Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

Resumen

La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.

Resumen

La cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans es el factor de virulencia principal y uno de los más comúnmente estudiados aspectos de esta levadura patógena. Tamaño de la cápsula puede variar ampliamente entre cepas, tiene la capacidad de crecer rápidamente cuando introdujo a estrés o bajo condiciones de nutrientes y se ha correlacionado positivamente con la virulencia de la cepa. Por estas razones, el tamaño de la cápsula es de gran interés para los investigadores de C. neoformans . El crecimiento de la cápsula de C. neoformans es inducido durante la prueba fenotípica para ayudar a comprender los efectos de diferentes tratamientos sobre las diferencias entre cepas de levadura o el tamaño. Aquí describimos uno de los métodos estándar de cápsula inducción y comparar dos métodos aceptados de coloración y diámetro de la cápsula de medición: tinta de la India (i), una tinción negativa, utilizado conjuntamente con microscopía óptica convencional y (ii) Co la coloración con tintes fluorescentes de la pared celular y cápsula seguido por microscopia confocal. Por último, os mostramos cómo medida de diámetro cápsula de muestras manchadas de tinta de la India puede ser automatizado usando análisis de imagen Computacional.

Introducción

Afectando a un cuarto de millón de personas cada año y resultando en más de 180.000 muertes al año, Cryptococcus neoformans es una levadura patógena, intracelular y el agente causante de la criptococosis^{1,2, 3}. más afectados son los pacientes VIH-positivos en los países pobres que no tienen acceso a tratamiento antirretroviral, lo que los hace muy susceptibles a la enfermedad^4,5,6. Datos de los CDC indican que en el África subsahariana, C. neoformans mata más personas que la tuberculosis anualmente más cada mes y que cualquier brote de Ébola en el registro¹. La vía más común de exposición ocurre por inhalación de esporas desecadas que son comunes en el medio ambiente⁷. Al entrar en los pulmones, hay varios factores de virulencia que contribuyen al éxito de C. neoformans en los individuos infectados. La cápsula de polisacárido se considera factor de virulencia principal del microbio, como acapsular cepas no virulentas⁸.

La cápsula de Cryptococcus se compone de tres componentes del principio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) y manoproteínas (MPs)⁹. Mientras que los diputados son un componente relativamente de menor importancia asociada a la pared celular de la cápsula, son inmunogénicos y pueden promover una respuesta sobre todo pro-inflamatoria^9,10. Por el contrario, GXM y GalXM conforman la mayor parte de la cápsula (> 90% en peso) y tienen efectos inmunosupresores¹¹. Además de sus efectos inmunomoduladores, la ampliación rápida de la cápsula en vivo crea una barrera mecánica a la ingestión por las células fagocíticas (es decir, neutrófilos y macrófagos) del anfitrión¹². La cápsula de C. neoformans y la síntesis son complejas, pero en general, mayor diámetro cápsula se correlaciona con mayor virulencia^6,13,14. Ante esto, es importante para los investigadores de C. neoformans ser capaces de forma rápida y precisa cuantificar las mediciones de la cápsulas.

Las células de C. neoformans y su cápsula de polisacáridos son estructuras dinámicas y muestran cambios en tiempo¹⁵. La cápsula puede cambiar en densidad, tamaño y montaje en respuesta a cambios en el entorno de host^16,17,18. Hierro bajo o los niveles de nutrientes, exposición al suero, el pH fisiológico humano y aumento de CO₂ se saben que iniciar crecimiento cápsula^16,18,19,20. Además, los investigadores han demostrado cambios estructurales dando como resultado diferencias significativas en el immunoreactivity durante una infección, una ventaja a C. neoformans sobre su huésped los préstamos^21,22. Esto se conoce porque la arquitectura de la cápsula de C. neoformans ha sido analizada en una variedad de maneras. Por ejemplo, microscopía electrónica, ha revelado que la cápsula tiene una matriz heterogénea con una capa interna de electrón-densos debajo de una capa externa, más permeable²³. Dispersión de la luz y el uso de pinzas ópticas han permitido a los investigadores aclarar más lejos sus características macromoleculares²⁴. Analizar los resultados de ambas mediciones de la dispersión ligera estática y dinámica, sabemos que la cápsula de polisacárido tiene una compleja ramificación de la estructura²³. Pinza óptica se han utilizado para probar la rigidez de la estructura así como evaluar su reactividad anticuerpo del²⁴. Sin embargo, el más frecuentemente empleado análisis de la cápsula de C. neoformans es la medida de su tamaño.

Para cuantificar el tamaño de la cápsula, los investigadores utilizan lo que debería ser una medida simple: el diámetro lineal de la cápsula. Microscopios digitales se utilizan para capturar imágenes de múltiples células de C. neoformans (generalmente cientos) teñidos con tinta china o con colorantes fluorescentes. Se mide el tamaño de cada cuerpo celular y la cápsula circundante. Los datos son compilados, y el diámetro medio de la cápsula se calcula restando el diámetro del cuerpo de la célula del diámetro entero de la célula (célula corporal + cápsulas). Hasta este punto, estas mediciones se han realizado manualmente. Mientras que generalmente precisa, este método tiene inconvenientes para los investigadores. Conjuntos de datos grandes puede tomar días o incluso semanas para analizar con la mano. Y ya que estas mediciones se hacen manualmente, subjetividad y el error humano pueden afectar el resultado.

Análisis de imagen Computacional automatizado se ha convertido en una herramienta indispensable para los investigadores en muchas áreas de la biología molecular de la célula, lo que posibilita un análisis más rápido y más fiable de imágenes biológicas ^25,26,27. Técnicas de análisis de imágenes precisos son necesarias para extraer información cuantitativa de lo que a menudo son complejos e inmensos conjuntos de datos. Sin embargo, algunas medidas, especialmente la medición de la cápsula de C. neoformans , han sido difíciles de automatizar. Identificar con precisión la interfaz entre la pared celular y cápsula, que generalmente aparece como un anillo oscuro cuando imágenes por microscopia de contraste de fase, puede ser problemática a resolver mediante un simple umbral. Además, las células de C. neoformans en cultivo tienden a agruparse y precisa segmentación de las células es necesario para las medidas exactas.

El objetivo de este proyecto fue para (i) ilustrar uno de los protocolos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans, (ii) Comparar y contrastar la tinta India y tinción de fluorescencia relativas para mediciones del diámetro de la cápsula (iii) desarrollar simple, métodos computacionales para medir diámetro cápsula utilizando imágenes de tinta de la India manchadas las células usando un software de análisis de imagen y, (iv) evaluación los beneficios y limitaciones de diámetro de la cápsula de medición manualmente y utilizando la automatización del software. Encontramos que de los dos métodos de tinción, fluorescentes de la pared celular y cápsula, mientras más desperdiciadores de tiempo, proporciona los resultados más consistentes entre experimentos. Sin embargo, ambos métodos nos permitieron distinguir correctamente entre laboratorio y clínica C. neoformans exhibe diferentes cepas cápsula tamaños. Además, fuimos capaces de automatizar la medición de diámetro cápsula de tinta manchada imágenes y encontró que ésta era una alternativa viable para medición manual de la cápsula.

Protocolo

Nota: C. neoformans es un patógeno de bioseguridad nivel 2 (BSL-2) y los investigadores que trabajan con él deben tomar las precauciones adecuadas. Procedimientos detallados sobre cómo con seguridad trabajo con patógenos de BSL-2 se encuentra en el centro for Disease Control (CDC) sitio web, pero es importante tener en cuenta que todas las personas que entran en contacto con C. neoformans deben ser debidamente entrenadas en el manejo de agentes patógenos y deben usar siempre equipo de protección personal (EPP), generalmente de látex o guantes de nitrilo. Además, los rotores en las centrífugas deben sellarse para evitar aerosolización de muestras y cualquier derrame, limpiada inmediatamente con una solución de cloro 10%²⁸.

1. cápsula inducción

Nota: Todas las medidas deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Cultura de C. neoformans en caldo de levadura peptona dextrosa (YPD) (pH 6.5 +/-0.2) e incube a 37 ° C con agitación hasta que estén en fase logarítmica (aproximadamente 18-36 h).
2. Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C y lavar tres veces con tampón fosfato salino (PBS).
3. Utilizar un hemocitómetro o un contador de células automatizado para contar las células y resuspender en 2 x 10⁵ células/2 mL en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM).
4. Para inducir la cápsula, incubar a 37 ° C y 5% CO₂ para 18 h.
   Nota: La combinación de la ausencia de nutrientes en los medios de comunicación y la presencia de CO₂ estimula el crecimiento de cápsula de C. neoformans .
5. La incubación, cosechar las células por centrifugación (como arriba) y quitando todo, pero 5-10 μl de sobrenadante. Al mismo tiempo, recoger una muestra celular no inducida correspondiente para cada cepa que se medirá. Utilizarlos como controles negativos.
   Nota: Los pellets de células serán muy pequeños y pueden ser difíciles de ver. Tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.
6. Tinción con tinta china (sección 2.1) o con colorantes fluorescentes (sección 2.2).

2. coloración

1. Tinción con tinta de la India sólo
   1. Para teñir la levadura con la tinta de la India, Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y añadir 4μL (aproximadamente la mitad) de la suspensión celular y 4μL de tinta de la India sobre un portaobjetos de vidrio. Suavemente la mezcla y evitar la formación de espuma.
   2. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.
2. Tinción con sólo tintes fluorescentes
   1. Para teñir la levadura con un colorante fluorescente, Resuspender el precipitado de células en 50 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
   2. Incubar el cultivo con un volumen igual de blanco de calcoflúor (CFW) (1 μg/mL) y mAb cápsula 18B7 (véase Tabla de materiales) conjugado con AlexaFluor488 (AF488) (10 μg/mL) durante 30 min a 37 ° C.
   3. Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C la incubación y aspirar el sobrenadante.
   4. Resuspender el precipitado de células en 10 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).
   5. Pipeta 8 μl de suspensión celular en un portaobjetos de vidrio.
   6. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.
3. Tinción con tinta china y colorantes fluorescentes
   1. Para comparar más directamente la eficacia de la tinta de la India la coloración a la de los tintes fluorescentes, conjuntamente se tiñen de la misma población celular con ambos tipos de manchas. Para ello, primero incubar las células con una cápsula fluorescente y la mancha de la pared celular, según pasos 2.2.1 - 2.2.3.
   2. A continuación, pipetear volúmenes iguales (4 μL) de la suspensión celular tinción fluorescente y tinta china sobre un portaobjetos de vidrio. Mezclar suavemente.
   3. Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.

3. imagen adquisición/microscopía

1. Imagen de células teñidas con tinta de la India.
   1. Adquisición de imágenes mediante un microscopio óptico estándar (100 aumentos).
   2. Imagen de un mínimo de 50 células por condición.
      Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo, ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado). Para estos experimentos, se adquirieron imágenes a una profundidad de 16 bits con tiempos de exposición optimizados para maximizar el contraste de la imagen al tiempo que minimiza el desenfoque causado por pequeños movimientos de las células.
2. Imagen de células teñidas con colorantes fluorescentes
   1. Para las células de la imagen por microscopía de fluorescencia, abra el software de imágenes de microscopio y seleccione adecuados longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos utilizado (CFW y AF488 están entusiasmados con el 405 nm y luces de 488 nm, respectivamente). Adquisición de imágenes mediante un microscopio de fluorescencia.
   2. Imagen de un mínimo de 50 células por condición.
      Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado).
   3. Adquirir una serie de imágenes z-stack de las células para asegurar que se obtiene el diámetro máximo de la cápsula para cada celda dentro de un campo determinado.
      1. En el software de control de microscopio, haga clic en la barra "z-stack" para abrir el panel de control "z-stack", luego seleccione la opción "Primero, último" en la esquina superior izquierda del panel.
      2. Utilice el control fino de enfoque en el microscopio para enfocar a un nivel que está por debajo del punto más ancho de una célula de levadura sola y las cápsulas para todos dentro del campo de visión actual y haga clic en "Establecer primero".
      3. Utilice el control fino de enfoque para enfocar sobre el punto más ancho del cuerpo celular de la célula misma y de la cápsula para todas las celdas dentro del campo de visión actual y haga clic en "Set pasado".
      4. Haga clic en "Iniciar el experimento" en la pestaña de "Adquisición" para adquirir el z-stack para la posición actual. Repita el proceso en varias posiciones hasta que se han adquirido imágenes z-stack de al menos 50 células.
         Nota: Para estos experimentos, el agujero de alfiler confocal se establece en 1.0 UA y una superposición serie z de 10-20 rebanadas cubriendo 0,7 μm fueron adquiridas en las posiciones elegidas. UA = unidad de Airy.
   4. A continuación, convertir cada serie z-stack proyecciones de máxima intensidad (MIP) utilizando el software de análisis de imagen adecuada.
      Nota: MIPs proyecto la mayor intensidad en cada plano de la imagen apilada²⁹. Creación de MIPs permite producir una representación 2D de imágenes que corresponden a la célula máxima y el diámetro cápsula dentro de la pila 3D capturado.
3. Imagen de células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes
   1. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal o campo amplio (40 aumentos) (63 X o 100 X de ampliación). Para las células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes, capturar imágenes mediante un microscopio de campo amplio equipado con una etapa controlada por ordenador y el objetivo de inmersión de aceite.
      Nota: El microscopio en uso debe controlarse mediante un software de proyección de imagen CFW. fluorescencia que es excitado a través de un filtro de excitación de 340-380 nm y emite luz debe ser detectada a través de un filtro de barrera 435-485 nm reflejado por un espejo dicroico de 400 nm. AF488 fluorescencia puede ser excitada a través de un filtro de excitación de 465-495 nm y luz emitida puede ser detectada a través de un filtro de barrera de 515-555 nm reflejado por un espejo dicroico de 505 nm.
   2. Un mínimo de 50 células por condición para cada método de coloración de la imagen.

4. manual medición de cápsula

1. Para las células teñidas con tinta de la India o las manchas fluorescentes, utiliza un software de medición célula manualmente medida cápsula y célula de diámetro (véase Tabla de materiales). Para ello, vaya a "Archivo" > "Abrir imagen" > "Medida" y utilice el cursor para trazar una línea recta a través del punto más ancho de la célula entera (diámetro total).
2. A continuación, haga clic en "Medida" otra vez y trazar una línea recta a través del cuerpo de la célula (diámetro del cuerpo de la célula).
   Nota: Las mediciones son almacenados automáticamente en las células.
3. Repita este proceso para todas las celdas (mínimo 50/grupo).
4. Para guardar las imágenes una vez que se midieron, haga clic en "Archivo" > "Guardar como" y nombrar las imágenes adecuadamente.
5. Seleccione los archivos recién medidos y exportar datos a un software de hoja de cálculo.
6. Calcular el diámetro medio de la cápsula mediante la ecuación: ([diámetro total] - [cuerpo de la célula diámetro]).

5. automáticos de medición de la cápsula

Nota: Para éxito automáticos de medición, utilice imágenes de 16 bits con un alto nivel de contraste y que están correctamente enfocados junto con un software de análisis de imagen apropiado (véase Tabla de materiales). Cuando proyección de imagen C. neoformans para la medición de la cápsula, es importante centrarse en el anillo oscuro en el límite entre la pared celular y cápsula. Esto permite que el software delinear correctamente el celular y la cápsula.

1. Invertir y crear una copia de toda la tinta India manchados imágenes de celular utilizando un software de edición de imágenes adecuado (véase Tabla de materiales). Para ello, haga clic en "Archivo" > "Abrir" para abrir tinta India teñida de imágenes y luego de "Control" + "I" para invertir la imagen. Haga clic en "Archivo" > "Guardar como" para guardar la imagen invertida.
2. Importar tanto el original como invertida imágenes en el software haga clic en "Archivo" > "Importar secuencia" > "Carga de imagen" > "Definir secuencia (manualmente)" > "Dimensiones (canal)" > "Importar" > "Aplicar".
   Nota: Los cuerpos celulares de C. neoformans y cápsulas pueden identificarse y enmascararon utilizando algoritmos específicos - contempladas como 'recetas' - incluidos en el software.
3. Utilice la receta de la 'Colonia analizador (fluorescencia)' la imagen invertida para detectar y enmascaran el cuerpo de la célula, y haga clic en "aplicar". En la imagen invertida, el anillo oscuro de definir el límite de la célula de C. neoformans se convierte en más brillante que la cápsula circundante.
4. Use la receta del 'Analizador (fluorescencia) de la Colonia' en la imagen invertida a los cuerpos celulares de C. neoformans de sus cápsulas del segmento, a continuación, haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cuerpo celular" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta".
   Nota: La receta consiste en múltiples pasos de procesamiento de la imagen: fondo de retiro, detección de objetos, separación de objeto y subconjunto filtrado.
5. A continuación, utilice la receta de 'Proliferación celular' en la imagen original para detectar y enmascaran el cápsula y haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cápsula" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta".
6. La receta, 'Cápsula de partición', crear una nueva máscara a la imagen original para particionar cápsulas adyacentes uno del otro. Para ello, haga clic en "Partición de cápsula" en el menú desplegable de receta. En el cuadro de la partición de la cápsula, elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cápsula" (5.5) para la región de la cápsula. Elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cuerpo celular" para las células Crypto (5.4). Elegir "Original" para el canal de entrada y "crear máscara de cápsula de particionado. Haga clic en "aplicar
   Nota: La receta genera células y diámetro de la cápsula, definido como el promedio de los ejes más largo y más cortos atravesando el centro de la célula y la cápsula y las mediciones de área de máscaras de detección. Encontrar la salida que se encuentra en la pestaña de la hoja de cálculo de este software. Repita este proceso para todas las imágenes (mínimo de 50 células/grupo). Parámetros de la receta podrían ajustados para optimizar la detección de imágenes individuales u optimizados para la detección de lotes de varias imágenes. Medidas adicionales pueden calcularse por la receta para la caracterización completa de la célula y morfología de la cápsula.
7. Exportar datos a un software de hoja de cálculo de elección para su posterior análisis.

Resultados

Para ilustrar la cápsula inducción celular tinción, proyección de imagen y técnicas de medición, se utilizaron tres cepas de neoformans de la C.: colar el laboratorio común, bien caracterizado, H99S³⁰y dos cepas clínicamente aisladas de previamente diámetro cápsula desconocido, B18 y B52³¹.

El flujo de trabajo de inducción cápsula, tinción y adquisición de la...

Discusión

Durante décadas, la cápsula ha sido un importante foco de investigación para micólogos y médicos interesados en C. neoformans y criptococosis debido a su papel como factor de virulencia importante para el patógeno. Mediante microscopía para medir diferencias en el tamaño de la cápsula entre cepas y bajo crecimiento diferentes condiciones pueden proporcionar información importante sobre el patógeno y sus respuestas a varios estímulos(es decir, diferentes condiciones ambientales, posibles trat...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsule Induction
C. neoformans cells			The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)	Fisher Scientific	DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS)			This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate	GE Life Sciences	SH30022.01
6-well plates	Falcon	CL5335-5EA
Shaking incubator	Thermo Scientific		MaxQ6000
CO2 incubator	Fisher Scientific		Isotemp
Centrifuge	Thermo Scientific		Legend XTR
Staining
Microcentrifuge	Thermo Scientific		Legend Micro 21R
India ink	Fisher Scientific	14-910-56
Calcofluor white	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488			A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)			PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Superfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-143
Glass coverslips	Corning	2855-18	#1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition
Immersion oil	Cargille	16484
Light microscope with immersion oil objective	Zeiss		Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera	Zeiss		Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective	Zeiss		LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.
Confocal microscope software	Zen 2009
Confocal microscope camera	Nikon		Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.
Widefield imaging software	Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software	Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement	Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement	Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software	Excel (Microsoft)