Method Article
Wir beschreiben eine Methode zur Synthese von biokompatibler 10 nm gold-Nanopartikeln, durch Beschichtung Poly-Ethylen Glykol auf die Oberfläche funktionalisiert. Diese Partikel können gebrauchte in Vitro und in Vivo für die Bereitstellung von Therapeutika zu nanoskaligen zellulären und extrazellulären Räumen, die schwer zugänglichen mit konventionellen Nanopartikel Größen sind.
Gold-Nanopartikel (AuNPs) wurden ausgiebig in der medizinischen Forschung aufgrund ihrer Größe, Biokompatibilität und veränderbare Oberfläche verwendet. Targeting und Droge Lieferung sind nur einige der Anwendungen von diesen AuNPs, aber endotheliale extrazellulären Matrizen defensive Eigenschaften behindern Partikel Aufnahme. Um dieses Problem zu beheben, beschreiben wir eine Synthese-Methode für ultrasmall gold-Nanopartikeln, vaskuläre Lieferung mit anpassbaren Funktionsgruppen und Polymer-Längen für weitere Anpassungen zu verbessern. Das Protokoll Erträge 2,5 nm AuNPs, die mit Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC) begrenzt sind. Die Ersetzung von THPC durch Hetero-funktionale Polyethylenglykol (PEG) auf der Oberfläche der AuNP erhöht den hydrodynamischen Radius um 10,5 nm bei verschiedenen funktionellen Gruppen auf der Oberfläche. Der letzte Teil des Protokolls enthält eine optionale Ergänzung der Fluorophor erlauben die AuNPs unter Fluoreszenz Nanopartikel Aufnahme verfolgen visualisiert werden. Dialyse und Lyophilisation wurden verwendet, um zu reinigen und die AuNPs zu isolieren. Diese fluoreszierende Nanopartikel visualisiert werden in in Vitro und in Vivo Experimente aufgrund der biokompatiblen PEG Beschichtungs- und fluoreszierende Sonden. Darüber hinaus der Größenbereich dieser Nanopartikel machen sie einen idealen Kandidat für das Prüfen der Glycocalyx ohne Unterbrechung der normalen Gefäßsystem Funktion, verbesserte Bereitstellung und Therapeutika führen.
Nanopartikel sind angewendet worden, Drug-Delivery und Bildgebung für seine Fähigkeit zum Navigieren durch den Körper, Zielgebiete von Interesse1,2zu erreichen. Die Partikel können innerhalb von Tumoren über das undichte Gefäßsystem ansammeln oder lokalisieren, wo ein Ziel-Liganden überexprimiert und ausgesetzt ist. Gold, geworden speziell, eine häufig verwendete Nanopartikel Material aufgrund seiner einzigartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften, die den Transport und die Veröffentlichung von Therapeutika3betreffen. Gold ist eine effektive Nanopartikel Material, weil seine Oberfläche geändert werden kann, um an Thiole zu binden und hat hohe Biokompatibilität aufgrund seiner geringen Toxizität4. AuNPs sind in der Lage, Träger des großen biomolekularen Drogen und erfolgreich gewesen bei der Bereitstellung von Peptide, Nukleinsäuren und Proteine, so dass AuNPs günstig für2,4-targeting.
Leider wurde Nanopartikel Drug Delivery Wirksamkeit durch die negativ geladenen Glycocalyx behindert die das extrazelluläre Fell auf der Membran der meisten Säugerzellen und Porengrößen von bis zu 7 nm5,6. Diese Porengröße ist kleiner als die meisten Nanopartikel Medikament Fluggesellschaften, die typische Durchmesser von 50-200 nm bis hin zu haben. Unter Erkrankungen werden diese Glycocalyx Poren größer durch Abbau, Erhöhung der Durchlässigkeit durch den endothelial Zellen. Die meisten Nanopartikel sind jedoch immer noch zu groß für diesen Strukturwandel in der Glycocalyx nutzen. Eine Implikation von diesem Größenfehlanpassung ist, dass konventionell große Partikel nicht günstig mit endothelial Zellen, die Blutgefäße säumen interagieren. Dies wirkt sich auf die Lieferung von intravenös verabreichten Partikel in das Endothel, und sagte auch der Teilchentransport durch den Blut Gehirn Barriere7,8,9,10.
Ein Ansatz, um dieses Problem zu bekämpfen ist, kleinere Partikel durchlaufen die kleinen Poren in der Glycocalyx verwenden. Hier, synthetisieren wir 10,5 nm ultrasmall gold Nanopartikel, die normalerweise durch intakte, gesunde Glycocalyx abgehalten werden sollte. Sobald der Glycocalyx beginnt, kompromittiert zu werden, sollte die Nanopartikel die Zellen durch die zunehmende Porengröße leicht eindringen. Das Protokoll in diesem Whitepaper beschreibt eine Synthese aus ultrasmall gold Kern mit PEG, das erhöht der Biokompatibilität und verringert die systemische Clearance4beschichtet. Die PEG kann auch mehrere Arten von funktionellen Gruppen enthalten öffnen Wege für die Konjugation des Zielens Liganden, Fluorophore und Therapeutika. Zuvor zeigen veröffentlichten Ergebnisse, dass diese ultrasmall Nanopartikel sind in der Regel günstiger in Regionen der gestörten Endothelfunktion Glycocalyx Funktion auch ohne jede aktive Ausrichtung auf4,11aufgegriffen werden. Dies zeigt die Machbarkeit und die Bedeutung der Verwendung von Partikeln der richtigen Größe für Lieferung Anwendungen. Das folgende Protokoll stellt die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von PEG-beschichtete AuNPs (PEG-AuNP), mit der Diskussion für die Anpassung der funktionellen Gruppen und Konjugationen für andere Anwendungen.
1. Vorbereitung oder Beschaffung von Stammlösungen (bei Raumtemperatur gelagert werden oder eingefroren bis zur Verwendung)
(2) Synthese der Gold-Nanopartikel-Kerne
(3) Zugabe von Polymer Korona um die Gold-Nanopartikel
4. Konjugation Fluorophore mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester auf NH2 Gruppen auf die PEG-AuNP
5. Charakterisierung von fluoreszierenden pegylierten Gold-Nanopartikeln
Die synthetisierte AuNPs, beschichtet mit THPC oder PEG (Abbildung 1A und Abbildung 1 b, beziehungsweise), werden mit TEM und die Partikel Größen gemessen werden, mit dem TEM und DLS zur Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Nanopartikel Größenverteilung abgebildet. Abbildung 2 zeigt die TEM-Bild einer THPC-AuNP-Probe bei 80 kV und 150.000 X Vergrößerung. Die Durchmesser der THPC-AuNP Partikel reichen von 2 bis 3 nm, basierend auf der Kalibrierung Bar in TEM Bilder. Dieser THPC-AuNP Größe zeigt sich auch in der DLS Größe Messung Histogramm in Abbildung 2dargestellt, in denen die THPC beschichtet AuNP erweist sich haben einen Spitzenwert bei 2,5 nm. Pegylierung ist nicht unter TEM sichtbar, da die Polymere nicht ELEKTRON Dichte sind. TEM Bildgebung von PEG-AuNP Proben bestätigt einfach das Vorhandensein einzelner dispergierten Partikel, die erwartet wird, weil die PEG Polymer Korona um die Nanopartikel Hilfe bei der Prävention der Aggregation. Für diese Beispiele PEG-AuNP das DLS Größe Messung Histogramm zeigt eine Verschiebung in der Spitze um rund 10,5 nm auf der DLS. Anhängen von weiteren Liganden oder Drogen auf funktionelle Gruppen wirken sich auf die Größe der Nanopartikel sowie und sollte in Betracht gezogen werden, wenn den Durchmesser messen.
Das Fluorophor hinzufügen (Abbildung 1) bestätigt mit einem Fluorometer, um Fluoreszenzsignal aus einer Stichprobe von Nanopartikeln, zu messen, wie in Abbildung 3dargestellt. Bei Erregung mit einer Wellenlänge von 633 nm, die Emission wird gemessen, um ein Maximum zwischen 660 und 672 nm haben die Produktinformationen des Herstellers der maximalen Emission bei 665 passt nm. Befestigung der anderen fluoreszierenden Sonden sollte in ähnlicher Weise fluoreszierende Antwort darauf überprüft werden.
Die Biokompatibilität der Partikel und damit verbundenen Zellviabilität sind anhand der MTS-Assay, relative Zellstoffwechsel der MTS nach 16 h Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der Nanopartikel zu überprüfen. Das Fluorophor konjugierte PEGylated AuNPs zeigt keine signifikante Toxizität durch die ähnliche Niveaus der Zellviabilität bei allen Konzentrationen bis zu 1 mg/mL (Abbildung 4A) angezeigt. Diese Biokompatibilität variieren abhängig von den therapeutischen oder Liganden befestigt, die verbleibenden Funktionsgruppen, die Partikel noch weiter anpassen. Droge-Anlagen sind in der Regel Toxizität erhöhen, aber abhängig von den Konzentrationen arbeiten, es kann keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit in signifikanter Weise.
Aufnahme von Leuchtstofflampen, PEGylated AuNPs (Abbildung 1) von adhärenten Zellen wird anhand kultivierte Ratte Fettlappen Endothelzellen, mit intakter oder dysfunktionalen Glycocalyx (Abbildung 4 b). Die dysfunktionalen Glycocalyx Bedingungen werden durch Hinzufügen von Heparinase III Enzym zur Kultur, was zu einer Verschlechterung der Heparan Sulfat Glycocalyx Komponente und gefährden die Matrix12erreicht. Abbildung 4 b zeigt die verschiedenen Stufen der Aufnahme von PEG-AuNPs, als rote Punkte auf die Querschnittansicht der repräsentativen Endothelzellen. Eine gesunde Glycocalyx schreckt Aufnahme von diesen gold-Nanopartikeln, aber eine deutliche Erhöhung der wird beobachtet, wenn das Enzym beschäftigt11ist. Dieses Ergebnis zeigt das Potenzial dieser ultrasmall Nanopartikel Therapeutika, Endothelzellen in gewissem Sinne gesteuert durch verschiedene Wechselwirkungen, die auf Glycocalyx Gesundheit anzubieten.
Abbildung 1: Gold-Nanopartikel-Schaltpläne. (A) THPC beschichtete AuNP Nanosphere vor PEG-Ersatz. (B) PEGylated AuNP mit 3 Arten von PEG Kündigungen, einschließlich COOH, NH2und CH3. Blaue Wellen stehen für das Polymer. (C) konjugiert Nanopartikel für die Fluoreszenz-Bildgebung. Rote Sterne zeigen die Fluorophore, NH2 Funktionsgruppen konjugiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Größe Messungen von gold-Nanopartikeln. Links: TEM von gold-Nanopartikeln vor der Zugabe von PEG bei 80 kV und 150.000 X Vergrößerung mit Maßstabsleiste gezeigt. Rechts: Histogramm die Nanopartikelgröße gemessen von DLS vor (AuNP) und nach (PEG-AuNP) der THPC Austausch mit PEG. Die DLS-Ergebnisse für THPC-beschichtete AuNP quantifizieren, was durch TEM visualisiert wird. Die DLS-PEG-beschichtete AuNP Ergebnisse überwinden die Herausforderung, die Unfähigkeit, PEG durch TEM aufgrund nicht sein Elektron Dichte Polymere zu visualisieren. Ein TEM PEG-AuNP zeigt nur den Kern gold-Nanopartikel und wird gleich aussehen wie ein THPC-capped AuNP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Fluoreszenz-Daten von den fluoreszierenden PEG-AuNP. Die Fluoreszenz-Spitze bei 667 nm-Spiele, die die Emission von der Fluorophor, PEG-AuNP konjugiert. AE: willkürliche Einheiten.
Abbildung 4: Zell-Interaktionen mit dem fluoreszierenden PEG-AuNP. (A) Zelle Lebensfähigkeit (MTS Stoffwechsel) Grundstück für Ratte Fett pad Endothelzellen nach 16 h Co Inkubation mit fluoreszierenden PEG-AuNP. (B) konfokale Schnittbilder von festen Ratte Fett Polstern endotheliale Zellen befleckt mit DAPI für die Zellkerne (blau) und Antikörper gegen Heparan Sulfat, eine Glycocalyx-Komponente (grün). Obere Bild ist eine gesunde Glycocalyx und unten befindet sich eine Schicht von degradierten Glycocalyx; Es gibt deutlich mehr rote Fluoreszenz von Nanopartikeln in der Probe mit degradierten Glycocalyx. Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Diese Technik ist eine wirksame Methode zur Synthese anpassbar, ultrasmall PEG AuNPs beschichtet. Ein wichtiger Teil dieses Verfahrens ist, dass die erste Bildung von THPC Gold gekappt, die Nanopartikel, die durch den Farbumschlag von gelb bis braun, die bestätigt werden kann auftreten wird, nachdem der Inhalt in den Rundboden-Kolben (Protokoll Schritt 2.3) HAuCl4 hinzugefügt wurde. Keine Farbänderung angibt, dass es keine Nanopartikel gebildet gibt und die ersten Schritte sollten überprüft und, bevor Sie fortfahren wiederholt. Im Fall, die, den die Farbe ändert sich auf etwas anderes als braun wie weinrot oder grau, die entstehenden Partikel werden sich wahrscheinlich nicht um das Ziel 2,5 nm und eine neue Charge sollte auch gemacht werden.
Nach der Bildung der gold Kern der Austausch von THPC für PEG und die Reinigung Verfahren enthalten mehrere wichtige Schritte für den erfolgreichen Abschluss des Protokolls. Mischen über Nacht ermöglicht die Ersatz-Reaktion, bis zur Fertigstellung zu gehen. Gescheiterte Reinigung könnte auftreten, wenn die Dialyse Wasser nicht mit der vorgeschriebenen Frequenz geändert wird. Aggregation und Niederschlag der Partikel können auch auftreten, wenn die Partikel in der Dialyse für mehr als 72 h gelassen werden. Andere potenzielle Probleme konnte während der Gefriertrocknung beobachtet werden. Wenn die ultrasmall PEG AuNP beschichtet Lösung nicht vollständig gefroren war oder der Gefriertrockner nicht richtig eingerichtet wurde, können Proben verloren gehen. Finden Sie im Gefriertrockner Handbuch, da einige Geräte unterschiedlichen Vorbereitungen erfordern.
Die Leichtigkeit der Synthese und die Biokompatibilität der resultierende Partikel stellen Vorteile für die Verwendung dieser PEG-AuNPs. Diese Nanopartikel haben darüber hinaus den Vorteil, mit nanoskaligen Zellstrukturen zu interagieren, wie gezeigt durch die Fähigkeit, degradierten Glycocalyx durch Aufnahme von diesen Nanopartikeln zu identifizieren zu können. Dieser Vorteil kann für die Entwicklung neuer Therapien Atherosklerose und vorbeugende Maßnahmen genutzt werden. Darüber hinaus, was wir hier, ein weiterer Vorteil dieses Protokolls präsentieren ist, dass es ermöglicht umfangreiche Anpassungen der Partikel sowie erhöhte Stabilität und Speichermöglichkeiten durch das Anbringen von Thiol mit PEG auf der gold-Nanopartikel-4. Das andere Ende der PEG-Kette kann eine funktionelle Gruppe enthalten, und eine Vielzahl von Molekülen kann zu diesen Gruppen konjugiert werden. In diesem Protokoll werden alle drei gemeinsame Funktionsgruppen angebracht (Methyl, Carboxylgruppen, und Aminosäuren). Das Verhältnis des Stiftes ist gewählt, Fluoreszenz-Detektion zuerst zu priorisieren, dann die Möglichkeit, eine sekundäre targeting Abstimmungsunterlagen mit der Carbonsäure-Gruppe zu integrieren. Die Verhältnisse dieser Gruppen können optimiert werden, abhängig von der Anwendung und die Längen und Formen der Polymere können auch angepasst werden.
Zur Messung der Partikel Aufnahme konjugiert wir eine fluoreszierende Sonde eines funktionellen Gruppen. Es sei darauf hingewiesen, dass jede Konjugation über was wir beschrieben haben eine Veränderung von Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel führen wird. Jede Iteration der Nanopartikel im Hinblick auf zusätzliche Komponenten und Konjugation Reaktionen sollten für die gewünschten Eigenschaften getestet werden.
Diese Methode erzeugt ultrasmall goldene-Nanopartikeln bestimmt die defensive Eigenschaften der endothelialen extrazellulären Glycocalyx zu überwinden, die Aufnahme von konventionell Größe Nanopartikeln behindert. Die geringe Größe verleiht jedoch Schwierigkeiten bei der Bildgebung und der Droge laden Aspekt. Diese Partikel sind deutlich kleiner als die typischen Nanopartikel Größenbereich, und infolgedessen ist die Fläche für Anlagen von Therapeutika und targeting Moieties stark zurückgegangen. Dies führt zu Schwierigkeiten Abholung Einzelsignale in imaging-Anwendungen, obwohl Cluster von Teilchen noch leicht identifiziert werden können, wie in der konfokalen Bilder gezeigt. Die reduzierte Oberfläche für Anlagen des Zielens Liganden und Therapie erfordern mehr Partikel verabreicht werden, um Dosierungsanforderungen Ziel zu erreichen. Allerdings werden die kleineren Teilchen effizienter im Lieferumfang, wenn unter Berücksichtigung der Glycocalyx.
Diese neuartige ultrasmall Partikel sind in der Lage, Lieferung in schwer zugänglichen nanoskaligen Bereichen innerhalb des Körpers mit minimaler Unterbrechung der Mikroumgebung. Die Zugabe des Stiftes ermöglicht erhöhte Biokompatibilität und Funktionsgruppen für schwere Anpassung der Partikel für verschiedenste Anwendungen bietet. Die geringere Größe im Vergleich zu typischen Nanopartikel verfügt über einige Mängel, aber wenn strategisch entwickelt, das ultrasmall Teilchen ist ein vielversprechender Ansatz zur Unterbringung von schwer zu durchdringen, komplizierte und empfindliche Glycocalyx im Kreislauf Targeting und Droge Lieferung.
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Diese Arbeit von der Northeastern University Chemical Engineering-Abteilung unterstützt wurde, gewähren Startkapital und ein Tier 1 Pilot Study-Stipendium von der Northeastern University Provost Office, NIH K01 HL125499 und NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Die Autoren möchten auch danke Thomas J. Webster und seinem Labor für ihre Unterstützung sowie der Nanomedizin Wissenschaft und Technology Center und pharmazeutische Wissenschaften-Abteilung an der Northeastern University.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |
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