精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

要約

このプロトコルの目的は、肝臓から高生存率および肝細胞と類洞内皮細胞の高収率を取得することです。これは、灌肝門脈、肝細胞と類洞内皮細胞を取得する差動遠心分離の続くタイプ IV コラゲナーゼの解決で。

要約

このプロトコルは、高収率とマウス肝細胞と類洞内皮細胞 (秒) やセル lysates を得るため養殖には適してのため生存率を求める方法を示します。このプロトコルでは門脈下大静脈ではなく、カテーテル検査のサイトとして使用されますこれは最終的な肝臓の他の可能な細胞型の汚染を限界として。特別な計測はプロシージャ全体で必要ありません。水のお風呂は、すべてのバッファーおよび解決の温度を維持するために熱のソースとして使用されます。標準的な蠕動運動型ポンプを使用して、流体を実行して、冷蔵テーブル トップ遠心分離機は遠心分離の手順に必要です。この方法の唯一の制限は、18-25 g の大きさの範囲にマウスのいくつかの挑戦は門脈内でのカテーテルの配置です。この方法の利点は、1 つだけ静脈灌流の活用されている静脈へのアクセスが速い、虚血と再灌流肝肝細胞生存率を減少させるを最小に。この議定書のもう一つの利点は遠心分離手順中に細胞の密度の違いによる視力によって死んだ肝細胞からライブ区別しやすい。このプロトコルからセル可能性がありますが任意のダウン ストリーム アプリケーションの細胞培養で使用し同様に処理すべての生化学的評価のため。

概要

コラゲナーゼ灌流肝臓肝細胞を取得するは 1950 年代初頭から行われている、^1,2,3,4に継続的に改良されています。方法論、技術、及び肝細胞精製に用いられる試薬の多くの非常に良いレビューは、マイヤーら⁵にまとめられています。非常に現実的な肝細胞と秒の満足な収量を得ることは技術的に困難です。コラゲナーゼの品質を含む細胞を分離機械力はコントロールが困難な変数の一部です。機械力に肝細胞の感受性のためサブ最適な条件の最適分離条件を記述したプロトコルの必要性を求める中での生存率は著しく減少します。秒は、機械的剪断に敏感ではないと思われます。コラゲナーゼの消化力によるその場で血液灌流は断然、肝臓、腸、脾臓⁶など他の臓器から単一のセルの準備を取得するセル接合を破壊する最善の方法です。このプロトコルは、Smedsrødら⁷で説明したように折りたたむには、門脈を引き起こす可能性のある切開ではなく、引き込み式のプラスチック製のカテーテルを使用して門脈に灌流バッファーを導入するための単純なメソッドを示します。

本稿の目的は、肝咲き乱れる手順で成功するために必要な最も重要な手順を示すことです。これらの手順は、カテーテル留置、灌流液と組織の消化後の処理の流れです。流量調整、血流の自然な率を上回るが、グリソンをそのままに保つために十分に低いです。肝臓はきちんと消化され、細胞がソリューションで区切られて、一度細胞精製の差動遠心分離、プレート接着することによって磁気ビーズ浄化の実行かどうかに比較的単純なです。ライブの肝細胞より高い密度を持っているし、実質細胞 (Npc) と低速遠心分離と死んだ肝細胞から容易に浄化されます。ほとんどのアプリケーション、クッパーを分離するためプレート接着細胞 (KCs) と秒は共通の方法⁸秒⁹の最高純度を作り出さない報告があります。株式会社ケーシーエスすぐに固体の硬質表面に付着する傾向がある、ペトリ皿 (標準ポリスチレン) このプロシージャの最も一般的に使用される素材です。このプロトコルの上に別の 3-4 h が追加されますが、全体の収量は減少⁹標識抗体の磁性体ビーズを使って秒または KC 浄化は間違いなく、これらの細胞の重要な浄化に最適な方法です。このレポートは、詳細に最適な肝灌流一般生菌数が多いを生成するためのプロセスを示します。

プロトコル

このプロトコルに記載されている動物のすべての手続きは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 議定書 #1435 ネブラスカ州 - リンカーンの大学によって承認されています。

1. 準備

1. 溶液及び培地の調製
   1. すべての培地と材料表によるとバッファーを準備します。
2. 機器の準備
   1. 水浴を設定 (> 10 L) 42 ° C、可変的な速度、フラスコを保持するためのクランプと蠕動性ポンプで。曲線はさみと鉗子 (図 1) を準備します。
   2. 上または水のお風呂に隣接するベーキング シート (約 38 × 26 cm) 発泡スチロール パッド (50 mL コニカル ラック) で 20 × 20 cm の部分 (図 1) にカット吸収 underpad かぶせてを設定します。
   3. 近くにマスキング テープ (5-8 cm) の一部を配置します。つまりカットと使用する準備ができて近くに 20 cm ポリエステル ミシン糸を配置します。引き込み式の針 (7 mm × 19 mm、図 1) プラスチック製カテーテルを取得します。
3. ガラス製品の準備
   1. クランプを使用して、配置、200 mL の 1x PBS ソリューションに 2 つの 1 mL ピペットにはストッパー付きを含む水のお風呂で 1 L フラスコを固定します。ゴム コルクは閉回路で流体の循環を許可するノッチです。
   2. 別のクランプと液体液体上に残ります、フラスコに酸素を吹き込み吹フラスコの底の近くで 1 つは 2 つの 1 mL ピペットにはストッパーとバッファー 2 45 mL を含む 125 mL フラスコを配置します。
      メモ: ストッパーで各ピペットには管の容易な切換えのために最後に接続されているアダプターを切断クイックがあります。酸素は、液体に浸漬しないストッパーにピペットで両方のフラスコに穏やかに流れるでしょう。
   3. 2 滅菌結晶皿置いておきます。

2. 動物のプロシージャ

1. 風呂の水で 42 ° C に PBS バッファー 2 ソリューションをウォーム アップし、液体のラインを暖かい保つために閉鎖回路でチューブの少なくとも 20 mL/分のため PBS を循環します。ままに風呂の水で余分なチューブを浸す 42 ° c. にできるだけ近い1 L フラスコ含む PBS にチューブのオス側をドレインします。
2. 吸収 underpad にコットン ボールを配置し、綿球で転送ピペットを使用して 30% イソフルラン (ポリエチレング リコール 200 イソフルランの蒸発速度を減少させる製) 約 2 mL を追加します。
3. 尻尾をマウスを拾う、結晶の料理の一つに、マウスがある麻酔を吸入するための小さなスペースを持つよう迅速に綿球に皿を覆します。マウスの呼吸数を観察し、マウスが効果的に麻酔します。
   注: 呼吸の速さは遅く、深いをする必要があります尾弛緩と足を麻酔下でピンチ テストに反応しません。IACUC ガイドライン詳細についてを参照してください。
4. (これは 1 〜 2 分かかる) 麻酔下マウスが起こって、プランジャーを抜くと、小さな綿のボールを挿入することによってバレルの 10 mL の注射器を準備します。バレルの内部の綿ボールに転送ピペットで 30% イソフルランの 1-2 mL を追加し、無意識にマウスを待っている間、テーブルの上をオープン エンド型バレルを配置します。
5. すぐに結晶皿を脱いで、背中にマウスを反転し、その鼻をシリンジ バレルを配置します。ダブル チェック呼吸率、つま先のピンチと弛緩な尾。つま先のピンチと弛緩の尾への応答は、マウスは完全に麻酔下でないことを示します。シリンジ バレルを保つ意識を維持するために鼻の上。
6. 仰臥位で伸ばした肢を持つマウスの足を通して場所親指の鋲。腹部および 70% イソプロパノール、エタノールと胸郭に濡れています。
7. 1 つの手でストレートの鉗子で腹部の基部付近の皮膚を持ち上げます。もう一方の手ではさみ、テント皮膚や腹膜にカットします。切開は、水平またはテントの肌のベースにする必要があります。必ず腸へのアクセスを得るために皮膚や腹膜のすべての層をカットしてください。横方向の周りカット胸郭まで腹部両側に刻み目をつける人の臓器のいずれかなし。
8. 下部胸郭間切断することによって皮膚のフラップをカットします。門脈を公開する鉗子の背で腸を右に移動します。
   注: 動物から出血も最小限。動物を呼吸する必要がありますまだ、深い麻酔下。
9. 上膵十二指腸静脈 (図 3の矢印) と肝臓の間の門脈の下に閉じたカーブタイプ鉗子を配置します。
10. 門脈、下に鉗子を開きます。スレッドをつかんで門脈下中心になるので、慎重に引き出します。門脈周囲オーバーハンド ノットを結ぶダウン cinching なし。
11. 門脈下カーブタイプ鉗子を置き、静脈 (図 4A) をまっすぐにマウスの尻尾に向かって静かに引き出します。
12. もう一方の手でカテーテル、顔アップと門脈鉗子 (図 4B) 近くの下の部分と平行針の傾斜面を配置します。
13. そっと針 (図 4C) で静脈を穿刺します。針の傾斜面は、静脈の内腔を確認します。バネ付きの針を撤回、ベベルは静脈の分岐エリア近くまで静脈を通して高分子カテーテルをプッシュし続けます。これは肝臓内です。カテーテルを正しく配置すると、血液の逆流が表示されます。(図 4D)。
14. オーバーハンド ノットを締め、それを安定させるためにカテーテルにプルダウンします。20 mL/min から 4 mL/分のポンプ率を下げて排水のため別の主要な血管を切りすぐに。最適な結果を得るのための腹部大動脈をカットします。
15. カテーテル (図 5A) のメス側に管のオス側を配置します。ラインに気泡がないことを確認します。カテーテルがプッシュに肝臓や静脈のうちのいずれかではないことに注意してください。静脈からの逆流を防ぐのに役立ちます (図 5B、C) の正しい位置にカテーテルを保つことができますが、スレッドの配置は必須ではありません。
16. マスキング テープを使用、underpad にチューブを固定します。肝臓、数回を膨らませるため排水の血管を圧迫するストレートの鉗子を使用してすべての血が (図 5D) を排水していることを確認します。
    注: 標準研究室テープが働かないかもしれない;ただし、マスキング テープは、ウェットコンディションでも、underpad につっこまれたままでしょう。

3. 肝灌流

1. 肝臓は、PBS のフラッシュは中、IV 型コラゲナーゼの約 24 mg を測定し、風呂の水でバッファー 2 45 mL を含むフラスコ内に配置。必ず、コラゲナーゼが完全に解散したとき、フラスコの液体を旋回し、クランプに戻ってフラスコを置いて、フラスコの液体コンテナー部分が完全に水に沈めてください。
2. PBS のフラッシュは肝臓の色の変化を観察します。125 mL のフラスコに 1 L フラスコから流出管を変更します。肝臓に流入する空気の泡ができないようにします。
3. 灌流のバッファーでは、肝臓に達すると、容器内のいくつかの圧力を構築でき、肝臓のすべての葉をいっぱいにこの液体廃液血管絞るタイトな簡潔に。肝臓 (グリソン) を取り巻く薄い結合組織をバーストし、灌流肝臓の毛細血管内の液体の流れを破壊する可能性があります、長すぎると、排水を遮断しないようにします。
4. 組織を通じて流れてきたすべての 45 mL まで、肝臓を灌流するコラゲナーゼとバッファー 2 を許可します。
   注: 成功した場合、グリソン鞘の区切る必要があります肝臓や肝組織、柔組織から非晶質自体表示 必要があります。
5. 他の結晶皿にバッファー 1 の約 10 mL を追加し、マウスの隣に配置します。
6. カテーテルを外し、ポンプをオフにします。
7. ストレート ピンセットとはさみ、マウスから肝臓をカットします。コラゲナーゼの消化力は非常に効率的なされた場合マウスから肝臓をスクープし、バッファー 1 に配置する一方、滅菌スプーンを持っている必要があります。

4. 肝細胞浄化

注: セルの操作は、セルのすべての以降の手順で培養する場合、汚染を制限する滅菌のティッシュ文化フードで実行されます。

1. 生殖不能の技術を使用して、肝臓をピンセットでつかむし、肝臓から細胞を軽く振る。引き裂くまたはグリソンを引き戻す: 細胞が肝臓から揺さぶられると、バッファーは不透明になります。
2. 一番上を越えて 100 μ m フィルターで 50 mL の円錐形に細胞液を注ぐ。
3. 肝の残党により多くのバッファー 1 を追加し、続ける細胞を横に振る。とき肝臓の未消化の部分に譲歩しないもうセルまたはセルを欠いている肝臓が表示されるまで続行します。
4. 別の 50 mL を 40 μ m のフィルターを含む円錐形に細胞の液体を注ぐ。
5. 円錐スイング バケツ ローター 100 x g で 3 分間遠心します。
   注: これは細胞ペレットを取り除くことが、最大のブレーキを使用しないでください。4 ° C でのすべての残りの遠心分離手順にとっては十分な 80% でブレーキを使用します。
6. きれいな円錐形に (Npc と死んだ肝細胞を含む) の上澄みを離れて注ぎ、氷の上に置きます。これはペレットの付着を観察する 1 つの動きでを確認します。
7. バッファー 1 の 40 mL にペレットを再懸濁します。4.5 および 4.6 手順を繰り返します。バッファー 3 40 mL にペレットを再懸濁します。4.5 および 4.6 の手順を 2 回繰り返します。
8. 暖かい DMEM + 10 で精製した肝細胞を再懸濁します %fbs + 2 x のペニシリン-ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。
9. 細胞がコラーゲンをコーティングしたプレート上で培養した、1 h の従うことができ、交換メディアを少なくとも一度これとして任意の初期の細菌汚染を防ぐが。
   1. 0.05% コラーゲン 0.001% 酢酸 37 ° C で少なくとも 1 時間のためにそれらをインキュベートし、1 × PBS で洗浄し、コラーゲンをコーティングしたプレートを作る。
10. 場合は肝細胞生存率は低く、精製高実行可能な肝細胞を取得し、適応 Kreamerら¹⁰から次のプロトコルを使用する欲求があります。
    1. PVP 溶液 (パーコール、水の 23%/w ソリューションおよび 15-30 nm コロイド状シリカ粒子密度遠心分離にポリビニルピロリドンでコーティング) のミックス 9 ボリュームと iso 浸透の PVP ソリューション (SIP) にするための 10 の x HBSS の 1 つのボリューム。
    2. SIP の 24 mL を滅菌 50 mL コニカル 4 ° C で最大 2 ヶ月間これらの条件で保存可能性がありますに追加します。
    3. 5-10 × 10⁶セル/ml 培 4.8 の手順に記載されている 1 つのように肝細胞濃度を調整します。
    4. 各 24 mL の円錐形を含む SIP に細胞懸濁液 25 mL を加え、穏やかな逆転によって混ぜます。このソリューションの密度は 1.06 g/mL です。
    5. 4 ° C で 10 分間 50 x g で円錐形遠心します。
    6. SIP および凝集剤、吸引し、HBSS で細胞を再懸濁します。
    7. 4 ° C で 10 分間 50 × g で遠心分離によって細胞を洗浄します。
    8. 4.10.6 の手順をもう一度繰り返すし、培地に細胞を再懸濁します。

5 秒の浄化

1. チューブから清 163 x g で 10 分間破棄でチューブを回すことによってステップ 4.6 から上清中に細胞をペレットし RPMI の 5 mL の血清なしですべて細胞ペレットの再懸濁します、1 つの管でそれらを一緒に分かち合います。
2. 一度、すべてのペレットはプールされている、35 mL の最終巻に RPMI を追加します。
3. 遠心分離機のプールされた 3 分慎重に吸引 RPMI のトップ 25 mL 25 mL ピペットと場所で氷の円錐形クリーン 50 mL で Npc を含むこのメディアの 25 x g で円錐形。
4. 新鮮な RPMI 25 mL をチューブに追加し、ペレットを再懸濁します。
5. ステップ 5.3 第 2 洗浄、プール上清に対して繰り返します。メディアとペレット (ペレットは死んだ肝細胞のほとんどで構成されています) の 10 mL の残りを破棄します。10 分間 163 x g でプールされた上澄みを遠心します。
6. 、遠心分離中に 50 mL の円錐形の PVP ソリューション グラデーションを準備します。
7. Percoll はかぶせて射出速度をできるだけ遅く設定 pipettor 25 %20 mL に続いて 50 %pvp 溶液を 50 mL の円錐形の 15 mL を追加します。必ずこれは秒と株式会社ケーシーエスは、遠心分離後集計されます 2 つのレイヤーを設定する 15 mL マークで屈折線を観察してください。
8. PVP ソリューション グラデーションにそれらをオーバーレイやセル以前冷たい RPMI ステップ 5.5 の 10 mL にペレットを再懸濁します。必ず 2 つの層の間に明確な分界を維持してください。50% で設定のブレーキを 20 分間 805 x g でグラデーションを遠心します。
9. チューブに 20 ミリリットルのマークを上下方向から吸引し、この素材を破棄します。5 mL 転送ピペットと秒と 25/50% インターフェイスにある KCs を収集します。死んだ肝細胞は、これらのセルのいずれかの茶色の塊を破棄します。
10. 円錐 50 mL にセルを配置し、PVP 溶液を希釈する 50 mL マークまで RPMI を追加します。80% のブレーキを 10 分間、200 × g で遠心分離機します。
11. 吸引し上澄みを廃棄し、暖かい RPMI 12 mL の円錐形のコーンを洗いながらペレットを再懸濁します。
12. 株式会社ケーシーエスからポリスチレン シャーレで培養上清を配置することによって、秒を分離し、室温で 8 分加湿培養孵卵器で孵化させなさい。
13. プレートに準拠して、株式会社ケーシーエスながら残りの秒を収集する最低速度設定 pipettor で、同じメディアでプレート 25 mL ピペットとリンスでメディアを吸い出しなさい。
14. 10 分間 200 x g で秒を遠心し、FBS + ペン/連鎖球菌 RPMI + 5% で再懸濁します。価、細胞とコラーゲン被覆培養皿の場所。

結果

肝灌流および肝細胞と秒の精製・濃縮物、洗練された方法がここで紹介は最適な細胞浄化/濃縮参照これでコンパイルされた他の印刷されたレポートと同様の詳細なヒントを提供します。⁵を確認します。細胞の浄化のための成功を決定する重要なステップ ルートとコラゲナーゼ灌流手順の技術的な詳細は、このプロトコルに記載されて.装置のセットアップはかなりシンプルで標準的な実験装置、公開された¹¹ (図 1) をされている他のシステムとは対照的に費用対効果です。このセットアップにマウスを保持しているトレイは肝臓内灌液体の温度を維持するために風呂の水で余分な管のいくつかと風呂の水に座っています。ここで示すように、装置は、ラット肝灌流¹² (図 2) のわずかに異なるジオメトリを持つマウスとラットの使用可能性があります。

この手順で肝臓は腹部内のアクセスの容易さのため下大静脈 (別の人気のある血流経路である) のではなく門脈を介して灌流や静脈が肝臓に直接フィード。ビューアーは、門脈が出納、短絡の可能性がありますいくつかの小枝と過去の最適な成功¹³ (図 3) のこれらの枝カテーテルを配置する必要がありますに注意してくださいする必要があります。門脈を識別、カーブタイプ鉗子肝と膵十二指腸静脈の外科的縫合または門脈下にポリエステル糸を描画に使用されます。鉗子は、肯定的な血圧 (図 4A) 下にある門脈をまっすぐにも使用されます。並列と静脈 (図 4B) の横にあるカテーテル内の針を配置する必要があります (図 4C) 静脈の内腔にベベルを優しく挿入する.適切な配置は、カテーテルに沿って現われる血によって示されます。針が取り消されるそれにより金縛りスレッドにカテーテルが安定した、血圧はカテーテルを通してを血液を強制的します。血がこぼれる (図 4D) 前に、カテーテルがポンプ用チューブに接続することをお勧めします。ポンプ用チューブを接続すると、すぐに上大静脈や腹部大動脈に血液/液ドレナージ法 (図 5A) の主要な血管をカットします。通常腹部の血液の蓄積が難しく灌流プロセスを可視化すると血液が細胞精製 (図 5 に引き継ぐかもしれない十分な排水のためマウスの腹部壁の側をカットする必要があります。B)。 肝臓、血液 (図 5C) の有無と湯通し肝灌流を開始する、PBS。場合にのみいくつかの葉を湯通し、原因はカテーテルを肝臓の中のあまりにも遠い配置されているゆっくりバックアップする必要があります。カテーテルの位置を確認すると、場所にチューブを保護するのに耐水性のマスキング テープを使用します。総合研究所のテープは通常十分ではありません。カテーテルの適切な配置を確認するため排水を中止し、肝臓内の圧力が増加を観察するカットの血管を圧迫します。肝臓 (図 5D) から血をフラッシュに役立ちますこれを行います。これは、コラゲナーゼの解決は当初すべての葉が、コラゲナーゼにさらされていることを確保するため肝臓に入るときにも行ってください。後、コラゲナーゼ ソリューションは良いコラゲナーゼの消化力は実質、グリソン鞘の分離による示唆されて、実行されます。

細胞浄化の一般的な手順の概要を図6 と図 7で肝細胞収穫している初期の段階での手順で低速時に回転し、4 BSA を含むバッファー (図 8 できれいに洗浄した後、非常に純粋です).秒は共同 PVP グラデーション (図 9A) 株式会社ケーシーエスに精製した、コラーゲン被覆ポリスチレン シャーレに選択的な接着で、区切られました。このメソッドを使用して秒の純度 83 90% 純粋なであり主にコラゲナーゼの消化力 (図 9B) の全体的な効果に依存します。光を用いた定量的測定顕微鏡 (として、肝細胞と秒他のセルからの区別の特徴がある) を示す代表的な準備で肝細胞は、ほぼ 100% 純粋な秒わずか 89% 純粋な (表 1)。また、本プロトコルの範囲外ですが、PVP グラデーション後磁気列分離秒の高い濃縮を得られるかもしれない。秒、KCs の磁気分離の詳細については、マイヤーらにあります。⁹と劉ら¹⁴それ忘れてはならない肝細胞の生存率が不十分な消化肝臓で急速に減るが、これは Npc が不十分な消化肝臓も生産は完全により細胞の残骸の必要な真実ではないです。遠心分離の手順で除去。

図 1: 灌流スイートの略図。フラスコはクランプ (図示せず); によって行わをれています。チューブを含む液を 1 L フラスコからプロシージャの間に 125 mL フラスコにスワップは、赤い点線で表されます。ノートでは、酸素の供給が、フラスコ内のソリューションに直接通知しません。コルクを切り込みの中に挿入するチューブで静電流体の流れを許可する切欠もする必要があります。これは、チューブとチューブ内のすべての空気の排出のためのウォーム アップ中に重要です。エア抜きは、タイゴン チューブおよびクイック オープン ピンチ クランプ システムの閉鎖に接続して T コネクタで構成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マウス肝灌灌流スイート。マウスでトレイは、風呂の水の隅に配置されます。既にウォーム アップ中に酸素として、酸素はコラゲナーゼ溶液から切断されます。項目の場所が A) 酸素ライン、PBS、コラゲナーゼ、ポンプ D)、E) ポンプ コントロール、F) バブル トラップ、ポンプを経由してマウスに、フラスコから G) 流体ラインとバッファー 2 を含む C) 125 mL フラスコを含む B) 1 L フラスコ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: マウスの腹部の血管のイメージ。門脈 (緑の点) をオフに来て胃と膵静脈接合のすぐ下のカテーテルの挿入、先端が左と右肝ポータル静脈 (黄色の点) 肝臓の主な葉にフォークを形作る近くに配置する必要があります。一度正しい配置を達成すると、カテーテルは単純なオーバーハンド ノットを使用するスレッドと安定させてください。K = L 腎臓肝臓、SI を = = 小腸。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 門脈内カテーテル留置。(A) 門脈の血液のうっ血、静脈カテーテル留置のまっすぐに鉗子を使用します。(B) カテーテルが並んでベベル門脈と並行しています。(C) カテーテル内の針の傾斜面は、静脈ではなく、静脈に挿入されます。(D) カテーテルの針が取り消され、鉗子の先端によって示されるように、血がカテーテルを逆流。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 適切な肝灌流します。(A) 後カテーテル留置、カテーテルのルアーロック牝ルアーのオス側 (1 mL 注射器から切り取り) ポンプ用チューブに接続しています。(B) 主要な下降血管、血および PBS の切削もう一つ、ハサミでマウスの側をスライスして腹部から排水後。(C) 肝臓は、血を洗い流すし、(D) が鉗子で圧迫シャット ダウン カット血管でプレッシャーを受けると膨らむ湯通しする必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6: 肝細胞の精製と単離 NPC の概略します。遠心分離の手順のほとんどは、非実質細胞からライブとデッドの肝細胞を削除を目指しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 7: 秒濃縮と精製の概略します。Npc は、標準ポリスチレン板に短い付着による SEC 分離に続く PVP グラデーションで区切られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 8: 肝細胞を精製します。肝細胞は DMEM + 8 %fbs + ペン/連鎖球菌性コラーゲンをコーティングした培養プレートにメッキされ、400 倍で顕微鏡による画像コレクションに続いて 6 時間培養します。バーに等しい 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 9: 秒浄化します。(A) 秒と株式会社ケーシーエス 25/50 %pvp インターフェイス (黄色の矢印) から採取した無血清培地で洗浄します。(B)、秒標準シャーレの選択的接着性によって、株式会社ケーシーエスから分離、洗浄、RPMI + 5% コラーゲン被覆ティッシュの培養皿上メッキ FBS。400 X EVOS 倒立顕微鏡による撮影を行った。バーに等しい 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 10: マウス肝の解剖学の走査電顕。マウス肝組織がスライスされた PBS の 4 分の 1 mL/分の割合で固定液 (100 mM ナトリウム cacodylate、12 mL 25% グルタルアルデヒド、15.6 mL 16% パラホルムアルデヒド、2.65 mM 塩化カルシウム、100 mL の溶液に混合 180.2 mM ショ糖) が続くと、走査電子顕微鏡観察のために準備。10、電界放出 sem 画像を採取した 000 X。黄色の矢印は、肝細胞の微絨毛を示します。バーに等しい 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 11: デッド対ライブ肝細胞の可視化します。2 洗浄バッファー 1 後、小球形にされた肝細胞は目でライブ/死亡比の評価があります。(左) 軽いペレットは、半分以上の肝細胞が死んでいることを示します。右側の暗いペレットが管の底にペレットよりしっかりとは、90% 以上が住んでいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 細胞精製
セルの種類	% 標的細胞	% 他のセル
肝細胞	99	1
Sinsusoidal 血管内皮細胞	89.1	10.9

表 1: 光顕微鏡による細胞純度の評価。

ディスカッション

このプロトコルは、ツール、使用可能なことができるこの手順で成功率が高いを強調表示します。成功した灌流は、一次電池の使用任意のダウン ストリーム アプリケーションの基本的なです。

プロシージャの成功を決定するいくつかの重要なステップがあります。まず、門脈内カテーテル先端の位置が正しくなければなりません。肝臓の中のあまりにも遠い場合、マイナーローブだけは潅流します。先端は、門脈の右と左の枝のすぐ下にする必要があります。針上高分子複合カテーテルを使用しての利点は、針のバーブは灌カテーテルよりも静脈を破棄する可能性が高いです。第二に、コラゲナーゼの質と量は、肝臓の消化効率を決定します。この手順で事前に認定コラゲナーゼ タイプ 4 が使用され、それに試金するコラゲナーゼが 900 IU を超える場合バッファー 2 で 0.5 mg/mL で再停止されます。

コラゲナーゼ灌流末、肝臓茶色の色にやや暗い日焼け保持する必要があります。淡褐色の色の場合は、肝細胞のほとんどは死んでいます。肝臓がときにマウスからカットが離れて落下する必要があります。最高の条件でを小さなスプーンでマウスの体腔から肝臓えぐる。この状態で肝臓は常に非常に高い細胞生存率を与えます。抽出、中に肝臓がまだしっかりした場合を離れて、細胞を振る手間がかかる場合、またはフィルターを通して肝細胞の移動に必要な力の多くがある場合、肝細胞の間で発芽率が低いが与えられます。肝細胞は、非常に高い表面積 (図 10) を持っていることができる絨毛で覆われています。不完全な消化力保持、肝細胞の間細胞の接合と機械的剪断、プラズマ膜を離れて引き裂きます。コラゲナーゼと上皮内の灌流は、セルを分解し、高い生存率を維持する最善の方法です。図 11、細胞ペレットを準備される 2 つの肝細胞は、いくつかのバッファー 1 で洗浄後を比較しました。左側のペレットは軽く、約 50% の細胞生存率が含まれています。右側のペレットは暗いで、92% の生存率。同様に、50 mL の円錐形から液体が注がれるとき暗いペレットは液体を注がとして管内スライド ライターのペレットと対照をなして、チューブ内で静止。肝臓の多発性硬化症のレベルが高いとき、低いセル実行可能性または非効率的な perfusions が発生します。

ライブ肝細胞が死んだ肝細胞より高い密度を持っているので、遠心分離手順は実行可能な肝細胞¹⁵で高純度、準備になります。ライブ死んだ肝細胞は (しばしば発生する条件が最適ではない場合) のかなりの量があるされていると細胞がさらに豊かに、PVP のグラデーションを使用して死んだ細胞から分離します。さらに、以来、ライブ肝細胞ペレット死んだ肝細胞よりも速く、ペレットのトップの 3^rdの吸引は死んだ細胞ペレットにするライブの比にも増加します。これらのプロシージャはクイックと分離する簡単な方法は死んだ肝細胞から住み、必要なときの破片の細胞^10,16。これは、サンプルが貴重な場合は、だけで数百万セルが実験に必要な便利です。

結論としては、肝臓から肝細胞と秒を収穫するための簡単で効率的な方法です。現在の価格ですべての試薬、消耗品を含むこの手順を実行するコストは準備あたり 75 us ドル未満です。複数のマウスを使いたい場合は、肝細胞の浄化を進めるし、すべてのマウスが処理されるまで、氷の上 NPC の一部を維持することをお勧めします。少なくとも 5 時間氷の上 Npc が一般的に安定しているが、この研究室でテストされていない時間が長くなります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
250 mL Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
silicone tubing	Cole-Parmer	96400-14	This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter.
Tygon tubing	Fisher Scientific	R3603	Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector.  This may also be used for the oxygen tubing.
T-connectors	Cole-Parmer	EW-06294-82
Quick dissconnects	Fisher Scientific	6150-0010
Pinch Clamps	Fisher Scientific	6165-0002
Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Periplastic pump with variable speed
Pump head, model 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
glass graduated 1.0 mL pipettes	Fisher Scientific	13-678
curved non-serrated scissors	Fine Science Tools	14069-12
Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Curved forceps	Fine Science Tools	13009-12
10 mL syringe	Fisher Scientific	03-377-23	Only barrel of syringe will be needed
sterlized spoon	Home supply store
Cotton ball(s)	Home supply store
Polyester sewing thread	Home supply store
Masking tape	Home supply store
thumb tacks	Home supply store
styrofoam pad	50 mL conical rack
cookie/baking sheet	Home supply store
Absorbant underpads	Fisher Scientific	14-206-64
19 L water bath	Fisher Scientific	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage	Becton Dickinson	381412	Plastic cathetar with retractable needle
Crystallizing dishes 100x50	VWR	89000-290
Polystyrene petri dishes	Sigma Aldrich	P5481-500EA
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	12-565-270
graduated pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	170355
graduated pipettes (25 mL)	Fisher Scientific	170357
EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	542000	100 μm filter
EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	542040	40μm filter
Sterile transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-20
Refrigerated swinging bucket centrifuge	Sorvall Legend XTR	75-217-406	Centrifuge with swinging bucket rotar
Galaxy 170R tissue culture incubator	Eppendorf	CO170R-120-0000	Humidified tissue culture incubator
Reagents
Name	Compound	Grams (g/L)	Millimolar (mM)
Buffer 1, pH 7.4	NaCl	8.3	142
	KCl	0.5	6.7
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
Buffer 2, pH 7.4	NaCl	3.9	66.74
	KCl	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	HEPES	24	100
	BSA	15	0.226
	Phenol Red	0.01	0.03
Buffer 3, pH 7.4	NaCl	8	137
	KCl	0.35	4.7
	MgSO4	0.08	0.66
	CaCl2	0.18	1.62
	HEPES	2.4	10
	BSA	15	0.226
PBS, pH 7.4	NaCl	8	137
	KCl	0.2	2.7
	Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
	KH2PO4	0.2	1.4
Other reagents
Name	Company	Catalog Number	Comments
Percoll (PVP solution)	GE Healthcare	288555
Collagenase Type IV	Sigma Aldrich	C5138
Isoflurane	Abcam	ab144581
Hepatocyte Growth Medium
DMEM	Gibco	11965118
10% by volume fetal bovine serum	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148
Long-term Hepatocyte Growth Medium
DMEM
10% by volume fetal bovine serum	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148
Glucagon	Sigma	G3157-2mg	14 ng/mL
Insulin	Sigma	I9278-5mL	0.5 U/mL
Hydrocortisone	Sigma	H0888-1g	7.5 mg/mL
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354001-100ug	20 ng/mL
LSEC medium
RPMI	Gibco	11875119
10% by volume fetal bovine serum	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148