Populations historiques peuvent être affrontées leurs descendants modernes ont évolué à étudier les changements de remise en forme et la fonction des gènes, en évolution en phase avec les changements environnementaux^14,15,16.

Les stades dormants comprennent les kystes, les graines, les spores et banques d’oeufs. Bien que les premières études sur la remonte des œufs dormants ressuscité à la fin des années 1980¹⁷et une poignée d’études ont appliqué cette technique dans le début des années 1990^18,19, le domaine de l’écologie de la résurrection a été formellement créé par l’article fondamental de Kerfoot et ses collègues en 1999²⁰. Cette pratique a été appliquée essentiellement en paléolimnologie reconstructions des espèces d’eau douce^17,21,22. Toutefois, un POS n’est pas encore disponible. Ici, une description étape par étape du protocole résurrection appliqué aux œufs dormants des espèces de zooplancton Daphnia magna est fournie, de l’échantillonnage de sédiments à la mise en place de cultures clonales de nouveau-nés. Étapes du POS qui sont facilement transférables à d’autres espèces de Daphnia, ainsi que les mesures qui pourraient nécessiter une optimisation supplémentaire, on discute.

Daphnia sont d’eau douce zooplanctontes présents dans la plupart des habitats lotiques²³ . Espèces de Daphnia sont soit obligatoirement parthénogénétiques cyclique ou asexuée. D. magna est une parthénogenèse cyclique qui se reproduit par clonage sous des conditions environnementales favorables,²⁴. Lorsque les conditions environnementales se détériorent, production de mâles se produit et recombinaison sexuelle conduit à la formation des oeufs fécondés qui entrent dans un état de dormance, protégé de l’environnement par une affaire de chitine appelée ephippium. Une proportion de ces œufs dormants éclore quand les conditions environnementales favorables reviennent. Cependant, une grande partie de la Banque de œufs dormants n’a jamais une chance d’éclore et ainsi construire des archives biologiques au fil du temps. Les stades dormants demeurent enfouis dans les sédiments des lacs et des étangs et peuvent être récupérés pour l’étude de la dynamique évolutive sur une période de temps prolongée. Parce que les œufs dormants de d. magna sont le résultat de la recombinaison sexuelle, ils sont une bonne représentation de la diversité génétique naturelle des espèces²⁵. En outre, elles peuvent être maintenues par l’intermédiaire de reproduction clonale dans le laboratoire. Ces caractéristiques offrent l’avantage unique d’organismes modèles isogéniques, tout en conservant la diversité génétique naturelle.

Deux études clés sont présentés pour démontrer les avantages de comparer directement les descendants historiques et modernes de la même population de d. magna touchés par pression de sélection environnementale au fil du temps. D. magna spécimens furent ressuscités de lac anneau (Danemark), une faible profondeur (5 m de profondeur ; surface 22 ha) étang mixte qui a connu une augmentation moyenne fréquence température et vagues de chaleur au fil du temps. Les populations de d. magna (void) ont été ressuscitées le long de ce gradient temporel 60 ans (1960-2005) et étudiées pour étudier la réponse évolutive au réchauffement de la température. Dans la première étude dans une expérience de jardin commun, changements dans les caractéristiques du cycle de vie liés à la remise en forme ont été mesurés en réponse à une augmentation de température de + 6 ° C, en ligne avec les prévisions du Groupe intergouvernemental sur le changement climatique pour les 100 prochaines années ²⁶. dans la seconde étude, une expérience en mésocosme servait à mesurer les capacités concurrentielles des trois (sous) populations sous le réchauffement de la planète. Ces expériences combinées montrent qu’en présence de réchauffement de la planète comme le stress seul, toutes les caractéristiques du cycle biologique et les populations montrent un niveau élevé de plasticité et ont des capacités concurrentielles égales. Ces résultats suggèrent que le réchauffement comme une contrainte unique n’impose pas de coûts importants de remise en forme, au moins dans la population étudiée ici.

Protocole

Le SOP suivant fournit une description étape par étape du protocole utilisé pour ressusciter Daphnia magna œufs dormants, y compris une description détaillée de l’échantillonnage et l’isolement des éphippies des sédiments et mise en place de cultures clonales ( Figure 1).

Figure 1 : un guide étape par étape à la résurrection de Daphnia magna. Sédiments d’un habitat naturel d’eau douce (A) est échantillonné avec un carottier à piston (B). La carotte de sédiments (C) est découpé en couches supplémentaires de 1 ou 0,5 cm (D). Chaque couche de sédiments est stocké dans un sac à fermeture éclair échantillon (E) dans des conditions sombres et froides (4 ° C). Chaque couche de sédiments est pesé et tamisée à l’aide de tamis géologiques (1 mm et 125 µm maillages, F). Bacs à fond blanc sont utilisés pour isoler éphippies Daphnia magna (G). Décapsulés œufs dormants (H) sont transférés à des boîtes de Pétri et exposés à des stimuli de lumière et de température pour provoquer l’éclosion. Les nouveau-nés sont transférés pour séparer les bocaux (j’ai) pour établir des lignes d’isoclonal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

1. prélèvement d’échantillons de carottes de sédiments

1. Sédiments d’échantillon des lacs ou les étangs à l’aide d’un carottier à piston. Ce protocole utilisé Big Ben²⁷, un tube de base d’environ 1,5 m de longueur avec un diamètre de tube interne de 14 cm. Big Ben se compose d’un piston sur une corde et d’une tête de carottier, à laquelle les tiges sont attachés pour enfoncer le tube dans le sédiment. Un receveur de base facilite le support du tube support lorsqu’il est plein de sédiments. Pour extruder le sédiment, un cadre conserve l’ensemble tube verticale et fixes, et un cric bouteille modifiée est utilisé pour pousser le piston vers le haut pendant le processus d’extrusion (supplémentaire vidéo 1).
   1. Pour les étangs peu profonds de moins de 1 m de profondeur, utilisez un carottier à gravité plexiglass de pas plus de 6 cm de diamètre Poussée manuellement dans le sédiment.
   2. Pour les lacs profonds (> 6 m de profondeur), utilisez Livingston piston carottiers²⁸ ou carottiers de sédiments Griffith seul disque dur avec le sida d’un bateau ponton ancré. Le carottier à piston tige Livingstone-type lecteur peut être utilisé dans l’eau jusqu'à environ 30 m profond pour recueillir successives un mètre lecteurs de soft de sédiments lacustres consolidée. Le carottier de Griffith lecteur unique se compose d’une tête de base simple mais robuste qui relie les tubes en polycarbonate standard à embiellage Livingstone. Les carottiers sont poussés dans le sédiment avec les tiges, et un piston fournit l’aspiration nécessaire pour la récupération des sédiments (Figure 2).
   3. Pour l’extraction continue, carottes intactes, utilisez vibracoring. Ces carottiers travaillent sur une variété de profondeurs et peuvent récupérer des échantillons de carottes de différentes longueurs, selon la lithologie de sédiments. Vibration de faible amplitude qui est transférée de la tête de vibracore vers le bas à travers le Canon attaché ou le tube de base liquéfie les sédiments, ce qui permet du carottier attachée à l’unité vibracore de pénétrer dans les sédiments liquéfiés. Certains vibracorers sont petits, légers et portables, d’autres sont grandes unités lourdes qui seulement peuvent être déployées de grands navires. Le choix de carottiers dépend de la lithologie des sédiments.
2. Tranchez le noyau horizontalement dans des couches supplémentaires de 1 cm ou moins en utilisant une surface plate en métal (supplémentaire vidéo 1). Carottiers de sédiments comme celle utilisée ici sont conçus pour réduire les pressions hydrostatiques à extrusion, réduire la perturbation des couches de sédiments. Lorsque autres carottiers sont utilisés, l’écorce extérieure de chaque couche de sédiments peut-être être enlevée avec une sorte de biscuit-coupeur de lame pour limiter la contamination entre les couches.
3. Chaque couche de sédiments dans un sac de prélèvement séparé (supplémentaire 1 vidéo) de recueillir et stocker dans l’obscurité et le froid (4 ° C) des conditions.
4. Recueillir un minimum de 5 g de sédiments de toutes les couches de datation radiométrique. Datation radiométrique étant un protocole établi pour une description détaillée de l’essai de datation, consultez existants publications^12,13.

Figure 2 : dessin animé du piston carottage procédure. Carottier à piston, un tube creux avec un joint coulissant intérieur (le piston) qui produit un vide faible. Lorsque le piston touche l’interface sédiment-eau, le poids pousse le carottier dans les sédiments et le vide provoque les sédiments étant évidées pour entrer et monter le tube sans perturber les couches de sédiments. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. le tamisage des couches de sédiments

1. À l’aide d’une balance de précision, peser chaque couche de sédiments pour référence ultérieure. Utilisez la surface et le poids pour calculer la densité d’espèces dans le lac.
2. Tamis à chaque couche de sédiments à l’aide de deux tamis géologiques empilés les uns sur les autres. Le premier tamis a une taille de maille de 1 mm et argile, gros invertébrés et particules, par exemple , semences, plantes et insectes, sépare le reste du sédiment. Le deuxième tamis dispose d’un maillage de 125 µm et sépare le reste du sédiment (supplémentaires vidéo 2) d. manga éphippies et petites particules.
3. Transfert en petites parties aliquotes de la fraction de sédiments prélevée sur le tamis de maille de 125 µm à un plateau de fond blanc. Selon le type de sédiments, plus petites ou plus grandes aliquotes de sédiments peuvent être transférés à chaque fois.
   1. Ajouter des petits volumes (jusqu'à 200 mL) de moyenne au bac blanc d’échantillonnage pour la fraction de sédiments transféré une nouvelle suspension et faciliter oeil repiquage d’éphippies (Figure 3). Le support utilisé pour remettre en suspension les sédiments peut être déchlorée l’eau du robinet, eau de forage, COMBO²⁹ou ADaM médium (Aachener Daphnien)³⁰. Ci-après, le terme « moyen » servira à se référer à une ou toutes les solutions énumérées.

Figure 3 : Daphnia magna ephippium. Œufs dormants Daphnia magna immédiatement après la décapsulation. L’ephippium (A), la membrane de l’oeuf intérieure (B) et les œufs dormants (C) apparaissent. Echelle = 500 µm.

3. la décapsulation d’éphippies et l’éclosion

1. Avec une pipette Pasteur jetable ou à l’aide de pinces de microdissection, transfert individuel éphippies à Pétri rempli de 10 mL de milieu. Utilisez au moins une boîte de Pétri par la couche de sédiments.
2. Sous un microscope stéréo, décapsule chaque éphippies avec une pincette microdissection en forçant à ouvrir l’affaire de la chitine (supplémentaire vidéo 3). Retirer la membrane interne de repos oeuf délicatement, faisant attention à ne pas perturber les œufs et les transférer sur le plat de Pétri remplie de milieu à l’aide d’une pipette Pasteur. Décapsulation augmente le succès de l’éclosion pour d. magna ; cependant, il ne peut pas être exigé ou il peut être difficile pour les autres espèces de Daphnia produisant éphippies plus petits.
3. Exposer les oeufs décapsulés à une lumière à spectre complet jour longue photopériode (16:8 lumière : obscurité) et à haute température (20 ± 1 ° C) pour provoquer l’éclosion dans une chambre ou un dispositif de température contrôlée (incubateur). L’éclosion a lieu entre 48 heures et plusieurs semaines (jusqu'à quatre ; Vidéo supplémentaire 4). En absence de décapsulation, exposer directement les éphippies à l’éclosion de stimuli (lumière longue photopériode du jour (16:8 lumière : obscurité) et haute température (20 ± 1 ° C)).

4. dégager les lignes Isoclonal de Daphnia magna

1. Établir des lignes d’isoclonal de simples petites tortues en transférant individuels d. magna de l’étape 3.3 pour séparer les bocaux remplis avec 200 mL de milieu à l’aide d’une pipette Pasteur jetable. Chaque individu est génétiquement distincte, étant le résultat de la recombinaison sexuelle.
2. Maintenir les lignes isoclonal indéfiniment dans des conditions stocks composé de 10 ± 1 ° C, 16:8 régime de lumière : obscurité, nourris par semaine avec 0,2 mg C/L de Chlorella vulgaris ou autres algues vertes (p. ex., Scenedesmus obliquus). Renouveler le milieu de chaque troisième semaine. Conditions de stock peuvent varier avec la température, alimentation, régimes et espèces.

5. principales études

NOTE : Une description des deux principales études figure dans laquelle ressuscité D.magna (void) populations depuis les archives sédimentaires du lac Ring (Danemark) sont utilisées pour évaluer la réponse évolutive au réchauffement. Trois populations de (sous-) furent ressuscitées par rapport aux périodes de temps suivantes : 1960-1970, 1970-1985, et > 1999. D. magna à couver le succès par les archives sédimentaires que se situait entre 11 et 58 % (Figure 4). Depuis les nouveau-nés prélevés chaque timeperiod, un sous-ensemble aléatoire a été choisi pour les deux études clés décrites ici. Ces études visaient à évaluer si les (sous) populations ressuscitées de différentes périodes le long du gradient de température montrent des différences dans les caractéristiques du cycle de vie liés à la remise en forme (5.1) et s’ils avaient des capacités concurrentielles différentes (5.2) après l’exposition au réchauffement de la planète.

Figure 4 : le succès dans une archive sédimentaire prélevé dans le lac anneau d’éclosion. La proportion de nouveau-nés avec succès le long les archives sédimentaires du lac anneau utilisé dans les études clés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

1. Expériences de jardins communs
   1. Transfert en dix nouveau-nés par habitants (void) de cultures mères aux conditions du jardins communes : 16 ° C ; photopériode longue (régime de lumière : obscurité 16:8) ; nourrir tous les jours avec 0,8 mg C/L de Chlorella vulgariset renouvellement moyen tous les deux jours. Maintenir les nouveau-nés dans des conditions de jardins communes au moins deux générations (env. 45 jours). Les conditions communes de jardins réduisent les interférences de l’effet maternel et synchroniser la reproduction chez les nouveau-nés.
   2. Dès la sortie de la deuxième couvée dans la poche incubatrice, transfert femelles adultes de la deuxième génération de pots de 500 mL remplis moyen jusqu'à ce qu’ils libèrent la deuxième couvée de juvéniles.
   3. Transfert au hasard des juvéniles de 24 à 48 h, né de la deuxième couvée de la deuxième génération, de pots de 100 mL rempli de milieu et exposés à des conditions expérimentales suivantes : 18 ° C (température actuelle dans le lac) et (réchauffement, température de 24 ° C prévu par l' IPCC ²⁶ pour les 100 prochaines années), 16:8 régime clair : sombre et alimentation quotidienne 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris.
   4. Sur chaque animal expérimental, mesurez la taille à maturité avec un stéréomicroscope comme étant la distance entre la tête et la base de la colonne de queue (Figure 5). La photo de chaque animal et analyser par la suite sa taille à l’aide d’un logiciel d’image adapté.
   5. Mesurer l’âge à la maturité : le jour où les œufs sont observées pour la première fois dans la poche incubatrice.
   6. Mesurer le taux de mortalité : le nombre de personnes disparues au cours de l’expérience.
   7. Mesurer la fécondité : le nombre total de descendants sorti en première et deuxième clonale de reproduction.
   8. Mesurer le taux de croissance de la population, estimé à l’aide de l’équation d’Euler (1) :
      (1)
      Où l_x est le pourcentage de survie à l’âge x, b,_x est le nombre de nouveau-nés produites par un individu survivant à l’âge x, et r est le taux d’accroissement naturel intrinsèque.
   9. Effectuer une analyse statistique en utilisant le logiciel disponible dans le commerce. Ici, utilisez R³¹ pour tracer les normes de réaction (expression phénotypique d’un même génotype dans les environnements) pour chaque caractère de l’histoire de la vie, en utilisant le package ggplot2. Calculer le taux de mortalité pour la population via l’analyse de survie (rms package R ; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf). Enfin, effectuer une analyse de variance (ANOVA, tableau 2) R³¹ à évaluer si l’effet de la température sur les traits peut s’expliquer par l’évolution (différences entre les populations), la plasticité (réponse au traitement), ou l’évolution de plasticité (population x traitement).
2. Expérience de compétition
   1. Transfert en dix nouveau-nés par population de cultures mères aux conditions du jardins communes : 20 ° C, longue photopériode (régime de lumière : obscurité 16:8), nourrir tous les jours avec 0,8 mg C/L de Chlorella vulgaris et renouvellement moyen tous les deux jours. Maintenir des conditions de jardins communes au moins deux générations (env. 45 jours) réduire l’interférence des effets maternels.
   2. Au hasard assigner cinq jeunes de 24 à 48 h de la deuxième couvée des deuxième générations de chaque progéniture aux mésocosmes expérimentaux (20 L en plastique aquariums remplis de moyenne), en géométrie, une densité de 10 animaux/L.
   3. Exposer les mésocosmes à 24 ° C, 16:8 DL régime et nourrir tous les jours avec 0,8 mg C/L de Chlorellavulgaris dans une chambre de température contrôlée ou un incubateur pendant au moins quatre semaines (> 3 générations clonales).
   4. Réforme chaque mésocosme hebdomadaire, actualisation de 10 % du milieu pour simuler une dynamique de population que Daphnia peuvent rencontrer dans le milieu naturel. Imposer l’abattage en enlevant un volume connu de médium et d’animaux de chaque aquarium 1,2 L (dans ce cas) et en remplaçant le volume abattu par un milieu frais. Démarrer le régime abattage après que les animaux de laboratoire atteignent leur maturité (jour 10).
   5. À la fin de la quatrième semaine, dégustez 32 animaux de chaque mésocosme pour évaluer les changements dans la composition génotypique par rapport à l’inoculum initial.
      1. Placer des daphnies dans des microtubes à centrifuger et enlever l’excès de liquide à l’aide d’une pipette Pasteur.
      2. Flash gel tubes individuels dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
      3. Extraire l’ADN génomique de célibataires à l’aide de protocoles disponibles et en suivant les instructions du fabricant.
      4. Amplifier l’ADN extraite à l’aide d’un certain nombre de marqueurs génétiques suffisantes pour fournir un génotype multilocus unique par la progéniture. Ici, 8 microsatellites disposées dans un même multiplex (M01, tableau 1) ont été utilisées suivant les protocoles établis^32,,³³.
      5. Génotype amplifié fragments sur un analyseur de fragment.
      6. Effectuer l’analyse des fragments avec un logiciel commercial ou disponible gratuitement à l’aide d’une norme de taille appropriée.
      7. Évaluer la composition génotypique à la fin de l’expérience par des individus de génotypage du 32 avec un ensemble des microsatellites comme décrit³³et calculer la fréquence de chaque génotype à la fin de l’expérience par rapport à l’inoculum initial.

Figure 5 : femelle adulte Daphnia magna. Femelle adulte Daphnia magna avec oeufs parthénogénétiques dans la poche incubatrice. La distance entre la tête et la base de la colonne de queue est utilisée pour mesurer la taille de l’animal. Les lignes rouges indiquent les mesures de la taille. Echelle = 500 µm.

Résultats

Des données empiriques à long terme sont essentielles à la compréhension de la dynamique évolutive et la persistance des populations naturelles. Ces données sont généralement difficiles à obtenir en raison des difficultés logistiques associées pour accéder aux échantillons temporelles et l’obligation de s’engager à long terme de collecte de données. Dans les deux études clés présentés ici, les preuves empiriques de la réponse à la température d’un prédateur central dans les écosystèmes d’eau douce sont disponibles sur fois évolutionnaires. Cette option est activée par l’utilisation des banques de couches œufs dormants qui fournissent l’occasion d’étudier la réponse des populations historiques et leurs descendants modernes à un stress environnemental dans les paramètres expérimentaux communs.

Expérience de jardin commun
L’expérience de jardin commun a montré que toutes les caractéristiques du cycle vital a répondu à la température (Figure 6 et Figure 7). L’analyse de variance a révélé que toutes les (sous-) populations réagissent à température par l’intermédiaire de plasticité (tableau 2), à l’exception de la mortalité, qui ne répond pas. Les changements évolutifs (différences entre les populations (void)) n’a été observée seulement dans les taux de croissance de la population (tableau 2), qui a considérablement augmenté dans deux des trois populations de (sous-) à 24 ° C (Figure 6).

Figure 6 : expérience de jardin commun. Normes de réaction de caractéristiques démographiques (fécondité, taille et âge à la maturité) et le taux de croissance démographique (r) sont indiqués pour chaque population (void) sous température (24 ° C) le réchauffement par rapport au jardin commun et le régime actuel de la température (18 ° C). Le taux de croissance de population «r» est calculé selon l’équation eulérien (1). Intervalles de confiance sont indiqués. Les populations de (sous-) sont codées par couleur : (i) bleu : 1960-1970 ; (ii) vert : 1970-1985 ; (iii) rouge : > 1999. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : mortalité. Taux de mortalité pour la population (void) (1960-1970, 1970-1985 ; > 1999) sont indiquées en regard de réchauffement de la planète (24 ° C) par rapport aux régimes de température moderne (18 ° C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Expérience en mésocosme
Après quatre semaines de sélection, représenté par le réchauffement dû à 24 ° C, la fréquence des trois populations de (sous-) ne changent pas significativement (χ² = 0,55, P = 0,76) par rapport à l’inoculum initial (Figure 8). Parmi les 30 génotypes inoculés dans l’expérience en mésocosme, la majorité a été identifiée après quatre semaines de sélection (Figure 9). Plus précisément, 70 % des génotypes inoculés ont été récupérés, compatible avec poissonnienne attente de récupérer au moins un représentant de chaque génotype dans un échantillon de 32 personnes.

Figure 8 : expérience de compétition - fréquence population. Population moyenne médiane et les quartiles (25^ème et 75^ème), est indiqué pour les trois populations (void) de d. magna après quatre semaines de sélection dans les expériences de compétition en mésocosme (24 ° C), par rapport à une fréquence égale initiale (à au début). (Sous) populations sont couleur codée comme illustré à la Figure 6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : expérience de la compétition - fréquence de génotype. Fréquences génotypiques — moyenne médiane et les quartiles (25^ème et 75^ème), figurent après quatre semaines d’exposition au réchauffement de la planète (24 ° C) par rapport à une fréquence égale initiale des génotypes (ligne pointillée). Les noms sur l’axe des abscisses correspondent à l’ID de génotypes inoculées, regroupé par habitants (void) (bleu, 1960-1970 ; vert, 1970-1985 rouge > 1999). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Locus	UN	Classe de grandeur (bp)	Amorces (5' - 3')		Étiquette de colorant	Motif de répétition	TM
B008	HQ234154	150 – 170	F: TGGGATCACAACGTTACACAA		VIC	(TC) 9	56
			R : GCTGCTCGAGTCCTGAAATC
B030	HQ234160	154-172	F: CCAGCACACAAAGACGAA		ANIMAL DE COMPAGNIE	(GA) 11	56
			R : ACCATTTCTCTCCCCCAACT
B045	HQ234168	118-126	F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC		NED	(TG) 8	56
			R : ATAGTTTCAGCAACGCGTCA
B050	HQ234170	234-248	F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC		6FAM	(GAA) 6	56
			R : TATGGCGTGGAATGTTTCAG
B064	HQ234172	135-151	F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA		6FAM	(TC) 8	56
			R : CAAACGCGTTCGATTAAAGA
B074	HQ234174	196-204	F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT		NED	(GT) 9	56
			R : TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG
B096	HQ234181	234-240	F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA		VIC	(AC) 15	56
			R : TTGAACCACGTCGAGGATTT
B107	HQ234184	250-274	F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA		ANIMAL DE COMPAGNIE	(CT) 8	56
			R : TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG

Tableau 1 : Microsatellite multiplex. Le NCBI adhésion nombre (AN), l’information multiplexe, les séquences d’amorces PCR, la gamme de taille PCR, le motif de répétition, le colorant utilisé pour l’étiquette que l’amorce vers l’avant et la température de recuit (Tm) sont indiquées.

Taux de croissance pop (r)		DF	F	P
Evolution (Pop)		2	30.309	< 0,001
Plasticité (Temp)		1	531.546	< 0,001
Evol. Plasticité (Pop x Temp)		2	65.137	< 0,001
Mortalité		DF	F	P
Evolution (Pop)		2	2.234	0,1162
Plasticité (Temp)		1	2.679	0.1071
Evol. Plasticité (Pop x Temp)		2	1.8657	0,164
Fécondité		DF	F	P
Evolution (Pop)		2	1.8852	0.1633
Plasticité (Temp)		1	6.8934	0,0117
Evol. Plasticité (Pop x Temp)		2	1.6511	0,203
Taille à la maturité		DF	F	P
Evolution (Pop)		2	0.211	0.8106
Plasticité (Temp)		1	11.1361	0,0017
Evol. Plasticité (Pop x Temp)		2	0.6586	0.5225
L’âge à la maturité		DF	F	P
Evolution (Pop)		2	0.7811	0.4637
Plasticité (Temp)		1	8.0764	0,0066
Evol. Plasticité (Pop x Temp)		2	0,088	0.9159

Tableau 2 : analyse de la variance (ANOVA). Analyse de variance, vérifier si des changements dans les caractéristiques du cycle vital et de la croissance démographique des populations ressuscité (void) exposés au réchauffement sont expliquées par l’adaptation évolutive (populations), la plasticité (traitement de la température) et leur terme d’interaction (évolution de la plasticité). Significative p-valeurs (p< 0,05) sont indiqués en gras.

Supplémentaire vidéo 1 : prélèvement d’échantillons de carottes de sédiments. L’utilisation d’un carottier à Big Ben est indiquée. Big Ben est un ensemble tube d’environ 1,5 m de longueur avec un diamètre de tube interne de 14 cm. Il se compose d’un piston sur une corde et d’une tête de carottier, à laquelle les tiges sont attachés pour enfoncer le tube dans le sédiment. Un receveur de base est utilisé pour soutenir le tube de base qui est déployé à partir d’un petit navire. Le piston est poussé vers le bas dans le sédiment par pression gravitationnelle. Un cadre est utilisé pour soutenir l’ensemble tube pendant le processus d’extrusion réalisé à l’aide d’un cric bouteille modifiés qui pousse le piston vers le haut. Chaque couche de sédiments est collecté sur une surface plate en métal et transféré dans des sacs de prélèvement transparent pour le stockage à long terme [sombre et froid (4 ° C) conditions]. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Complémentaire 2 vidéo : sédiments tamisage. L’équipement requis pour le tamisage des sédiments est une balance de précision, des plateaux blanc d’échantillonnage et des tamis géologiques. De chaque couche de sédiments, au moins 5 g sont conservés pour la datation radiométrique. Le reste des sédiments est utilisé pour isoler éphippies. Le sédiment est tamisé par deux tamis géologiques, un avec 1 mm et l’autre avec la grosseur de maille 125 µm, empilés les uns sur les autres. Moyen est versé sur le tamis à mailles de 1 mm pour séparer l’argile, gros invertébrés et les particules. Moyen versé sur le deuxième tamis à 125 µm maille sépare éphippies d. magna et les petites particules. Des parties aliquotes de sédiments sont ensuite transférés dans un bac blanc d’échantillonnage. D. magna éphippies sont repérés par l’oeil dans le bac de fond blanc. Éphippies de chaque couche sont collectées en Pétri distinct. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 3 : décapsulation. Sous un stéréomicroscope, d. magna éphippies sont ouverts avec une pince de microdissection en appliquant une pression sur la colonne vertébrale de l’affaire de la chitine. La membrane de l’oeuf intérieur est retirée délicatement et doucement les oeufs de repos transférés avec une pipette Pasteur à une boîte de Pétri contenant 10 mL de milieu. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 4 : éclosion. Après exposition à une photopériode longue et 20 ° C, le développement de l’embryon reprend entre 48 h et quelques semaines. Lorsque le développement est terminé, les embryons se libérer de la coquille d’oeuf et nagent librement dans le milieu. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

En raison de la conductivité thermique de l’eau, écosystèmes d’eau douce sont à risque plus élevé de perte de biodiversité que les écosystèmes terrestres face à global warming³⁴. Il est donc essentiel de comprendre la réponse des espèces clés dans ces écosystèmes et d’identifier les mécanismes d’adaptation pour survivre à un stress thermique. La compréhension de ces mécanismes aux niveaux espèces et de la Communauté peut aider à prédire comment les espèces sont touchés par le réchauffement climatique et comment les cascades de l’effet sur chaque espèce à d’autres niveaux trophiques. En fin de compte, compréhension des mécanismes de réponse au réchauffement climatique permet l’identification des stratégies correctives afin d’atténuer les extinctions.

Les études de cas présentées ici montrent que la réponse de d. magna à augmentation de température est omniprésente médiée par plasticité dans caractéristiques du cycle vital et que la réponse à l’augmentation de la température seule n’impose pas de frais de remise en forme claire, au moins dans le population étudiée ici. Grande plasticité dans caractéristiques du cycle vital est pris en charge par des différences non significatives dans les capacités concurrentielles des populations (void) en présence de réchauffement. Cependant, les expériences de compétition à plus long terme sur les populations multiples peuvent être nécessaires de généraliser ces résultats.

Résurrection des stades dormants fournit une ressource sans précédent afin d’étudier les mécanismes d’adaptation et les trajectoires de l’évolution d’une espèce par heure¹⁰. Espèces de zooplancton bénéficient d’une durée d’une génération rapide (environ 2 semaines) et la viabilité des stades de sommeil, qui permet à un ancêtre de rivaliser headtohead contre ses propres descendants, ou de « rejouer » évolution qui commence à partir de différents États passés. Écologie de la résurrection permet essentiellement l’enquête de déterminer si un résultat évolutif particulier est subordonné à un événement antérieur. L’identification des éléments génétiques de l’évolution est actuellement possible en laboratoire à l’aide de micro-organismes pour lesquels « lignées ancestrales » sont congelées et ressuscitées pour l’analyse comparative avec leurs descendants évolués⁶. Cependant, une des limites principales de travailler avec les organismes de laboratoire est que « l’état ancestral » est une base déjà décalée. L’étude des stades dormants permet le prélèvement de spécimens de temps antérieurs à n’importe quel événement de stress (p. ex., conditions environnementales vierges) et de mesurer des trajectoires évolutives de conditions environnementales non perturbées à divers États passés jusqu'à l’époque moderne. Ces dernières années, l’étude du polymorphisme de l’ADN dans les stades de zooplancton ressuscité ou encore en dormance a fourni des renseignements importants dans les processus adaptatifs et démographiques antérieurs qui ont contribué à la composition génétique des actuelles populations^{14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36}. l’accès supérieur des technologies de séquençage à haut débit, peuvent être séquencés le génome et le transcriptome de stades ressuscités ou encore en dormance et le type et le nombre de modifications génétiques accumulent dans l’évolution des populations au cours le temps mesuré.

La résurrection SOP présentée ici a des applications importantes dans le domaine du multi-omics sur deux niveaux. Multi-omics technologies peuvent être appliquées aux spécimens ressuscités, ce qui permet une analyse exhaustive des éléments moléculaires impliqués dans les réponses adaptatives à la pression de sélection environnementale. En outre, les omiques technologies peuvent être appliquées à décapsulés mais encore en dormance stades. Jusqu'à présent, l’application de technologies de séquençage à haut débit aux étapes de repos a été limitée par l’exigence d’une grande quantité de matières entrantes. Ces restrictions soient levées³⁷. Les conditions de descente pour matières entrantes et le progrès en nanofluidics, le séquençage du génome entier (WGS) est maintenant possible à partir d’aussi peu que 1 ng ou quelques pg de démarrage matériel³⁸. L’utilisation de l’amplification du génome entier (WGA) et toute transcriptome techniques d’amplification (WTA), permettant l’enrichissement de l’ADN et l’ARN de très petites quantités de tissu, a révolutionné la métagénomique^39,40 tant médical recherche⁴¹. Ces technologies appliquées aux œufs dormants décapsulés permettent le dépassement des limites associées à la viabilité des stades de sommeil et de l’enquête sur des périodes prolongées (p. ex., siècles).

La résurrection des communautés d’invertébrés produisant des phases de repos permet l’alignement des histoires de la communauté avec des changements connus dans les paysages naturels, ou aux changements environnementaux déduites d’analyses des sédiments orsoils². L’analyse des changements de nature communautaire en réponse aux changements environnementaux nous fournit la capacité de quantifier les rétroactions éco-évolution⁴² ayant des conséquences importantes sur la population persistance⁴³, interactions trophiques⁴⁴ , communauté Assemblée⁴⁵et les changements dans l’écosystème des fonctions et services⁴⁶. Enfin, des prévisions précises sur les réactions biologiques aux changements environnementaux sont primordiale pour guider la protection de la biodiversité,⁴⁷. Des modèles de prévision actuels sont inexactes à cet égard, car ils ne tiennent pas les mécanismes biologiques importants tels que la démographie, la dispersion, évolution et interactions entre les espèces du compte. Comprendre comment ces processus évoluent avec le temps et utiliser cette information comme un préalable dans la modélisation des prévisions permettra d’améliorer notre capacité à prédire les espèces et la persistance de la communauté face à l’environnement changer².

L’application du POS présentée ici n’est pas sans défis. La principale limite de ressusciter des stades dormants est le besoin d’équipement spécialisé pour l’échantillonnage. En outre, l’intégralité du processus de tamisage de sédiments à la mise en place de cultures clonales, nécessite un temps pratique considérable.

Certaines des étapes SOP présentées ici sont facilement transférables à d’autres espèces de Daphnia . Ce sont : échantillonnage, la création de lignées clonales et expérimental. Cependant, les autres étapes du POS peuvent doivent être optimisation adaptée à l’espèce à l’étude. Décapsulation est souvent appliquée aux échantillons de d. magna pour améliorer le taux d’éclosion. Toutefois, cette approche peut ne pas convenir pour les plus petits spécimens. L’éclosion des stimuli peut également varier parmi les espèces⁴⁸ et les spécimen conspécifiques⁴⁹. Par conséquent, une optimisation ad hoc les étapes de l’éclosion du POS peut être exigée avant la demande d’autres crustacés. Alors que le succès de l’éclosion de la population de d. magna ressuscité de lac anneau (30,5 % à travers les archives sédimentaires) s’inscrit dans précédents résultats⁴⁹, succès de l’éclosion varie en fonction de l’état de préservation des sédiments, les espèces ^50,51et l’origine géographique des sédiments⁴⁸. Les études futures sur les mécanismes qui régissent l’entrée et la progression à travers les phases de la diapause est nécessaire pour identifier des stimuli éclosion optimale adaptées aux différentes espèces.

Enfin, connaître le système d’étude de base, en particulier la présence de l’espèce d’intérêt au fil du temps, est recommandé. Ceci peut être réalisé par l’intermédiaire de documents historiques. Si n’existent pas de documents historiques, d’échantillonnage et de dépistage des couches superficielles des sédiments lac avant le prélèvement de base sont recommandé, même si elle peut fournir des informations uniquement sur l’histoire plus récente.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
sampling bags	Fisher Scientific	11542783	Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer	ENSIS ltd	na	Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale	Veritas-M124A	TLP-50	Analytical Balance
geological sieve	UKGE limited	SV7521	200 mm diameter geological sieve - 1 mm mesh
geological sieve	UKGE limited	SV7525	200 mm diameter geological sieve - 0.125 mm mesh
white sampling tray	nhbs	http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509	Standard mulipurpose lab trays
pasteur pipette	Globe Scientific inc.	138020B	Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw - 0.9mL
stereo microscope	nikon	smz800	Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish	EduLab	153-533	Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars	compak	Round Jam Jars 4oz	100 mL jars
glass jars	compak	Atum Jars/ Bonta Jar 10oz	200 mL jars
glass jars	bottlecompanysouth	500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid	500 mL jars
statistical software R	https://cran.r-project.org/	na	Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps	Fisher Scientific	41122405	Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software	https://imagej.nih.gov/ij/index.html	na	Open source ImageJ image processing toolkit  written in Java
mesocosm	amazon	na	Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes	Sigma_Aldrick - Merck	Z606340	premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance	Beckman Coulter	A48705	DNA extraction kit
size standard	Thermo Fisher Scientific	4322682	LIZ500 - Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer	ABI	na	Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing