Использование 18F-ФДГ ПЭТ/КТ и количественных гистология для измерения динамического изменения в метаболизме глюкозы в моделях мыши рака легких

Резюме

В этом протоколе мы опишем, как использовать [¹⁸F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose позитронно-эмиссионная томография и компьютерная томография (¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ) изображений для измерения опухоли метаболический ответ для целенаправленной терапии MLN0128 в Крас/Lkb1 мутант мыши модель рака легких и спаренных изображений с высоким разрешением ex vivo авторадиографии и количественных гистологии.

Аннотация

Отличительной чертой современных опухолей является переход к аэробного гликолиза, который легко измеряется [¹⁸F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose позитронно-эмиссионная томография (¹⁸F-ФДГ-ПЭТ) изображений. Совместное мутации в LKB1 ген-супрессор опухолевого и КАРСТЕ протоонкоген являются частые события в рак легких, которые привод hypermetabolic, гликолитических опухолевого роста. Критический путь регулирования роста и метаболизма этих опухолей является механистический цель rapamycin (mTOR) путь, который можно эффективно пристрелть с помощью селективного каталитического mTOR ингибитора киназы. MTOR ингибитор MLN0128 подавляет гликолиза в мышей, принимая опухоли с Lkb1 и карсте совместно мутации, именуемые KL мышей. Терапии реакции в KL мышей сначала измеряется ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ и компьютерная томография (КТ) изображений до и после родов MLN0128. Используя ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ, исследователи имеют возможность измерять динамические изменения в метаболизме глюкозы в генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) после терапевтического вмешательства с целевой терапии рака легких. Это сопровождается ex vivo авторадиографии и анализа количественных иммуногистохимический (qIHC), с помощью морфометрического программного обеспечения. Использование qIHC позволяет обнаружения и количественного определения различных изменений в профилях биомаркер после лечения, а также характеристика опухоли различных патологий. Муфта PET изображений для количественных гистология является эффективной стратегией для выявления метаболических и терапевтические реакции в естественных условиях в моделях мыши заболеваний.

Введение

Наши исследования были направлены на расследование и ориентации рака с мутациями в печени киназы B1 (LKB1, также упоминается как STK11) мутант рака¹. LKB1 является основной опухоли, подавляет mTOR комплекс 1 (mTORC1) через активацию киназа AMP (AMPK) приводит к регуляции роста и метаболизма. Таким образом потери LKB1 приводит к необузданный mTORC1, активация результирующей HIF1-альфа в гликолитических метаболического фенотипа, обычно называют Варбург эффект^2,3,4. LKB1 инактивирующего мутации непосредственно приводят к развитию синдрома редкой формой рака семейная предрасположенность, известна как синдром Пейтца-Турена, поэтому (PJS), которая характеризуется развитием полипов доброкачественные желудочно-кишечного тракта, известный как гамартомы^{5 , 6 , 7}. Кроме того, LKB1 часто совместно мутирует с онкогенных крас, что приводит к hypermetabolic и агрессивных легкое человека опухоли^8,9.

Заболеваний, связанных с Lkb1 легко моделируются в мышах. Гетерозиготных инактивирование Lkb1 в мышах приводит к развитию гамартомы точно моделирования PJS^10,11,12,13. Кроме того Lkb1 мутации, которые легко моделируются в мышей, точно охарактеризовать фенотипу рака легких, кожи, поджелудочной железы и груди¹⁴. Совместное мутация крас/Lkb1 в легочной ткани трансгенных мышей, используя Cre рекомбиназа опосредованной активации онкогенных крас^G12D аллели и biallelic исключить Lkb1, приводит к образованию опухолей легких агрессивным и метастатическим^{15 ,16}. Характеристика крас^G12D; Lkb1^{- / -} опухоли легких (KL), изолированных от мышей показывает, эти опухоли имеют высокий mTORC1 активации и высоко гликолитических, используя обе прямые метаболит измерения глюкозы и лактата или измерения потребления [¹⁸F] -2- Фтор-2-deoxy-D-глюкоза (¹⁸F-ФДГ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) с компьютерная томография (КТ) ¹⁷. MTORC1 гипер активации в LKB1 мутант опухоли обеспечивает четкое обоснование для тестирования как аллостерический и каталитического киназы ингибиторов mTOR для лечения этих видов рака.

В предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что аллостерический mTORC1 ингибитор rapamycin (рапа) успешно препятствует росту и гликолиз опухоли желудочно-кишечного (GI), с использованием Lkb1^{+ /} трансгенные мыши модели PJS³. Рапа в настоящее время утверждена в качестве единого агента терапии для лечения почечно-клеточной карциномы но показал ограниченной эффективности в НМРЛ^18,19,20. Рапа является ингибитором аллостерический mTORC1 и могут быть улучшены путем развития ингибитора киназы каталитического mTOR следующего поколения, которые обеспечивают более почти полном торможении mTOR комплексов, 1 и 2 (mTORC1 и mTORC2, соответственно)²¹. Наркотики, такие как MLN0128 в настоящее время оцениваются в доклинических исследований и ранней стадии клинических испытаний^22,23. Недавнее исследование от нашей лаборатории показали, что MLN0128 является мощным mTOR ингибитора в легкое человека опухоли клеточных линий и в естественных условиях в KL GEMMs легких Рак^15,16. MLN0128 подавлены опухоли легких роста и глюкозы обменные процессы в этих мышей²⁴.

В этом исследовании мы воспользоваться хорошо изученных аденовирусных Cre индуцированной мыши модели рака легких, инициированных условно активированные Lox-стоп-Lox-крас^G12D онкогена^15,25. Эти крас^G12D мышей были скрещены с мышами, имея floxed аллели Lkb1 (Lkb1^L/L) для создания крас^G12D; Lkb1^L/L (KL) мышах¹⁶. После интраназального доставки адено - или человека, выражая рекомбиназа Cre KL мышей разработать ранних поражений по индукции опухоли после 4 недель. 6 недель, опухоли в KL мышей переход от аденоматозный опухоли более злокачественной, агрессивные опухоли фенотип типичной карциномы лёгких и 8-10 недель мышей развивать откровенный карциномы с 100% пенетрантностью^16,26.

Обе ПЭТ/КТ изображений и количественные иммуногистохимия могут быть использованы для определения молекулярной и метаболических реакций, а также терапевтического ответы в опухоли после доставки целевых терапии, такие как^, MLN0128^{17 26,27}. Описанные здесь экспериментальный протокол, который использует ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ изображений для измерения метаболический ответ на MLN0128-целевой терапии. Муфта PET изображений с количественным гистология позволяет измерения молекулярной реакции на mTOR торможение, а также количественная оценка бремени опухоли и опухоли Гистологическая картина.

протокол

Все процедуры, описанные в протоколе были одобрены институционального ухода за животными и использовать Комитет (IACUC) в университете Калифорнии, Лос-Анджелес.

1. ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ и КТ визуализации в мышей

Предупреждение: Используйте защитное снаряжение при обработке радиоактивности. Выполните все применимые нормативные процедуры, при обработке радиоактивности.

1. Место клетка с мышей, чтобы быть imaged на теплой постели при 37 ° C 1 h до ¹⁸F-ФДГ инъекции для снижения потребления бурого жира ¹⁸F-ФДГ.
   Примечание: Пост мышей для 4-16 h может помочь уменьшить миокарда потребление ¹⁸F-ФДГ.
2. Весят мыши и записывать его вес.
3. Анестезировать мыши, с помощью изофлюрановая 2-3% в кислороде на 0,5 - 2 Л/мин на 2-3 мин, с использованием анестезии палата хранится при температуре 37 ° C. Убедитесь, что мышь была наркоз, защемления ног; реакции не будет отмечено, если мышь была наркозом. Применить глазной мази в глаза, чтобы предотвратить любой сухости во время анестезии.
4. Разбавьте ¹⁸F-FDG (109 мин радиоактивное полувыведение) в стерильного физиологического раствора на скорректированные распада исправлены инъекции концентрации 70-75 Μки/100 мкл.
   Примечание: Последующие дозы рекомендуется ¹⁸F PET сканер производителя для оптимального сканер изображений.
5. Нарисуйте Μки 70-75 с инсулина шприц с иглой 28 G, измерения дозы радиоактивности, с помощью калибратора дозы и записывать измерения и время. Поместите шприц в держатель шприц свинца.
   Примечание: Количество радиоактивности ¹⁸F-ФДГ в каждой дозы измеряется с дозы калибратор, который откалиброван против стандартным справочным материалом, например цезия-137, по словам производителя протоколы. Время чтения также записывается для определения кариеса коррекции.
6. Укол дистального конца хвост мыши и измерения уровня глюкозы в крови мыши с глюкометр.
7. Теплый хвоста для 1-2 мин с марлей смоченной в теплой воде. Протрите хвост с 70% изопропиловый спирт для расширения вен хвост только до инъекции. Управлять 100 мкл ¹⁸F-FDG (весь объем в шприце) с болюсным инъекции через боковые хвост вен и записывать время инъекции. Измерить оставшиеся дозу в шприц с помощью калибратора дозы и записать измерения и время.
   Примечание: Там будет некоторое количество зонд слева в шприц. Использование инсулиновые шприцы предпочтительнее шприцы, подключенных к иглы через Luer блокировки из-за снижение количества захваченных в иглу шприца после ведении инъекций доза.
8. Поместите курсор мыши введенный в зале анестезии, под изофлюрановая 1,5-2% при 37 ° C разрешить зонд быть распределенными через мышь кровообращения за 1 ч до ПЭТ-сканирование.
   Примечание: Это может быть полезно аннулировать мочевого пузыря до начала сканирования позволяет легче ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ визуализация опухолей, имплантированных в нижних склонах мыши.
9. Через 1 ч поместите указатель мыши в тепловизионной камере под нос конус изофлюрановая анестезии и при 37 ° C и обеспечить его конечностей, в месте с медицинской лентой в лежачем положении.
10. Место тепловизионные камеры в ПЭТ/КТ-сканера.
11. Приобрести ПЭТ и КТ сканирования, как описано в PET/CT сканер ручной²⁸.
    Примечание: PET изображений приобретаются для 600 s с окном энергии 150-650 кэВ, реконструирован с помощью максимизации ожидания максимального правдоподобия с исправлениями для ФОТОН затухания, детектор нормализации и радиоизотопной распада (точечной коррекции был не применяется). КТ изображения приобретаются в непрерывном режиме для 50 s с использованием 50 kVp, 200 МКА источник рентгеновского излучения и плоских детектор и они восстанавливаются с использованием алгоритма Feldkamp.
12. После завершения PET/CT, удалите мышь из тепловизионной камеры и позволить ему восстановить в своей клетке. Монитор мыши до тех пор, пока он полностью сознание и может поддерживать грудной recumbency.
13. Импортируйте Восстановленный ПЭТ/КТ изображений в Амида программного обеспечения, нажав файл, затем Открытьи выберите соответствующий файл.
14. Преобразовать данные Питомца к группе вводили % дозы за грамм (%ID/g), введя дозу во время инъекции, после учета любых остаточных дозу в шприц, или на единицу стоимости стандартизированных поглощения (Внедорожник), дополнительно указав субъекта вес. Чтобы сделать это, щелкните правой кнопкой мыши набор данных PET и найдите поле %ID/g на вкладке Основная информация введите %ID/g Записанная ранее.
15. Нарисуйте регионы интерес (ROI) на опухоли и нормальных тканях (печень, мышцы, легких, сердца, мозга и подкожной жировой клетчатки). Чтобы сделать это, нажмите на редактировать, выберите Добавить ROI, выберите ROI форму и назовите ROI. Нарисуйте ROIs опухолей и тканей и корректировать свои размеры для покрытия ткани интерес всех трех осей.
    Примечание: Для учета различий в накопление ПЭТ зонда между животными, опухоли ROI значения могут быть далее нормированы ROI значения печени, хорошо перфузии орган с минимальными гликолитических деятельности, представляющих ¹⁸F-ФДГ в обращении. Анализ ROI опухолевых и нормальных тканей выполняются на том же мыши. Легкого опухолевые поражения обычно определяются по ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ с ¹⁸F-ФДГ удержания в обычных легких является относительно низким. CT используется также для выявления поражений, особенно поражений, которые являются ¹⁸F-ФДГ не жадный. Анализ ex vivo изолированных легких также помогает локализовать опухолевых поражений.

2. ¹⁸F-ФДГ авторадиографии

1. Подготовьте мышь для изображений с ¹⁸F-ФДГ, выполните шаги 1.1-1.12, за исключением теперь, разбавляют ¹⁸F-ФДГ в стерильных физиологического раствора в концентрации скорректированные распада исправлены инъекции 1000 Μки/200 мкл.
   Примечание: Более высокие дозы ¹⁸F-ФДГ используются для авторадиографии для учета дополнительной выборки, обработки время и оптимального обнаружения плитами фосфора.
2. Усыпить мыши через смертоносных ингаляции изофлюрановая на 5% или CO₂ (процедура утверждения IACUC).
   Примечание: Шейки матки вывих не должны использоваться как это может повредить легочной ткани.
3. Поймать мышь с вентральной поверхности и распылить его с 70% этанола для мат вниз свои волосы до разрез.
4. Откройте грудной полости, применяя срединной линии разреза, убирания диафрагмы и удаления грудной стенки. Разоблачить трахеи, тщательно удалив слюнной железы. Место бульдог зажим на трахею как близко к челюсти как можно скорее, обеспечивая плотное прилегание на трахею. Место иглой 23 G придает шприц 3 мл внутри трахеи ниже бульдог зажим и придать ~ 2 мл OCT:PBS (1:1) (оптимальное резки температура: фосфат буферизации) физраствора.
   Примечание: OCT очень вязкой и смешивается с PBS для легче инъекций в легкие.
5. Удалите иглу из трахеи и использовать щипцы для зажима на точке впрыска для предотвращения любой утечки OCT:PBS решения.
6. Тщательно удалить легкие из грудной полости и отдельные левой доли от остальной части легких. Место левой доли в обозначенные cryomold заполнены с несколькими каплями OCT. После легких доли внутри формы, заполните cryomold на вершину с октября.
7. Повторите ту же процедуру с правой половине легких.
   Примечание: Если сигнал ¹⁸F-ФДГ в сердце, как ожидается, будет высокой или опухоли легких расположены близко к сердцу, она может быть полезной для удаления сердце для того, чтобы предотвратить утечку трассирующими. Кроме того весь легких может быть встроен в один cryomold. Важно избежать воздушных пузырей при работе с Окт.
8. Использование длинный пинцет, место подготовленные cryomold в контейнере закрытыми порами экструдированного пенополистирола, содержащие смесь сухого льда и изопентана.
   Примечание: Эта смесь должна быть в приблизительно-70 ° C до размещения в нем cryomold для замораживания. После закалки, октября соединения станут белыми. Если несколько образцов обрабатываются в то же время, замороженных образцов в OCT cryomolds может временно хранится на сухой лед.
9. Удаление замороженных блоков из cryomold и смонтировать его на криостат для разрезания. Раздел блока при толщине 4 мкм с использованием микротомных лезвий (34°/80 мм, высокий профиль). Переноса разделов ткани на слайде стекла, который был сохранен при комнатной температуре.
10. Поместите образец слайдов на люминофор изображений пластины. Установите пластину в кассету и аккуратно закройте его для предотвращения слайды от ветра. Храните кассеты в морозильной камере-20 ° C для экспозиции пластины, обычно на ночь.
    Примечание: Пластинки и кассеты должны быть предварительно охлажденным до-20 ° C перед использованием. Размещение образцов-80 ° c также является приемлемым.
11. После экспозиции удалите слайды с плиты и читать пластину на изображение читателя.
12. Слайды можно завернутый в полиэтиленовую пленку и хранятся при температуре-80 ° C, или они могут быть подготовлены для гематоксилином и эозином или иммуногистохимия.

3. заготовка легочной ткани для гистологии

1. Выполните шаги 2.2-2.4, за исключением теперь, вместо того, чтобы с помощью решения OCT:PBS, придать мл 2-3 обычных буферизации формалина 10% исправить легких.
2. Удалите иглу из трахеи и использовать щипцы для зажима на точке впрыска для предотвращения любой утечки формалин. Тщательно удалить легкие из грудной полости и поместите их в конической Тюбик 50 мл, содержащие ~ 20 мл 10% нормальной буферизации формалином для 16-24 ч для обеспечения полной фиксации.
   Примечание: Крепление легких позволяет для сохранения оптимальной анатомических особенностей.
3. На следующий день, передача фиксированного легких от формалин на 70% этиловом спирте и подготовить в легкие, чтобы быть помещены в ткани кассету.
4. Подготовьте легких для гистологии, тщательно рассекает лопастями, используя ножницы сократить в филиал точках между 5 лопастями, пронумерованы 1-5, как показано на рис. 1Dи поместите их в non перекроя ориентации в ткани кассету. Осторожно поместите пенопластовая прокладка на легочной ткани, чтобы сохранить ориентацию нетронутыми.
5. Храните расчлененных легких лопастями в 70% этанол до встраивания парафина.
6. Парафин внедрить ткани в кассетах и нарезать 4 µm толщиной секции для окрашивания, с использованием стандартных процедур.

4. ткань сегментации и количественная оценка с использованием коммерческого программного обеспечения

1. Изображения гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных легких секций на 1,25 кратном увеличении с помощью коммерческого многоспектральных изображений системы.
2. Конвертировать изображения в кубики цифровых изображений и загружать готовые спектральной библиотеки (нажмите на файл, а затем загрузить спектральнойбиблиотеки) для H & E.
   Примечание: Спектральной библиотеки были разработаны заранее путем приобретения спектральных изображений от поодиночке окрашенных легких секций, одна секция, окрашенных только с эозином и другой только окрашивали гематоксилином, которые были сохранены в несвободных спектральных библиотеке открытым исходным кодом файл (.csl). Система электронного фотографирования имеет операционной программного обеспечения, которое приобретает изображение на каждой длине волны, которая необходима (как определено в протоколе приобретения). Эти изображения («изображение куб») хранятся в формате открытым исходным кодом несвободных многоспектральных файла (.im3). Спектры извлекаются из изображения Куба с помощью морфометрического программного обеспечения и хранятся в файлах отдельных спектральной библиотеки.
3. Спектрально unmix псевдо-цветные H & E изображения всей легких, нажав на кнопку Unmix .
   Примечание: Расслоение занимает менее 1 s. Количество точек в каждом типе ткани были количественно с помощью морфометрического анализа изображений программное обеспечение.
4. Визуализация каждого изображения Куба путем преобразования данные многоспектральных наблюдений в эквивалентный 3-цвета (красный, зеленый, синий) изображения используя ответ зависит от длины волны цвета глаз, convolved с интенсивностью каждого изображения.
   Примечание: Результате 3 изображения отображаются в виде стандартных 24-битный цвет изображения.
5. Псевдо-цвет каждого несмешанных изображения путем масштабирования изображения в пользователь выбран цвет (например, красный, зеленый, фиолетовый, и т.д.) и добавить, что вместе с псевдо-цветные несмешанных изображений в один из стандартных 24-битный цвет изображения.
6. Используйте параметры по умолчанию для всех анализов.
   Примечание: В целом, поскольку этот вид сегментации опирается на визуальной оценки результатов (т.е., оценку как хорошо сегментации изображений вне обучения набора работ), важно правильно разделить образы на обучение, испытания и проверки наборы.
7. Начните с 2-3 изображения как обучающий набор (10-15 для человека биопсия), поезд на тех, кто до тех пор, пока результаты хорошо выглядеть и затем применить этот алгоритм в другой 2-3 изображения. Затем примените итоговый алгоритм для проверки полного набора.
   Примечание: Скорее всего, некоторые переподготовки будут необходимы.
8. Анализировать области опухоли в секции всего легкого, подсчет общей пикселей для красных псевдо-цветные опухоли в долях 1-5 каждой мыши.
   Примечание: Нормальные ткани был псевдо-цветной зеленый и крови/судов были псевдо-цветные розовый, как показано на рисунке 3. Средняя опухоли бремя для каждой группе лечения была рассчитана путем измерять количество всего пикселей для каждой мыши в группе лечения.

Результаты

¹⁸ F-ФДГ-ПЭТ томография была выполнена на KL мышей и продемонстрировал, что опухоли в этих мышей были весьма гликолитических, как показано на повышенных ¹⁸F-ФДГ потребления (рис. 1А), соглашаясь с ранее опубликованных исследований^{26, 29}. Резекция легких целом показали наличие нескольких опухолей (рис. 1Б). Легкие мыши может быть разделен на 5 отдельных лепестков, представленные цифры 1 c и 1 D. Лепестки 1-5 были помечены на секционного легких, которые были окрашены с H & E или глюкозы транспортер 1 (Glut1) (рис. 1D). Glut1 является основным транспортера глюкозы и ¹⁸F-ФДГ и его выражение и локализации на плазматической мембраны опухолевых клеток напрямую коррелирует с ¹⁸F-ФДГ внедорожник²⁹. Выше резолюции анализ Glut1 окрашивание (40 X) в ¹⁸F-ФДГ алчный опухоли легких показывает повышенных выражение и локализации транспортера на плазматической мембраны (рис. 1D).

Из-за ограниченного разрешения изображений ПЭТ ПЭТ/КТ и ткани авторадиографии были исполнены. Более высокое разрешение авторадиографии может определить небольшие опухоли и/или неоднородность опухоли ¹⁸F-ФДГ распределения. После индукции опухоли была проведена ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображений на KL мышей (рисA) следуют авторадиографии на легких, изолированы от этих мышей (цифры 2B и 2 C). Как видно цифры 2B и 2 C, радиоавтография определены два дополнительных меньше опухоли, которые оказались позитивными на ¹⁸F-ФДГ, еще не были легко видны по ПС. После авторадиографии слайды с тканей могут использоваться также для окрашивания иммуногистохимический (IHC) из biomarker(s). H & E пятная для опухоли подтвердили наличие опухоли в левой доле (Рисунок 2D).

Далее была проведена ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ томография на MLN0128-лечение крас^G12D; Lkb1^{- / -} мышь для того чтобы использовать ¹⁸F-ФДГ как функциональный биомаркеров метаболизма глюкозы в опухоли легких (рис. 3). Мы определили, что лечение с MLN0128 надежно препятствует mTORC1 сигнализации и гликолиза как показано снижение ¹⁸F-ФДГ потребления (цифры 3А и 3Б). Эти результаты согласуются с доклинические исследования, оценки MLN0128 в KL мышей как ранее опубликованные в нашей лаборатории^17,27. Наконец окрашивание IHC была выполнена на опухоли (рис. 3C). Опухоли были витражи для H & E либо с антителами против фосфо S6, который сохраняется субстрата mTORC1 и используется для обозначения mTORC1 активации (P-S6) vs. инактивация (S6). Рисунок 3 C показывает надежные ингибирование P-S6, MLN0128 в KL опухоли, по сравнению с теми относились с транспортного средства, который соглашается с ранее опубликованной работе¹⁷. В дополнение к крас онкогенные драйверы как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) поддерживают гликолитических метаболизм в опухоли легких, а также. Таким образом мы проверили ли торможение конститутивно активных мутант EGFR с эрлотиниб подавил метаболизм ¹⁸F-ФДГ в ксенотрасплантатов мыши. Фигуры 3D и 3E показывают, что легкое человека опухоли линия HCC827, которая затаивает EGFR del19 мутации, показали значительно более ¹⁸F-ФДГ потребления после пяти дней лечения эрлотиниб.

И наконец морфометрический анализ ткани была выполнена на секционного легких и опухоли легких для количественного определения всего опухоль бремя также различать опухоли патологий, которые включали ткани подтип, некроз, кровеносных сосудов от нормальной легочной ткани и воздушное пространство. KL GEMMs разработал комплекс и патологически гетерогенных болезнь, которая представлялась с опухолями легких различной наряду. К ним относятся аденокарциномы (ADC) и плоскоклеточный рак (SCC)-Эта разнородность делает лечения этой рака трудноразрешимой проблемой. Рисунок 4 A показывает один лепесток окрашенных легких H & E с двумя большими опухолями настоящего. Выше увеличение изображения, показанный на рисунке 4B определить нормальный легких, судов и воздушное пространство и опухоль некроза, а также аденокарциномы, характеризуется четко определенную структуру папиллярный и плоскоклеточный рак. Рисунок 4 C представляет псевдо-раскраски доли легких и опухоли с помощью морфометрического программного обеспечения Информ. Рисунок 4 D показывает процент нормальных легких, судов и индивидуальных патологий, таких как некроза опухоли и опухоли подтипы сегментированные высокодифференцированных аденокарциномы от плоскоклеточный рак.

Рисунок 1 : Метаболически активные крас^G12D; Lkb1^{- / -} (KL) мутант легких опухоли являются ¹⁸F-ФДГ позитивные и выражают высокий уровень глюкозы транспортер 1 (Glut1). Панелей, A и B Показать максимальной интенсивности проекции [также именуется как 3-мерного изображения (3D)] ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ и КТ анализа на некоторых мышах FDG-алчный KL, укрывательство опухолей легкого, плоскоклеточный. Изображены (A) 3D-реконструкции и (B) поперечной, сагиттальной и корональные виды легких tumor(s) как (T). (C) Эта группа показывает весь легких гистология мыши KL, отображаемого в панели A и B, либо витражи для H & E (Верхняя панель) или с антитело конкретных для Glut1 (Нижняя панель). Пронумерованы долей легких. В баре шкалы = 2 mm. (D) Эта диаграмма представляет ориентацию и количество долей в мышах (Верхняя панель) и изображения более высокого разрешения 40 X H & E витражное или Glut1 опухолей из слайдов, отображаемые в панели C для H & E (средняя группа) или Витражи с антитело конкретных для Glut1 (Нижняя панель). В баре шкалы = 25 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: ¹⁸ F-ФДГ авторадиографии можно определить небольшие опухоли, которые активны метаболически. (A) это ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображение показывает ¹⁸F-ФДГ алчный опухоли в KL мыши, как максимум интенсивности проекция изображения. T1 и T2 = опухоли, H = сердце, B = мочевого пузыря, K = почки. (B) Эта группа показывает авторадиографии ex vivo на последовательных секций правого и левого легкого долей мыши. Легкие в левой и правой панелей являются идентичными. Легкие в левой панели являются псевдо Окрашенные оранжевый. Легкие в правой панели окрашены в черный и белый. Опухоли (T1, T2 и T3) обозначаются стрелками. (C) это увеличенное изображение pseudocolored авторадиографии оранжевый (Верхняя панель) и черно-белые (Нижняя панель). (D) этой группы показывает, H & E окрашивание верхнего среза левой доли, отображаемые в панели B. В баре шкалы = 200 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 3 : MTOR ингибитор MLN0128 подавляет потребление глюкозы в опухоли легких KL мышей, как обнаружено ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ (A) группа показывает представитель ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображения KL мышей, получавших с транспортное средство (¹⁸F-ФДГ алчный, слева) или MLN0128 (¹⁸F-ФДГ не жадный, справа). Поперечный (Верхняя панель), корональных (средняя группа) и сагиттальной (Нижняя панель), показаны просмотров. Опухоли, изложены с красными линиями; H = сердце, L = печени. (B) Эта группа показывает количественную оценку SUVmax (%ID/g) между транспортное средство и MLN0128-лечение опухоли. (C) Эта панель показывает, что H & E и P-S6 окрашивание всей легких секций от KL мышей относился с транспортного средства или MLN0128. В баре шкалы = 25 µm. (D) этой группы показывает представитель ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ и КТ изображения HCC827 EGFR (del19) ксенотрасплантатов до и пост эрлотиниб лечения. Опухоли (T) обозначается стрелкой, K = почек, B = мозга. (E) Эта группа показывает количественную оценку SUVmax (%ID/g) для HCC827 ксенотрасплантатов до и после лечения эрлотиниб. n = 10 опухоли/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Бремя опухоли и опухоли Гистологическая картина количественно с помощью программного обеспечения морфометрические.
(A) этой группы показывает, что H & E пятнать доли легких мыши с опухолью собранные от KL мыши. (B) эти изображения более высокого разрешения показывают плоскоклеточный рак (слева вверху), обычных легких, сосуды и воздушное пространство (справа вверху) и высокодифференцированных сосочковая аденокарцинома (внизу слева) и некроз (внизу справа). (C) Эта группа показывает pseudocoloring H & E-окрашенных легких доли с помощью морфометрического программного обеспечения. (D) группа показывает процентные показатели для отдельных легких доли и опухолевой патологии, измеряется Информ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Этой статье описаны на основе изображений экспериментальный подход, который использован для того чтобы измерить метаболических и молекулярных ответы в опухоли легких после доставки ингибитора mTOR MLN0128 ¹⁸F-ФДГ-ПЭТ/КТ изображений с qIHC. MLN0128 фактически сократили ¹⁸F-ФДГ потребления, указывающее значительный метаболический ответ в опухоли. Связывая ПЭТ/КТ для иммуногистохимии, мы смогли пространственно зарегистрировать секционного опухоли на 3D PET/CT изображения и выполнять детальный анализ всей опухоли на клеточном и молекулярном уровне. Это сделало возможным подтвердить, что MLN0128 ингибирует mTOR сигнализации, подтвердив тем самым на целевой молекулярный ответ наркотиков в опухоли. Наконец воспользовавшись количественных гистологии, мы смогли карта и отдельный собственный опухоли патологий, таких как общая масса опухоли от некроза опухоли, определить аденокарциномы с плоскоклеточный рак и дополнять microPET изображений.

MicroPET в настоящее время ограничено пространственным разрешением около 1 мм. Кроме того, ¹⁸F-ФДГ удержания в определенных тканях может зависеть от различных факторов, включая уровень глюкозы в плазме, тип и продолжительность обезболивающее воздействие, температуры окружающей среды и общего состояния здоровья животного, которое может повлиять на ¹⁸ F-ФДГ фармакокинетики³⁰. Эти параметры были оптимизированы для настоящего Протокола, но должны быть оптимизированы для каждой модели на животных. Воспроизводимость результатов исследования ¹⁸F-ФДГ изображений подкожной опухолей у мышей демонстрируют коэффициент вариации для средней %ID/g приблизительно 15%, предполагая, что опухоль терапевтические реакции отдельных мыши оценены ¹⁸ F-ФДГ-ПЭТ должно быть больше, чем этот порог будет считаться надежным и значительных³¹.

Клеточном и субклеточном даже распределение Трейсеры PET может оцениваться радиоавтографией ткани с разделами впоследствии витражи и зарегистрированных совместно с qIHC. Совместно языковые PET с КТ позволяет образ PET положить в анатомической связи; Это чрезвычайно ценным, даже с низким мягких тканей контраст. Отсутствие контраст мягких тканей, CT могут быть преодолены с магнитно-резонансная томография (МРТ). Кроме того biomarkers для флуоресценции изображений может использоваться для оценки гликолиза в естественных условиях, но Фотон поглощения и рассеяния в полости легких может повлиять на точный количественный или обнаружения чувствительность³². В резюме используя весь животных PET/CT изображений с количественным гистология обеспечивает точную и реальном времени карта биология опухоли после терапевтического вмешательства.

Многоспектральных изображений (MSI) применяется в любой ситуации, где цветного изображения могут быть использованы. По крайней мере MSI предоставляет ту же информацию, цветного изображения, и для некоторых приложений, MSI может предоставить более подробную информацию о спектральных свойств образца, чем простой широкополосный трехцветная (RGB) изображения. В целом ограничения MSI являются те цвета изображений, за исключением того, что MSI медленнее и занимает больше времени для получения изображений. Морфометрические программного обеспечения был использован для получения воспроизводимых, точной сегментации результаты для изображений и описан в Таблице материалов. Есть дополнительные коммерчески доступные продукты, которые могут использоваться для сегментации ткани и количественная оценка гистологии.

Сложность рака метаболизма выходит за рамки Варбург эффект и метаболизм глюкозы^33,34. Это весьма вероятно, что опухоли будет легко адаптироваться к лечения одного агента, которые подавляют гликолиза. Зависимость аминокислотного обмена хорошо задокументировано в рак, и ожидается, что опухоли полагаться на целый amino acids глутамин, глицин, и серина, а также других метаболитов, таких как свободные жирные кислоты^{35,36, 37}. В дополнение к ¹⁸F-ФДГ зонды, например ¹⁸F - и ¹¹помечены C глютамин, холин, ацетат, 1-(2'-Deoxy-2'-fluoroarabinofuranosyl) цитозином (КВС) и fluorothymidine (FLT) успешно использовались для изображения аминокислоты, нуклеотидов и жирового обмена в моделях животных, раком^38,,3940,41. Автоматизация и микромасштабной трассирующими радиохимии технологий в сочетании с более высоким разрешением, выше чувствительность ПЭТ сканеров повысит доступность ПЭТ для измерения различных биологических процедур^42,43. Как понимания метаболизма возрастает, вполне логично, что репертуар PET radiotracers возрастет также, исследователи и врачи неинвазивно профиль опухоли метаболизма.

Использование ПЭТ/КТ изображений и количественные гистология адреса клинических потребностей, который быстро перевести скамейке открытий на клинического использования. Для этого, исследователи должен иметь возможность точно измерить как терапевтический ответ, так и приобретенной резистентности к препаратам, которые ПЭТ/КТ позволяет. Кроме того, ПЭТ/КТ и Иммуногистохимический анализ опухоли легких используются как стандарт медицинской помощи для пациентов и таким образом, непосредственно переводимые в клиническую практику. Важно отметить, что ПЭТ/КТ легко определяет терапия устойчивостью опухолей, которых исследователи могут изолировать и допросить на молекулярном уровне, с тем чтобы лучше понять механизмы заболеваний. Это итеративный процесс, что позволило лучше понять механизмы сопротивления и разрабатывать более эффективные терапевтические стратегии для клинических перевода.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
G8 PET/CT	Perkin Elmer	CLS139564	Used for 18F-FDG PET and CT imaging of mice
Axio Imager.M2	Zeiss	490020-0003-000	Acquiring images of FFPE lung tumor sections
Inform software	Perkin Elmer	CLS135781	Morphometric used for image analysis of tumor pathologies
Glut1 antibody	Alpha Diagnostics	GT12-A	IHC staining of FFPE lung tumor sections
Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (D57.2.2E) XP™ Rabbit mAb	Cell Signaling Technologies	4858	IHC staining of FFPE lung tumor sections
MX35 Premier microtome blades	Thermo Fisher Scientific	3051835	Microtome blades for sectioning tissue for autoradiography