Synthese von funktionalisierten 10 nm Polymer beschichteten Goldpartikeln für Targeting Endothel und Drug-Delivery

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Synthese von biokompatibler 10 nm gold-Nanopartikeln, durch Beschichtung Poly-Ethylen Glykol auf die Oberfläche funktionalisiert. Diese Partikel können gebrauchte in Vitro und in Vivo für die Bereitstellung von Therapeutika zu nanoskaligen zellulären und extrazellulären Räumen, die schwer zugänglichen mit konventionellen Nanopartikel Größen sind.

Zusammenfassung

Gold-Nanopartikel (AuNPs) wurden ausgiebig in der medizinischen Forschung aufgrund ihrer Größe, Biokompatibilität und veränderbare Oberfläche verwendet. Targeting und Droge Lieferung sind nur einige der Anwendungen von diesen AuNPs, aber endotheliale extrazellulären Matrizen defensive Eigenschaften behindern Partikel Aufnahme. Um dieses Problem zu beheben, beschreiben wir eine Synthese-Methode für ultrasmall gold-Nanopartikeln, vaskuläre Lieferung mit anpassbaren Funktionsgruppen und Polymer-Längen für weitere Anpassungen zu verbessern. Das Protokoll Erträge 2,5 nm AuNPs, die mit Tetrakis (Hydroxymethyl) Phosphonium-Chlorid (THPC) begrenzt sind. Die Ersetzung von THPC durch Hetero-funktionale Polyethylenglykol (PEG) auf der Oberfläche der AuNP erhöht den hydrodynamischen Radius um 10,5 nm bei verschiedenen funktionellen Gruppen auf der Oberfläche. Der letzte Teil des Protokolls enthält eine optionale Ergänzung der Fluorophor erlauben die AuNPs unter Fluoreszenz Nanopartikel Aufnahme verfolgen visualisiert werden. Dialyse und Lyophilisation wurden verwendet, um zu reinigen und die AuNPs zu isolieren. Diese fluoreszierende Nanopartikel visualisiert werden in in Vitro und in Vivo Experimente aufgrund der biokompatiblen PEG Beschichtungs- und fluoreszierende Sonden. Darüber hinaus der Größenbereich dieser Nanopartikel machen sie einen idealen Kandidat für das Prüfen der Glycocalyx ohne Unterbrechung der normalen Gefäßsystem Funktion, verbesserte Bereitstellung und Therapeutika führen.

Einleitung

Nanopartikel sind angewendet worden, Drug-Delivery und Bildgebung für seine Fähigkeit zum Navigieren durch den Körper, Zielgebiete von Interesse^1,2zu erreichen. Die Partikel können innerhalb von Tumoren über das undichte Gefäßsystem ansammeln oder lokalisieren, wo ein Ziel-Liganden überexprimiert und ausgesetzt ist. Gold, geworden speziell, eine häufig verwendete Nanopartikel Material aufgrund seiner einzigartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften, die den Transport und die Veröffentlichung von Therapeutika³betreffen. Gold ist eine effektive Nanopartikel Material, weil seine Oberfläche geändert werden kann, um an Thiole zu binden und hat hohe Biokompatibilität aufgrund seiner geringen Toxizität⁴. AuNPs sind in der Lage, Träger des großen biomolekularen Drogen und erfolgreich gewesen bei der Bereitstellung von Peptide, Nukleinsäuren und Proteine, so dass AuNPs günstig für^2,4-targeting.

Leider wurde Nanopartikel Drug Delivery Wirksamkeit durch die negativ geladenen Glycocalyx behindert die das extrazelluläre Fell auf der Membran der meisten Säugerzellen und Porengrößen von bis zu 7 nm^5,6. Diese Porengröße ist kleiner als die meisten Nanopartikel Medikament Fluggesellschaften, die typische Durchmesser von 50-200 nm bis hin zu haben. Unter Erkrankungen werden diese Glycocalyx Poren größer durch Abbau, Erhöhung der Durchlässigkeit durch den endothelial Zellen. Die meisten Nanopartikel sind jedoch immer noch zu groß für diesen Strukturwandel in der Glycocalyx nutzen. Eine Implikation von diesem Größenfehlanpassung ist, dass konventionell große Partikel nicht günstig mit endothelial Zellen, die Blutgefäße säumen interagieren. Dies wirkt sich auf die Lieferung von intravenös verabreichten Partikel in das Endothel, und sagte auch der Teilchentransport durch den Blut Gehirn Barriere^7,8,9,10.

Ein Ansatz, um dieses Problem zu bekämpfen ist, kleinere Partikel durchlaufen die kleinen Poren in der Glycocalyx verwenden. Hier, synthetisieren wir 10,5 nm ultrasmall gold Nanopartikel, die normalerweise durch intakte, gesunde Glycocalyx abgehalten werden sollte. Sobald der Glycocalyx beginnt, kompromittiert zu werden, sollte die Nanopartikel die Zellen durch die zunehmende Porengröße leicht eindringen. Das Protokoll in diesem Whitepaper beschreibt eine Synthese aus ultrasmall gold Kern mit PEG, das erhöht der Biokompatibilität und verringert die systemische Clearance⁴beschichtet. Die PEG kann auch mehrere Arten von funktionellen Gruppen enthalten öffnen Wege für die Konjugation des Zielens Liganden, Fluorophore und Therapeutika. Zuvor zeigen veröffentlichten Ergebnisse, dass diese ultrasmall Nanopartikel sind in der Regel günstiger in Regionen der gestörten Endothelfunktion Glycocalyx Funktion auch ohne jede aktive Ausrichtung auf^4,11aufgegriffen werden. Dies zeigt die Machbarkeit und die Bedeutung der Verwendung von Partikeln der richtigen Größe für Lieferung Anwendungen. Das folgende Protokoll stellt die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von PEG-beschichtete AuNPs (PEG-AuNP), mit der Diskussion für die Anpassung der funktionellen Gruppen und Konjugationen für andere Anwendungen.

Protokoll

1. Vorbereitung oder Beschaffung von Stammlösungen (bei Raumtemperatur gelagert werden oder eingefroren bis zur Verwendung)

1. Bereiten Sie eine 1 M Natronlauge (NaOH) Stammlösung durch Auflösung von 400 mg NaOH 10 mL Reinstwasser bei Raumtemperatur, und die Materialien gut mischen.
   Hinweis: Reinstwasser bezeichnet Wasser ohne Verunreinigungen wie Partikel, Bakterien, Nukleasen, Ionen oder Spuren organischer Stoffe. Ein Reinigungssystem wird verwendet, um die Reinstwasser, was in seinen Widerstand von bis zu 18,2 mΩ·cm, zeigt eine geringe anionische Kontamination zu erhalten. Die Verwendung von handelsüblichen Flaschen Reinstwasser wird nicht empfohlen. Von nun an wird dieses Reinstwasser, als Wasser, bezeichnet werden, sofern nicht anders angegeben.
2. Bereiten Sie eine 6M NaOH Stammlösung durch 2,4 g NaOH in 10 mL Wasser auflösen und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
3. Bereiten Sie eine 250 mM-Stammlösung von Chlorogoldsäure (HAuCl₄) durch 1 g getrocknete HAuCl₄ in 10,16 mL Wasser auflösen. Verdünnen Sie 1 mL 250 mM HAuCl₄ mit 9 mL Wasser arbeiten Konzentration von 25 mM HAuCl₄zu erhalten. Lagern Sie die HAuCl₄ Lösung bei Raumtemperatur.
4. Bereiten Sie einen 0,1 M-Karbonat-Puffer bei pH 8,8, durch 84 mg Natriumbicarbonat in 10 mL Wasser auflösen und Einstellen des pH-Werts um 8,8 indem 6 M NaOH aus Schritt 1.2. Lagern Sie die Karbonat-Puffer bei Raumtemperatur.
5. 20 mL Tetrazoliumsalz zusammengesetzte, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium Salz (MTS), mit einem Stabilisierungsmittel, Phenazinderivat Ethosulfate (PES) mischen (siehe Tabelle der Materialien). Lagern Sie die MTS/PES-Mischung in Aliquote (für maximal 10 Frost-Tau-Zyklen) bei-20 ° C im Dunkeln.

(2) Synthese der Gold-Nanopartikel-Kerne

1. Bereiten Sie eine verdünnte THPC Lösung durch Zugabe von 12 µL von 80 % THPC im Wasser zu 1 mL Wasser in einem Microcentrifuge Schlauch bei Raumtemperatur.
2. Ein Rundboden 100-mL-Fläschchen mittig auf einer magnetischen rühren Platte zu sichern. Gießen Sie 45 mL Wasser in die Kanne und rühren Sie das Wasser bei 300 u/min mit einer kleinen eiförmigen magnetische rühren. 0,5 mL 1 M NaOH und 1 mL verdünnte THPC Lösung hinzugeben. Weiterhin das Reaktionsgemisch lang 5 min kräftig rühren.
3. Rühren Sie die Mischung und 2 mL 25 mM HAuCl₄ -Lösung. Die Farbe der Mischung ändert sich von gelb bis dunkelbraun innerhalb von Sekunden, darauf hinweist, dass die Bildung von THPC AuNPs mit einer negativen Ladung begrenzt. Rühren Sie die Mischung für eine zusätzliche 15 min, um vollständige Bildung der gold Kerne zu ermöglichen.

(3) Zugabe von Polymer Korona um die Gold-Nanopartikel

1. Den Zeitraum 15 min im Schritt 2.3 beschrieben, bereiten die PEG Lösungen durch jede der folgenden in 1 mL Wasser in 4 mL Glasfläschchen auflösen: 30 mg NH₂-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.
   Hinweis: Sollte die resultierenden Konzentrationen 8,8 M NH₂-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH und 3,75 M COOH-PEG-SH.
2. Nach Reduzierung der Rührgeschwindigkeit der Lösung in den Rundboden-Kolben bis 100 u/min, fügen Sie den Stöpsel verschlossen Lösungen zur Lösung der THPC AuNPs tropfenweise. Weiterhin die Mischung rühren sanft über Nacht bei Zimmertemperatur, um effiziente Entfernung von THPC und den Ersatz von PEG zu gewährleisten.
3. Verwenden Sie für die nächsten 72 h, eine 12-14 kDa Molekulargewicht cutoff Zellulose Membran um die gerührten Mischung gegen einen 4 L Eimer mit Wasser bei 60 u/min gerührt Dialyse. Binden Sie die Enden der Membranen durch Dialyse-Clips und übertragen Sie die Lösung per Pipette zu.
   Hinweis: Dieser Vorgang Dialyse mit 12-14 kDa cutoff Membran entfernt nur nicht umgesetztes PEG, THPC und anderen chemischen Reaktionspartner, durch Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten.
4. Zur Erhaltung der hohen Konzentrationsgradienten und kontinuierliche Verbreitung fördern, wechseln Sie das Wasser alle 2 h für die ersten 6 h und alle 6-12 h für die restlichen 66 h.
   Hinweis: Der Zweck dieses Wasser Änderungsplan soll die rasche Verbreitung unterzubringen, die schon früh aufgrund der anfänglich hohen Konzentration in der Probe auftritt. Der Dialyse-Prozess beschriebenen Blätter die Nanopartikel Lösung halb gereinigtes, weil die Nanopartikel, Ausscheidungen, Aggregate und andere große Verunreinigungen durch die Poren der 12-14 kDa cutoff Membran nicht passieren.
5. Filtern Sie die halb gereinigtes Nanopartikel-Lösung in ein 50mL konische Rohr mit 0,2 µm Spritze Filter verbleibenden Ausscheidungen, Aggregate und andere große Verunreinigungen entfernen.
6. Das konische Rohr in einem-80 ° C Gefrierschrank und lassen Sie die gereinigte PEGylated AuNP (PEG-AuNP) Lösung für ca. 5 Stunden gefrieren.
7. Verwenden Sie ein Gefriertrockner, um die gereinigten PEG-AuNP lyophilize.
8. Die trockene, gereinigte PEG-AuNP bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

4. Konjugation Fluorophore mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester auf NH₂ Gruppen auf die PEG-AuNP

1. Sichern Sie eine Flasche 50 mL Rundboden mittig auf einer magnetischen rühren Platte. Füllen Sie die Flasche mit 18 mL Wasser und rühren Sie das Wasser bei 100 u/min mit einer magnetischen rühren Ei-förmige Bar.
2. Wiegen Sie 2 mg gefriergetrockneten PEG-AuNP in einem 4 mL konische Rohr, mit einer hohen Präzision Benchtop-Skala. Verwenden Sie eine Anti-statische-Pistole, um statische Aufladung und Festhalten des Pulvers auf die Rohroberfläche PEG-AuNP zu beseitigen. Die Röhre 2 mL Wasser hinzufügen. Gießen Sie die 2 mL PEG-AuNP-Lösung in den Rundboden-Kolben für weitere Rekonstitution in insgesamt 20 ml Wasser. Rühren Sie die Mischung mit 100 u/min mit einer magnetischen rühren Ei-förmige Bar weiter.
3. Fügen Sie 1 mL 0,1 M, pH 8,8 Carbonat Puffer bis 20 mL der rekonstituierten AuNP enthalten in der Rundboden-Kolben. Rühren Sie weiter.
4. Fügen Sie 5 µL 10 mg/mL fluoreszierende NHS Ester in Dimethyl Sulfoxid.
   Hinweis: Alle fluoreszierenden Farbstoff kann in diesem Prozess verwendet werden. Rühren Sie die fluoreszierende PEG über Nacht. Halten Sie es bei Raumtemperatur und in Folie abgedeckt.
5. Entfernen Sie für die nächsten 72 h überschüssige Fluorophore, die über das Protokoll im Schritt 3.3 beschrieben. Kurz, Dialyse der gerührten Mischung mit einen 4 L Eimer Wasser und eine 12-14 kDa Molekulargewicht cutoff Zellulose Membran. Wechseln Sie das Wasser alle 2 h für die ersten 6 h und alle 6-12 h für die restlichen 66 h.
6. Erhalten Sie 1 mL der gereinigten fluoreszierende PEG-AuNP-Lösung, für die Charakterisierung, die nachfolgend in Abschnitt 5 beschriebenen verwendet werden. Einfrieren und lyophilize die restliche Lösung um fluoreszierende Nanopartikel in Pulverform für die Lagerung bei 4 ° C zu erhalten, wie in 3.5-3.7 beschrieben.
7. Verwenden Sie einen 0,2 µm Spritze Filter zu sterilisieren und jede möglichen Ausscheidungen einmal rekonstituiert für Zelle Kultur Anwendungen zu entfernen.

5. Charakterisierung von fluoreszierenden pegylierten Gold-Nanopartikeln

1. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zu visualisieren den gold-Nanopartikel-Kern und quantifizieren die Größen
   1. Tropfen Sie 10 µL der gereinigten fluoreszierende PEG-AuNP-Lösung auf ein Maschengitter TEM Kohlenstoff beschichtet.
   2. Verwenden Sie nach 5 min ein Stück Filterpapier, sorgfältig Docht entfernt überschüssige Flüssigkeit vom Rand des Rasters TEM bis ein Film mit Leuchtstoffröhren, die PEG-AuNPs hinter sich gelassen.
   3. Anzeigen der fluoreszierenden PEG-AuNPs bei 80 kV und bei einer Vergrößerung von 50.000-150, 000. Nehmen Sie digitale Fotos.
      Hinweis: Nur die gold Kern wird sichtbar sein, da die PEG nicht ELEKTRON Dichte auf der TEM ist.
   4. Legen Sie mithilfe einer messen-Software die Messskala in Korrelation zu der Maßstabsleiste. Berechnen Sie den Durchmesser von ca. 20 gold Kerne, und ermitteln Sie die durchschnittliche gold Kerndurchmesser.
      Hinweis: Die TEM-imaging-System legt automatisch eine Maßstabsleiste auf die digitalen Bilder.
2. Messung der hydrodynamischen Nanopartikelgröße verwenden dynamische Lichtstreuung (DLS)
   1. 1 mg gefriergetrockneten THPC-beschichtete AuNPs zu einem Microcentrifuge Schlauch mit dem in Schritt 4.2 beschriebenen Ansatz zu übertragen. Übertragen Sie 1 mg gefriergetrockneten PEG-AuNP in einem separaten Rohr. Jedes Rohr 1 mL Wasser hinzu und übertragen Sie jede AuNP Lösung auf eine 1 mL durchsichtigen Kunststoff.
   2. Legen Sie eine Küvette in ein Instrument der DLS und Messen Sie sphärische hydrodynamische Durchmessern mit der Partikel-Analyzer-Software, die in das DLS-System integriert ist.
   3. Darstellen Sie die gemessenen hydrodynamischen Durchmessern mit einem Histogramm-Format.
      Hinweis: Das Histogramm werden Nanopartikel nach Größe gruppieren. Die größte Gruppe von Nanopartikeln klären den Durchmesser, der am besten die Größe des AuNPs, die in diesem Protokoll synthetisiert beschreibt.
3. Fluorometrisch Fluoreszenz-Bestätigung
   Hinweis: Die gleiche Probe und Küvette aus Schritt 5.2 können Fluoreszenzsignal zu messen verwendet werden.
   1. Entfernen Sie die Küvette aus der DLS und in ein Spectrofluorometer stecken. Satz die Erregung Wellenlänge 633 nm und lesen Sie die emittierte Fluoreszenz entlang einem Wellenlängenbereich von 650-800 nm signalisiert.
   2. Bestätigen, dass die Spitze etwa 665 nm, die zur Emission Spitze für NHS korreliert.
      Hinweis: Stellen Sie die Anregung und Emission Wellenlängen entsprechend der Fluorophor in dem Verfahren verwendet.
4. MTS Test¹¹ Biokompatibilität bewerten
   1. In einer 96-Well klar unten steril Gewebekultur behandelt Teller, pipette 100 µL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM; mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt) und 3,2 x 10³ Zellen in jedem Brunnen.
      Hinweis: In dieser Studie werden Ratte Fettlappen endothelial Zellen verwendet. Insgesamt 21 Brunnen werden verwendet, um ermöglichen 3 Wiederholungen für jede der 7 verschiedenen Nanopartikel Konzentrationen (siehe 5.4.3 Schritt für bestimmte Konzentrationen von Interesse).
   2. Die Zellen wachsen, Konfluenz in Feuchtigkeit und 5 % CO₂ gesteuert-Gründerzentren bei 37 ° C¹¹zu ermöglichen.
   3. Bereiten Sie individuelle Mikrozentrifugenröhrchen jeweils 300 µL DMEM mit Nanopartikeln der verschiedenen Konzentrationen. Diese Untersuchung erfordert 7 verschiedene Röhren des DMEM mit den folgenden PEG-AuNP-Konzentrationen: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL und 1.000 µg/mL.
   4. Aspirieren Sie DMEM aus der Tube. Füllen Sie die Brunnen in dreifacher Ausfertigung mit 100 µL DMEM Medien mit 0, 10, 50, 100, 250, 500 oder 1.000 µg/mL AuNP.
   5. Lassen Sie die Zellen und Nanopartikeln für einen vorher festgelegten Zeitraum hinweg hier für 16 h Co auszubrüten.
   6. Nahe dem Ende der Inkubationszeit tauen Sie die MTS/PES-Mischung aus Schritt 1.5.
   7. Nach der Inkubation Aspirieren der DMEM und die schwebenden, lose beigefügte Nanopartikel aus den Brunnen. Fügen Sie 100 µL der frischen DMEM zusammen mit 20 µL MTS/PES-Lösung 1:5 MTS/PES DMEM-Verhältnis laut Protokoll des Herstellers zu erhalten. Inkubation der Zellen mit MTS/PES bei 37 ° C für 2 h.
      Hinweis: Diesmal 2 h Inkubation wird bestimmt durch die Stoffwechselaktivität von Endothelzellen und kann auf bis zu 4 h für andere Zelltypen erhöht werden. Innerhalb der 2 h ist der MTS von Endothelzellen in farbigen Formazan metabolisiert, die mit der DMEM mischt. Biokompatibilität der PEG-AuNP und die Wahrscheinlichkeit der Zellviabilität werden mit mehr farbige Formazan nachgewiesen werden. Toxizität von PEG-AuNP und die Chance, die die Zellen sterben wird mit weniger intensive Farbe angezeigt.
   8. Führen Sie kolorimetrischen Analyse von jedem Bohrloch durch das Lesen der Extinktion bei 492 nm mit einem Lesegerät kompatibel Platte.
   9. Berechnen Sie für jede Konzentration der Nanopartikel die durchschnittliche Absorption von dreifacher Absorption Werte. Dividieren Sie die durchschnittliche Absorption durch den Wert von durchschnittlich Extinktion in Brunnen mit 0 µg/mL Nanopartikeln erhalten.
      Hinweis: Diese Vertiefungen, die keine AuNPs enthalten dienen als Kontrollen für die Berechnung der prozentualen Zellviabilität in Reaktion auf die Behandlung der Nanopartikel in anderen Brunnen verabreicht.
5. Fluoreszenz konfokalen Mikroskopie Bewertung der Nanopartikel Aufnahme in adhärenten Endothelzellen mit intakt oder dysfunktionalen Glycocalyx¹¹
   1. Samen 1.0 x 10⁴ Zellen/cm² Ratte Fett pad Endothelzellen auf sterile 12 mm Glasdeckgläser und füttern Zellen mit DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Lassen Sie die Zellen auf volle Konfluenz der Luftfeuchtigkeit und der CO₂ gesteuert-Gründerzentren bei 37 ° C für ca. 3 Tage wachsen.
   2. Fügen Sie Behandlungen um die Glycocalyx zu ändern, falls zutreffend. Z. B. verschlechtert 2 h Behandlung der kultivierten Endothelzellen mit 2,5 x 10^-6 IU Heparinase III Enzym die Glycocalyx durch speziell Spaltung seiner Heparan Sulfat-Komponente.
      Hinweis: Durch den Anbau der Endothelzellen wie unter Schritt 5.5.1 ohne Zusatz von abbauenden Enzyme kann gesunde Glycocalyx modelliert werden.
   3. Brüten Sie mit der endothelialen Glycocalyx intakt gelassen oder dysfunktionalen gerendert die Endothelzellen mit fluoreszierenden AuNPs bei 550 µg/mL für 16 h oder andere gewünschte Zeit.
   4. Vorsichtig Waschen der Zellen mit 2 mL 37 ° C 1 % Rinderserumalbumin in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; enthält 100 mg/L Calcium und Magnesium 100 mg/L). Tauchen Sie die Zellen in 2 mL 2 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd in PBS, und lassen Sie die Zellen für 30 min bei Raumtemperatur zu beheben.
   5. Die Aldehyd-Befestigungs-Lösung entfernen und Waschen der Zellen mit Raumtemperatur PBS für drei 5-Minuten-Zyklen.
   6. Setzen Sie vor der Auftragung Primärantikörper Endothelzellen, 2 % Ziegenserum mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur zu unspezifischen Bindungsstellen blockieren aus. Zellen müssen durch die blockierende Lösung umfassend abgedeckt werden.
   7. Inkubieren Sie Endothelzellen über Nacht mit 1 % Anti-Heparan Sulfat Primärantikörper in 2 % Ziegenserum mit PBS-Puffer bei 4 ° C die Heparan Sulfat Bestandteil der Glycocalyx beschriften. Sicherstellen Sie, dass die festen Zellen vollständig in Kontakt mit der Antikörperlösung.
   8. Am nächsten Tag Auswaschen des Antikörpers mit Raumtemperatur PBS für drei Zyklen von 10 Minuten.
   9. Inkubieren Sie die Endothelzellen mit 1:1,000 Verdünnung der entsprechenden fluoreszierende Sekundärantikörper für 30 min bei Raumtemperatur, im dunklen oder mit Aluminiumfolie bedeckt.
   10. Der Sekundärantikörper mit Raumtemperatur PBS für drei Zyklen von 10 min. auswaschen.
   11. Montieren Sie das Deckglas auf Objektträger mit einer Anti-Fade Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Kerne Färbung. Versiegeln Sie die Schnittflächen des Deckglases mit Nagellack.
   12. Bild der fluoreszierenden Immunostained Endothelzellen Proben mit konfokalen Mikroskopie, mit blauen, grünen und weit rot Kanäle, um die Kerne, Heparan Sulfat Glycocalyx und die Nanopartikel bzw. zu visualisieren.

Ergebnisse

Die synthetisierte AuNPs, beschichtet mit THPC oder PEG (Abbildung 1A und Abbildung 1 b, beziehungsweise), werden mit TEM und die Partikel Größen gemessen werden, mit dem TEM und DLS zur Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Nanopartikel Größenverteilung abgebildet. Abbildung 2 zeigt die TEM-Bild einer THPC-AuNP-Probe bei 80 kV und 150.000 X Vergrößerung. Die Durchmesser der THPC-AuNP Partikel reichen von 2 bis 3 nm, basierend auf der Kalibrierung Bar in TEM Bilder. Dieser THPC-AuNP Größe zeigt sich auch in der DLS Größe Messung Histogramm in Abbildung 2dargestellt, in denen die THPC beschichtet AuNP erweist sich haben einen Spitzenwert bei 2,5 nm. Pegylierung ist nicht unter TEM sichtbar, da die Polymere nicht ELEKTRON Dichte sind. TEM Bildgebung von PEG-AuNP Proben bestätigt einfach das Vorhandensein einzelner dispergierten Partikel, die erwartet wird, weil die PEG Polymer Korona um die Nanopartikel Hilfe bei der Prävention der Aggregation. Für diese Beispiele PEG-AuNP das DLS Größe Messung Histogramm zeigt eine Verschiebung in der Spitze um rund 10,5 nm auf der DLS. Anhängen von weiteren Liganden oder Drogen auf funktionelle Gruppen wirken sich auf die Größe der Nanopartikel sowie und sollte in Betracht gezogen werden, wenn den Durchmesser messen.

Das Fluorophor hinzufügen (Abbildung 1) bestätigt mit einem Fluorometer, um Fluoreszenzsignal aus einer Stichprobe von Nanopartikeln, zu messen, wie in Abbildung 3dargestellt. Bei Erregung mit einer Wellenlänge von 633 nm, die Emission wird gemessen, um ein Maximum zwischen 660 und 672 nm haben die Produktinformationen des Herstellers der maximalen Emission bei 665 passt nm. Befestigung der anderen fluoreszierenden Sonden sollte in ähnlicher Weise fluoreszierende Antwort darauf überprüft werden.

Die Biokompatibilität der Partikel und damit verbundenen Zellviabilität sind anhand der MTS-Assay, relative Zellstoffwechsel der MTS nach 16 h Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der Nanopartikel zu überprüfen. Das Fluorophor konjugierte PEGylated AuNPs zeigt keine signifikante Toxizität durch die ähnliche Niveaus der Zellviabilität bei allen Konzentrationen bis zu 1 mg/mL (Abbildung 4A) angezeigt. Diese Biokompatibilität variieren abhängig von den therapeutischen oder Liganden befestigt, die verbleibenden Funktionsgruppen, die Partikel noch weiter anpassen. Droge-Anlagen sind in der Regel Toxizität erhöhen, aber abhängig von den Konzentrationen arbeiten, es kann keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit in signifikanter Weise.

Aufnahme von Leuchtstofflampen, PEGylated AuNPs (Abbildung 1) von adhärenten Zellen wird anhand kultivierte Ratte Fettlappen Endothelzellen, mit intakter oder dysfunktionalen Glycocalyx (Abbildung 4 b). Die dysfunktionalen Glycocalyx Bedingungen werden durch Hinzufügen von Heparinase III Enzym zur Kultur, was zu einer Verschlechterung der Heparan Sulfat Glycocalyx Komponente und gefährden die Matrix¹²erreicht. Abbildung 4 b zeigt die verschiedenen Stufen der Aufnahme von PEG-AuNPs, als rote Punkte auf die Querschnittansicht der repräsentativen Endothelzellen. Eine gesunde Glycocalyx schreckt Aufnahme von diesen gold-Nanopartikeln, aber eine deutliche Erhöhung der wird beobachtet, wenn das Enzym beschäftigt¹¹ist. Dieses Ergebnis zeigt das Potenzial dieser ultrasmall Nanopartikel Therapeutika, Endothelzellen in gewissem Sinne gesteuert durch verschiedene Wechselwirkungen, die auf Glycocalyx Gesundheit anzubieten.

Abbildung 1: Gold-Nanopartikel-Schaltpläne. (A) THPC beschichtete AuNP Nanosphere vor PEG-Ersatz. (B) PEGylated AuNP mit 3 Arten von PEG Kündigungen, einschließlich COOH, NH₂und CH₃. Blaue Wellen stehen für das Polymer. (C) konjugiert Nanopartikel für die Fluoreszenz-Bildgebung. Rote Sterne zeigen die Fluorophore, NH₂ Funktionsgruppen konjugiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Größe Messungen von gold-Nanopartikeln. Links: TEM von gold-Nanopartikeln vor der Zugabe von PEG bei 80 kV und 150.000 X Vergrößerung mit Maßstabsleiste gezeigt. Rechts: Histogramm die Nanopartikelgröße gemessen von DLS vor (AuNP) und nach (PEG-AuNP) der THPC Austausch mit PEG. Die DLS-Ergebnisse für THPC-beschichtete AuNP quantifizieren, was durch TEM visualisiert wird. Die DLS-PEG-beschichtete AuNP Ergebnisse überwinden die Herausforderung, die Unfähigkeit, PEG durch TEM aufgrund nicht sein Elektron Dichte Polymere zu visualisieren. Ein TEM PEG-AuNP zeigt nur den Kern gold-Nanopartikel und wird gleich aussehen wie ein THPC-capped AuNP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Fluoreszenz-Daten von den fluoreszierenden PEG-AuNP. Die Fluoreszenz-Spitze bei 667 nm-Spiele, die die Emission von der Fluorophor, PEG-AuNP konjugiert. AE: willkürliche Einheiten.

Abbildung 4: Zell-Interaktionen mit dem fluoreszierenden PEG-AuNP. (A) Zelle Lebensfähigkeit (MTS Stoffwechsel) Grundstück für Ratte Fett pad Endothelzellen nach 16 h Co Inkubation mit fluoreszierenden PEG-AuNP. (B) konfokale Schnittbilder von festen Ratte Fett Polstern endotheliale Zellen befleckt mit DAPI für die Zellkerne (blau) und Antikörper gegen Heparan Sulfat, eine Glycocalyx-Komponente (grün). Obere Bild ist eine gesunde Glycocalyx und unten befindet sich eine Schicht von degradierten Glycocalyx; Es gibt deutlich mehr rote Fluoreszenz von Nanopartikeln in der Probe mit degradierten Glycocalyx. Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Diese Technik ist eine wirksame Methode zur Synthese anpassbar, ultrasmall PEG AuNPs beschichtet. Ein wichtiger Teil dieses Verfahrens ist, dass die erste Bildung von THPC Gold gekappt, die Nanopartikel, die durch den Farbumschlag von gelb bis braun, die bestätigt werden kann auftreten wird, nachdem der Inhalt in den Rundboden-Kolben (Protokoll Schritt 2.3) HAuCl4 hinzugefügt wurde. Keine Farbänderung angibt, dass es keine Nanopartikel gebildet gibt und die ersten Schritte sollten überprüft und, bevor Sie fortfahren wiederholt. Im Fall, die, den die Farbe ändert sich auf etwas anderes als braun wie weinrot oder grau, die entstehenden Partikel werden sich wahrscheinlich nicht um das Ziel 2,5 nm und eine neue Charge sollte auch gemacht werden.

Nach der Bildung der gold Kern der Austausch von THPC für PEG und die Reinigung Verfahren enthalten mehrere wichtige Schritte für den erfolgreichen Abschluss des Protokolls. Mischen über Nacht ermöglicht die Ersatz-Reaktion, bis zur Fertigstellung zu gehen. Gescheiterte Reinigung könnte auftreten, wenn die Dialyse Wasser nicht mit der vorgeschriebenen Frequenz geändert wird. Aggregation und Niederschlag der Partikel können auch auftreten, wenn die Partikel in der Dialyse für mehr als 72 h gelassen werden. Andere potenzielle Probleme konnte während der Gefriertrocknung beobachtet werden. Wenn die ultrasmall PEG AuNP beschichtet Lösung nicht vollständig gefroren war oder der Gefriertrockner nicht richtig eingerichtet wurde, können Proben verloren gehen. Finden Sie im Gefriertrockner Handbuch, da einige Geräte unterschiedlichen Vorbereitungen erfordern.

Die Leichtigkeit der Synthese und die Biokompatibilität der resultierende Partikel stellen Vorteile für die Verwendung dieser PEG-AuNPs. Diese Nanopartikel haben darüber hinaus den Vorteil, mit nanoskaligen Zellstrukturen zu interagieren, wie gezeigt durch die Fähigkeit, degradierten Glycocalyx durch Aufnahme von diesen Nanopartikeln zu identifizieren zu können. Dieser Vorteil kann für die Entwicklung neuer Therapien Atherosklerose und vorbeugende Maßnahmen genutzt werden. Darüber hinaus, was wir hier, ein weiterer Vorteil dieses Protokolls präsentieren ist, dass es ermöglicht umfangreiche Anpassungen der Partikel sowie erhöhte Stabilität und Speichermöglichkeiten durch das Anbringen von Thiol mit PEG auf der gold-Nanopartikel-⁴. Das andere Ende der PEG-Kette kann eine funktionelle Gruppe enthalten, und eine Vielzahl von Molekülen kann zu diesen Gruppen konjugiert werden. In diesem Protokoll werden alle drei gemeinsame Funktionsgruppen angebracht (Methyl, Carboxylgruppen, und Aminosäuren). Das Verhältnis des Stiftes ist gewählt, Fluoreszenz-Detektion zuerst zu priorisieren, dann die Möglichkeit, eine sekundäre targeting Abstimmungsunterlagen mit der Carbonsäure-Gruppe zu integrieren. Die Verhältnisse dieser Gruppen können optimiert werden, abhängig von der Anwendung und die Längen und Formen der Polymere können auch angepasst werden.

Zur Messung der Partikel Aufnahme konjugiert wir eine fluoreszierende Sonde eines funktionellen Gruppen. Es sei darauf hingewiesen, dass jede Konjugation über was wir beschrieben haben eine Veränderung von Oberflächeneigenschaften der Nanopartikel führen wird. Jede Iteration der Nanopartikel im Hinblick auf zusätzliche Komponenten und Konjugation Reaktionen sollten für die gewünschten Eigenschaften getestet werden.

Diese Methode erzeugt ultrasmall goldene-Nanopartikeln bestimmt die defensive Eigenschaften der endothelialen extrazellulären Glycocalyx zu überwinden, die Aufnahme von konventionell Größe Nanopartikeln behindert. Die geringe Größe verleiht jedoch Schwierigkeiten bei der Bildgebung und der Droge laden Aspekt. Diese Partikel sind deutlich kleiner als die typischen Nanopartikel Größenbereich, und infolgedessen ist die Fläche für Anlagen von Therapeutika und targeting Moieties stark zurückgegangen. Dies führt zu Schwierigkeiten Abholung Einzelsignale in imaging-Anwendungen, obwohl Cluster von Teilchen noch leicht identifiziert werden können, wie in der konfokalen Bilder gezeigt. Die reduzierte Oberfläche für Anlagen des Zielens Liganden und Therapie erfordern mehr Partikel verabreicht werden, um Dosierungsanforderungen Ziel zu erreichen. Allerdings werden die kleineren Teilchen effizienter im Lieferumfang, wenn unter Berücksichtigung der Glycocalyx.

Diese neuartige ultrasmall Partikel sind in der Lage, Lieferung in schwer zugänglichen nanoskaligen Bereichen innerhalb des Körpers mit minimaler Unterbrechung der Mikroumgebung. Die Zugabe des Stiftes ermöglicht erhöhte Biokompatibilität und Funktionsgruppen für schwere Anpassung der Partikel für verschiedenste Anwendungen bietet. Die geringere Größe im Vergleich zu typischen Nanopartikel verfügt über einige Mängel, aber wenn strategisch entwickelt, das ultrasmall Teilchen ist ein vielversprechender Ansatz zur Unterbringung von schwer zu durchdringen, komplizierte und empfindliche Glycocalyx im Kreislauf Targeting und Droge Lieferung.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)	Sigma Aldrich	520918
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride	Sigma Aldrich	404861
Mono-functional mPEG-thiol	Layson Bio Inc.	MPEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	NH2-PEG-SH-3400-1g	Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	CM-PEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa)	Sigma Aldrich	D9777
Zerostat anti-static instrument	Sigma Aldrich	Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester	Fisher	A20006	Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade	Thermo Fisher Scientific	09-801-B
Transmission electron microscopy	JEOL USA	JEOL JEM-1000	TEM
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments Corporation	Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer	DLS
Fluorometer	Horiba Scientific	Jobin Yvon Fluromax 4	Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582	MTS
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M4	Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody)	Amsbio	370255	Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody)	Thermo Fisher Scientific	R37120	Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1000	With DAPI
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 700	Confocol microscopy