In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

Zusammenfassung

Die Auswertung der Gewebeentwicklung in Fraktur Kallus während Endochondral Knochenheilung ist wichtig, den Heilungsprozess überwachen. Wir berichten hier, die Verwendung von einer Magnetresonanztomographie (MRT)-kompatibel Fixateur externe für die Maus Femur erlauben MRI scans während Knochenregeneration bei Mäusen.

Zusammenfassung

Endochondral Frakturheilung ist ein komplexer Prozess mit der Entwicklung von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus. Die Menge der verschiedenen Gewebe in der Kallus liefert wichtige Informationen über den Fortschritt der Frakturheilung. Verfügbar in Vivo Techniken, längs der Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Frakturheilung Studien mit kleinen Tieren zu überwachen sind digitale Radiographie und µCT-Bildgebung. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Infolgedessen ist es unmöglich, Knorpel aus fibrösem Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) anatomische Strukturen anhand des Wassergehaltes visualisiert und können daher möglicherweise nicht-invasiv Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren. Hier berichten wir über die Verwendung von ein MRI-kompatiblen Fixateur externe für die Maus Femur, MRI-Scans während Knochenregeneration bei Mäusen zu ermöglichen. Die Experimente zeigten, dass der Fixateur und eine maßgeschneiderte Montagevorrichtung repetitive MRT-Untersuchungen erlauben damit Längsschnittanalyse von Fraktur-Kallus Gewebeentwicklung.

Einleitung

Sekundäre Frakturheilung ist die häufigste Form der Knochenheilung. Es ist ein komplexer Prozess imitiert bestimmte Aspekte von ontogenic Endochondral Verknöcherung^1,2,3. Die frühen Fraktur Hämatom besteht überwiegend aus Immunzellen, Granulierung und Bindegewebe. Wenig Sauerstoff Spannung und biomechanischen Hochstämme Osteoblasten Differenzierung bei den Frakturspalt behindern, sondern fördern die Differenzierung von Vorläuferzellen in Chondrozyten^4,5,6. Diese Zellen beginnen sich zu vermehren sich an der Stelle der Verletzung eine knorpelige Matrix bietet Primärstabilität des gebrochenen Knochens zu bilden. Während der Reifung der Kallus, Chondrozyten, hypertrophe, werden unterziehen Apoptose oder Trans-Osteoblasten differenzieren. Neovaskularisation bei der Knorpel-Knochen-Übergangszone bietet erhöhten Sauerstoffgehalt, die Bildung von Knochengewebe⁷ermöglicht. Nach knöcherne Überbrückung der Frakturspalt, biomechanische Stabilität erhöht und osteoclastic Umbau der externen Fraktur Kallus auftritt, um physiologische Knochen Kontur und Struktur³zu gewinnen. Daher liefern die Mengen von faserigen, knorpeligen und knöchernen Gewebe in der Fraktur Kallus wichtige Informationen über die Knochenheilung Prozess. Gestörte oder verzögerte Heilung wird sichtbar durch Veränderungen der Hornhaut Gewebeentwicklung sowohl bei Menschen und Mäusen^8,9,10,11. Verfügbar in Vivo Techniken zur Längsrichtung Kallus Gewebeentwicklung in präklinischen Studien mit kleinen Tieren der Frakturheilung überwachen gehören digitale Radiographie und µCT imaging-^12,13. Beide Techniken sind jedoch nur in der Lage, zwischen mineralisierten und nicht mineralisierten Gewebe zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu MRT bietet ausgezeichneten Weichgewebe Kontrast und kann daher möglicherweise Weichgewebe und Knorpel in der Fraktur Kallus zu identifizieren.

Bisherige Arbeit zeigte vielversprechende Ergebnisse für Postmortem MRI bei Mäusen mit¹⁴ und in Vivo MRT artikuläre Frakturen bei Mäusen während intramembranous Knochendefekt heilende¹⁵. Beide Studien gaben auch begrenzte räumliche Auflösung und Gewebe-Kontrast. Wir zeigten zuvor die Machbarkeit der hochauflösenden in Vivo MRT für längs-Beurteilung der weichen Kallus-Bildung während der murinen Endochondral Frakturheilung¹⁶. Hier berichten wir über das Protokoll für die Verwendung eines MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie bei Mäusen um Kallus Gewebeentwicklung längs während der Endochondral Frakturheilung Prozess zu überwachen. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans.

Protokoll

alle Tier Experimente internationale Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten und wurden von den regionalen Regulierungsbehörden (Nr. 1250, Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland) genehmigt. Alle Mäuse waren gepflegt in Gruppen von zwei bis fünf Tiere pro Käfig auf einem 14 h Licht, 10 h dunkel zirkadianen Rhythmus mit Wasser und Nahrung zur Verfügung gestellt Ad Libitum.

1. Vorbereitung der chirurgisches Material und Vorbehandlung der Mäuse

1. alle chirurgischen Sterilisation Material. Verwenden Sie eine Autoklavierung Temperatur von 120-135 ° C für 20-30 min Sterilisation Zeit.
2. Kauf C57BL/6 Mäusen oder Mäuse aus einem anderen Stamm, die zwischen 19-35 g Körpergewicht. Folgen Sie den entsprechenden Tierpflege und experimentelle Protokolle nach nationalen Richtlinien, die vom Prüfer zugelassen ist ' s institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss. Rechnen Sie mit mindestens 7 Tage Eingewöhnungszeit vor Beginn des Verfahrens.
3. Bieten Analgesie für alle Mäuse über das Trinkwasser einen Tag vor der Operation bis zu dem dritten postoperativen Tag.

2. Chirurgische Verfahren und Anwendung der Fixateur externe

1. statt die Maus in ein Rohr mit 5-7 % Isofluran und 60 mL/min Sauerstoff vorinstalliert. Entfernen Sie nach Verlust der posturalen Reflexe die Maus aus der Narkose Induktion Tube und Aufrechterhaltung der Narkose über eine Bereitstellung von 1-3 % Isofluran und 60 mL/min Sauerstoff Inhalationsmaske.
   1. Monitor die Atmung Muster und Hind Pfote Reflex während der Narkose. Sicherzustellen, dass die Atemfrequenz liegt bei rund 100 Zyklen/Min. und der Hinterpfote Reflex fehlt.
      ​ Hinweis: die Menge des Gases notwendig ist abhängig von Alter, Geschlecht, Körpergewicht und Belastung der Maus.
2. Vor der Operation, Spritzen die Maus subkutan mit einer Einzeldosis von Antibiotika (Clindamycin, 45 mg/kg). Darüber hinaus für die Aufrechterhaltung der physiologischen Flüssigkeitsbilanz, Spritzen die Maus mit einer subkutanen Flüssigkeit Depot 500 µL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
3. Hornhaut zu verhindern Trocknung, gelten Augensalbe für die Maus-Augen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während der Narkose und chirurgischer Eingriff weiterhin physiologische Körpertemperatur.
4. Entfernen Sie das Fell aus der richtigen Hind Gliedmaßen und schrubben den OP-Bereich mit einem alkoholhaltigen Desinfektionsmittel. Abdecken der rechten Hinterpfote mit einem kleinen Teil eines sterilen Handschuh unsterilen Bereich zu vermeiden. Desinfizieren Sie die richtigen Hind Gliedmaßen dreimal. Legen Sie ein steriles Tuch über die ganze Maus mit Ausnahme der Operationsbereich.
5. Einschneiden die Haut ca. 1 cm längs entlang der vorderen Seite des rechten Oberschenkel mit einem Skalpell. Trennen Sie unverblümt M. Biceps Femoris und M. Vastus Lateralis mit Mikro Scheren und Pinzetten. Schnittseite der Sehne Herkunft am Femur Trochanter mit einer Mikro Schere ermöglicht freien Zugang zu den anterolateralen Teil des Knochens. Stellen Sie sicher, dass der Ischiasnerv beibehalten wird.
6. Position der Fixateur externe (axiale Steifigkeit von 3 N/mm, Abbildung 1 A) parallel zum Femur. Manuell Bohren Sie die durch Cortex mit einem 0,45-mm-Bohrer und legen Sie die Keramik Montage Stifte in die Bohrungen. Beginnen Sie mit die meisten proximalen Pin, gefolgt von der distalsten Pin und die beiden Stifte in-between.
   1. Stellen sicher, dass es keine Spannung, Kompression oder Schubspannung auf der Fixateur während der Montage-Verfahren, sonst wird die erreichte Osteotomie Lücke nicht durch Entspannung des Fixateurs ausreichen.
7. Befeuchten die Knochen mit einer kleinen Menge des sterilen NaCl um Dehydrierung bei der Sägen zu vermeiden.
8. Erstellen eine 0,4-mm-Osteotomie durch den gesamten Knochen zwischen den beiden inneren Pins mit einem 0,4 mm Gigli Seilsäge.
   Hinweis: Optional kann eine oszillierende Mikro-Säge verwendet werden um die Osteotomie zu erstellen. Achten Sie darauf, Metallspäne von der Säge im Bereich Osteotomie zu vermeiden.
9. Spülen die Osteotomie Lücke vorsichtig mit 2 mL sterile NaCl Knochenchips zwischen zwei gebrochenen Cortex entfernen.
10. Anpassung der Muskeln durch die Verwendung einer kontinuierlichen Naht mit einer resorbierbaren Naht (siehe Tabelle der Materialien). Passen Sie dann die Haut mithilfe von unterbrochenen nicht resorbierbaren Fäden (siehe Tabelle der Materialien). Um zu vermeiden, Wunde zu beißen, stellen Sie nicht die Naht am kranialen Teil der Wunde.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht Hautkleber oder Clips da Mäuse in der Regel es aus der Wunde verursachen entfernen weitere Schäden an der Haut.
11. Der OP-Bereich mit einem Desinfektionsmittel zu reinigen und platzieren Sie den Mauszeiger in seinen Käfig. Monitor Maus und Versorgung ausreichend Wärme (z.B. durch Infrarot-Licht) bis es vollständig wach ist. Wasser, Nahrungsaufnahme und Körpergewicht nach der Operation zu überwachen Stellen Sie sicher, dass das Tier nicht in Schmerz und Leid ist. Alle Mäuse über das Trinkwasser erst am dritten postoperativen Analgesie gewähren.
    Hinweis: Mäuse können in Gruppen von bis zu vier Tiere untergebracht werden.
12. Überwachen die Maus ' s Aktivität auf 1 bis 5 Tage nach der Operation. Im Laufe dieser Zeit sollte die Maus auf der operierten Extremität tragen. Andernfalls muss die Maus von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.

3. MRT-Verfahren und Bildanalyse

1. vor der MRI Scan-Verfahren, betäuben die Maus nach dem Protokoll in Schritte 2.1 und 2.3, und halten Sie die Atemfrequenz rund 100 Zyklen/min. der Fixateur externe an das richtige Hind Glied des Einfügen der Maus vorsichtig in eine maßgefertigte Halterung ( Abbildung 1 B, C).
   1. Achten Sie darauf, verbiegen oder Kompression des Fixateurs während dieses Schrittes zu vermeiden, da dies Frakturheilung behindern kann.
      Hinweis: Die MRT-Untersuchungen durchgeführt werden so früh wie 3 Tage nach der Operation, abhängig von der Pflege der Tiere und experimentelles Protokoll.
2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine temperaturgeregelte Wiege für Einführung in das MRT-Gerät. Anbringen der Halterung starr an der vier-Elemente-Kopf Spule.
3. Erwerben MRT-Daten über eine dedizierte Hochfeld-klein-Tier-MRT-System mit 11,7 T.
   ​ Hinweis: die MRI Daten Erwerb Geometrie orientiert sich mit dem Oberschenkelknochen, orthogonal zu den Schrauben.
   1. Erfassen Daten durch die Anwendung einer Proton-Dichte Fett unterdrückt Mehrschicht TSE Sequenz (PD-TSE) mit Aufnahmeparameter: Echo/Wiederholung Zeit TE = 5,8 ms/TR = 2.500 ms, Auflösung Δr = 52 × 52 × 350 µm³, Field of View (FOV) = 20 × 20 mm ² und Bandbreite Δω = 150 KHz.
   2. Hinweis: die gesamte Akquisition 22 Scheiben dauert 36 min.
4. Die erfassten Daten mit Bildanalyse-Software zu öffnen. Geben Sie die Voxel-Größe als 0,05 x 0,05 x 0,35 mm ³. Die verschiedenen Geweben in der Fraktur Kallus (Knochen, Knorpel, faserigen Gewebe/Knochenmark) anhand ihrer Intensität mit halbautomatischen Schnittstellenüberwachung wie folgt zu segmentieren.
   1. Klicken Sie auf die " neue Label-Feld bearbeiten ", klicken Sie " hinzufügen Material ", und benennen Sie das Material zur " Kallus ". Das umliegende Gewebe, basierend auf der Hypo-intensiven Signal aus dem Periost mit Kallus Bereich unterscheiden die " Lasso " Tool.
   2. Klicken Sie " Material hinzufügen ". Klicken Sie " hinzufügen Material " und benennen Sie das Material zur " Knorpel ". Segment den Knorpel durch die Verwendung der " Schwelle " Werkzeug und " wählen Sie nur aktuelle Material " aus " Kallus ". Klicken Sie " Knorpel " und " Material hinzufügen ". Wiederholen Sie diese Schritte mit " Knochen " und " Knochenmark/Bindegewebe ".
5. 3D-Rekonstruktionen der gebrochenen Oberschenkelknochen, basierend auf dem Gewebe Segmentierungsdaten mit Bildanalyse-Software zu generieren. Klicken Sie " erzeugen Oberfläche ", gelten " keine " für " glätten Typ " und klicken Sie auf " Oberfläche Ansicht ".
   Hinweis: Sehr klein, hyper-intensive Bereiche rund um die EnDS der gebrochenen Cortex dürften Artefakte aufgrund des Übergangs von knöchernen, weiches Gewebe. Diese Bereiche sollten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Hyper-intensive Bereiche in der Mitte der Fraktur Kallus in der Endochondral Phase der Frakturheilung knorpelige Gewebe darstellen. Hypo-intensiv bei der Fraktur distale Kallus aus der Osteotomie Lücke in der Phase der Endochondral Verknöcherung und Bereichen mit der gleichen Intensität während der ganze Bruch Kallus bei später Heilung Stadien vertreten neu gebildeten knöchernen Kallus Gewebe. Obwohl diese Bereiche ein Hypo-intensiven Signal haben, ist die Signalintensität aus reifen Knochen (Kortex) sogar noch niedriger. Markieren Sie nach Schwellwerte die Signalintensität für Knochengewebe und knorpeligen Gewebe in der Fraktur Kallus das restliche Gewebe wie Knochenmark und Bindegewebe. Werte für Gewebe Segmentierung sind: Knochengewebe (einschließlich Reife Cortex, trabekulären Knochen und Gewebe knöchernen Kallus) ist im Bereich von 1-3.3 (normalisierte Signalintensität Reife Kortex), Knochenmark/Bindegewebe im Bereich von 3,4-5,4, segmentiert und knorpelige Kallus Gewebe im Bereich von 5,5-6,2.
6. Wiederholen Sie bei Bedarf die MRT-Untersuchung längs während der Frakturheilung Prozess. Knorpelige Kallus Entwicklung zu verfolgen, die Mäuse auf 10, 14 und 21 Tage nach der Operation zu scannen.
   Hinweis: Die Zeitpunkte können hängen von der Pflege der Tiere und experimentelles Protokoll.

Ergebnisse

Erstens kann der Erfolg des chirurgischen Eingriffs durch Analyse von MRT-Untersuchungen bestätigt werden (siehe Beispiel in Abbildung 2). Alle vier Pins sollte in der Mitte der femoral Welle befinden. Die Größe der Lücke Osteotomie sollte zwischen 0,3-0,5 mm. Wenn die Größe der Osteotomie Lücke stark von diesen Werten variiert, sollte die Maus von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Zweiten...

Diskussion

Modifikationen und Fehlerbehebung:

Das Hauptziel dieser Studie war es, ein Protokoll für die Verwendung von einem MRI-kompatible externe Fixateur für Femur Osteotomie in der Maus mit der Fähigkeit, Kallus Gewebeentwicklung längs während des Endochondral Frakturheilung Prozesses überwachen zu beschreiben. Das Design der eine maßgeschneiderte Halterung zum Einschieben der Fixateur externe gewährleistet eine einheitliche Position während der wiederholten Scans. Halbautom...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia tube	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-ANA-TUB-Mouse
Anaesthetic machine	FMI, Seeheim, Germany	ZUA-82-GME-MA
Artery forceps	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH104R
Autoclave	Systec, Wettenberg, Germany	DX-150
Autoclaving packaging	Stericlin, Feuchtwangen, Germany	2301-04/06/10/12/16
Avizo software	FEI, Burlington, USA	-	Version 8.0.1
BioSpec 117/16 magnetic resonance imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany	117/16
Bulldog clamp	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BH 021R
Carbon steel scalpel no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BA211/215
Ceramic mounting pin 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS691490
Clindamycin (300 mg / 2ml)	Ratiopharm, Ulm, Germany	-
Dressing forceps 115 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD210R
Dressing forceps 130 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD025R
Drill bit coated 0.45 mm	RISystem, Davos, Switzerland	HS820420
Durogrip needle holder 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BM024R
Foliodrape	Hartmann, Heidenheim, Germany	2513026
Frekaderm	Fresenius, Bad Homburg, Germany	4928211
Gigli saw 0.44 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.590.110.25
Hand drill	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.390.130-01
Heating plate	FMI, Seeheim, Germany	IOW-3704
Hygonorm gloves	Hygi, Telgte, Germany	2706
Isoflurane	Abbot, London, UK	Forene
Micro forceps 155 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BD343R
Micro scissors 120 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	FD013R
Mouse FixEx L 0.7 mm	RISystem, Davos, Switzerland	RIS.611.300-10
Needle case for drills	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BL911R
Needle holder	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB078R
Octenisept	Schülke, Norderstedt, Germany	121403
Osirix software	Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland	-	Version 4.0
Oxygen, medical grade	MTI, Ulm, Germany	-
Resolon 5/0	Resorba, Nürnberg, Germany	88143
Saline 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	3570350
Scalpel handle 125 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB073R
Scissors 150 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BC006R
Sealer for autoclave packaging	Hawo GmbH, Obrigheim, Germany	HM500
Sterican 27 G	Braun, Melsungen, Germany	4657705
Sterile surgical blades no. 11/15	Aesculap, Tuttlingen, Germany	BB511/515
Surgical gloves	Hartmann, Heidenheim, Germany	Peha-micron 9425712
Surgical light	Maquet SA, Ardon, France	Blue line 80
Syringes 5 ml	Braun, Melsungen, Germany	Injekt 4606051V
Tissue forceps 80 mm	Aesculap, Tuttlingen, Germany	OC091R
Tramadol 25 mg/l	Grünenthal, Aachen, Germany	100mg/ml
Vasofix Safety	Braun, Melsungen, Germany	4268113S-01
Vicryl 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	V30371
Visdisic eye ointment	Bausch & Lomb, Berlin, Germany	3099559