Un metodo per studiare il polimorfismo C924T del Gene del ricevitore di trombossano A2

Riepilogo

Nello studio presente, descriviamo una metodologia per analizzare il genotipo di C924T. Il protocollo è costituito da tre fasi: estrazione del DNA, amplificazione di reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'analisi del polimorfismo di lunghezza di frammento di limitazione (RFLP) su gel di agarosio.

Abstract

Il gene del recettore (TBXA2R) di trombossano A2 è un membro della superfamiglia con regioni 7-transmembrana accoppiati a proteine G. Esso è coinvolto nella progressione di atherogenesis, ischemia e infarto del miocardio. Qui presentiamo una metodologia del paziente genotipizzazione per indagare il ruolo post-trascrizionale del polimorfismo C924T (rs4523) situato presso la regione 3' del gene del ricevitore di TBXA2. Questo metodo si basa sull'estrazione del DNA da sangue intero, amplificazione di reazione a catena (PCR) della polimerasi della parte di gene TBXA2 contenente la mutazione C924T e l'identificazione di tipo selvaggio e/o genotipi mutanti utilizzando un'analisi di restrizione del digest, in particolare un frammento lunghezza polimorfismo di limitazione (RFLP) su agarosio del gel. Inoltre, i risultati sono stati confermati dal sequenziamento del gene TBXA2R. Questo metodo presenta diversi vantaggi potenziali, quali alta efficienza e la rapida identificazione del polimorfismo C924T da analisi dell'enzima di limitazione e di PCR. Questo approccio consente uno studio predittivo per la formazione di placche e la progressione di aterosclerosi analizzando pazienti genotipi per il polimorfismo di TBXA2R C924T. Applicazione di questo metodo ha il potenziale per identificare i soggetti che sono più suscettibili ai processi aterotrombotici, in particolare soggetti in un gruppo ad alto rischio, trattati con aspirina.

Introduzione

TBXA2R è un membro della superfamiglia accoppiati a proteine G con del transmembrane sette regioni, che sono ampiamente espressi e localizzate le membrane cellulari o su strutture intracellulari^1,2. La via di segnalazione di TBXA2R è coinvolto in processi aterosclerotici avanzati³. Aumento dell'espressione del recettore TBXA2 è stata dimostrata durante la progressione di atherogenesis e clinici e studi sperimentali hanno mostrato il suo ruolo rilevante in ischemia e infarto miocardico⁴. C924T, un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) del gene di TBXA2R, è stato riconosciuto come un polimorfismo funzionale in volontari sani ed è stato collegato a disordini clinici⁵. Inoltre, il nostro studio precedente⁶ ha dimostrato che il polimorfismo C924T del gene TBXA2R è coinvolto nella stabilità di trascrizione; in particolare, c'è un'instabilità aumentata della trascrizione tipo (TT) mutante rispetto al wild type (CC). Inoltre, parecchi stimoli quali l'adenosina difosfato (ADP), epinefrina e collagene a differenti concentrazioni ha indotto un'aggregazione piastrinica meno efficace per il tipo mutante (TT). Ciò è coerente con una formazione ridotta dell'embolo e del hemostasis. Quindi, l'instabilità della trascrizione TBXA2R e la relativa riduzione dell'aggregazione piastrinica potrebbe essere associate con un ruolo protettivo per il genotipo del TT TBXA2R contro aterotrombosi e delle sue complicanze nei pazienti trattati con aspirina ad alto rischio⁶ .

Qui, descriviamo una metodologia per paziente genotipizzazione indagare il ruolo post-trascrizionale del polimorfismo di C924T (rs4523) situato presso la regione 3' del gene del ricevitore di TBXA2. Questo metodo si basa sulle seguenti fasi: estrazione (1) del DNA da sangue intero, l'amplificazione di PCR (2) della parte di gene TBXA2R contenente la mutazione C924T e (3) identificazione di tipo selvaggio e/o genotipi mutanti utilizzando la lunghezza del frammento di restrizione polimorfismo (RFLP) su gel di agarosio. RFLP è una tecnica che sfrutta le variazioni di sequenze omologhe del DNA⁷. Questa applicazione è stata utilizzata per rilevare i polimorfismi del DNA, soprattutto SNPs, trovare e associare la rilevanza biologica in variazioni genetiche⁸. Il polimorfismo analizzato per la prima volta utilizzando il RFLP-PCR in esseri umani era il sangue ABO⁹. Il metodo RFLP-PCR permette l'analisi delle mutazioni genetiche in sequenze di DNA omologhe valutando la presenza di frammenti di lunghezza diversa dopo la digestione del DNA usando altamente specifico endonucleasi¹⁰.

In anni passati, le seguenti metodologie sono state utilizzate per l'analisi SNP utilizzando la tecnica della PCR: ibridazione di breve oligonucleotides di allele-specific¹¹, allele-specifico PCR¹², estensione dell'iniettore su DNA microarrays¹³, la legatura del oligonucleotide dosaggio¹⁴, diretto del DNA sequencing per identificazione di polimorfismi a singolo nucleotide posizione specifica¹⁵, Taqman metodo¹⁶, estrazione (Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight MALDI-TOF) spettrometria totale¹⁷e GeneChip¹⁸. Queste tecniche non sono semplici da utilizzare e possono richiedere attrezzature costose. Al contrario, il metodo di PCR-RFLP è poco costoso, semplice da usare, conveniente, ha un'alta efficienza e permette la rapida identificazione del polimorfismo C924T. Inoltre, abbiamo confermato i risultati tramite sequenziamento del gene di TBXA2R utilizzando il metodo di Sanger¹⁵.

Questo approccio consente uno studio predittivo della formazione di placche e progressione di aterosclerosi analizzando pazienti genotipi per il polimorfismo di TBXA2R C924T. Questo metodo poteva identificare i soggetti più suscettibili ai processi aterotrombotici, in particolare quelli fra i pazienti ad alto rischio, trattati con aspirina.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca medica dell'Università di Chieti.

1. reagente Setup

1. Preparare il tampone Tris-EDTA (TE) (pH 8.0). Aggiungere 200 µ l di EDTA 0.5 M e 1 mL di Tris-Cl 1 M in un becher e portare a 100 mL con acqua sterile. Concentrazione finale di TE buffer: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Conservare a temperatura ambiente (TA).
2. Preparare 1 L di 10 x buffer di elettroforesi di soluzione di riserva (TBE). Sciogliere 108 g di Tris Base, 55 g di acido borico e 40 mL di EDTA 0.5 M (pH 8) in un becher e portare al volume di 1 L con acqua sterile. Conservare a RT.
3. Preparare il tintura di caricamento del gel. Sciogliere 0,25 g di bromofenolo, 0,25 g di xilene cianolo FF, 50 g di glicerolo, 1 mM di EDTA (pH 8) in 60 mL di acqua deionizzata o distillata e portare ad un volume di 100 mL con acqua sterile. Conservare a 4 ° C (per pochi mesi) o a-20 ° C (per anni)
4. Preparare 200 mL di gel di agarosio al 2%. Uso che è fresco o, in alternativa, memorizzare solidificato a RT per fino a parecchie settimane.
   1. Sciogliere 4 g di agarosio in 200 mL di 1 x TBE tampone in un becher da 600 mL. Mescolare con un mixer magnetico per circa 5 min finché l'agarosio è completamente sospesa.
   2. Riscaldare la soluzione di agarosio al 2% in acqua bollente o su una piastra calda (per circa 10 min, fino alla completa dissoluzione l'agarosio). Si noti che il becher con il gel di agarosio deve essere coperto con carta stagnola. In alternativa, riscaldare il becher scoperto in un forno a microonde ad alta temperatura per circa 3 – 5 min.
   3. Agitare la soluzione di agarosio al 2% utilizzando un miscelatore magnetico, controllando che l'agarosio è completamente sciolto.
      Nota: Le particelle di agarosio appaiono come grani traslucidi prima del completo scioglimento. Può essere necessario riscaldare particelle per alcuni minuti (circa 5 – 10 min).
   4. Se una porzione stored del gel dell'agarosi è utilizzato, riscaldare il becher, coperto con carta stagnola, in un bagno di acqua calda (a circa 60 ° C) fino a quando l'agarosio è dissolto. Rimuovere con una pipetta Pasteur "tracce" di agarosio solidificato dalla superficie prima del versamento.

2. purificazione DNA

1. Eseguire le seguenti operazioni prima di iniziare la purificazione:
   1. Utilizzare campioni di sangue intero fresco umano, o sangue intero congelato campioni rapidamente (per circa 2 – 3 minuti) in un bagno d'acqua (a 37 ° C) applicando una lieve agitazione di scongelare e quindi equilibrare a RT prima dell'uso.
   2. Miscelare i campioni di sangue fresco o scongelato invertendo i tubi più volte.
2. Avviare la procedura di purificazione seguendo protocolli del fornitore per 100 µ l di volume di eluizione.
3. Quantificare e calcolare la purezza del DNA misurando l'assorbanza a 260, 280 e 320 nm.
   1. Utilizzare acqua sterile per diluire i campioni e per calibrare lo spettrofotometro.
   2. Applicare la seguente formula per calcolare la concentrazione di DNA campione = 50 µ g/mL x (un₂₆₀ − A₃₂₀) x fattore di diluizione e la purezza del DNA = (un₂₆₀ − A₃₂₀) / (un₂₈₀ − A₃₂₀), con un accettabile rapporto tra 1.7 e 1.9.

3. PCR amplificazione di campioni di DNA

1. Preparare 25 µ l di miscela di reazione in un tubo di micro-amplificazione di 0,2 mL, come illustrato nella tabella 1.
2. Svolgere un'amplificazione di PCR dei campioni di DNA purificati utilizzando un termociclatore automatizzato, seguendo il programma di amplificazione riportato nella tabella 2.
3. Alla fine l'amplificazione di PCR, interrompere le reazioni di PCR lasciando i campioni di DNA a 4 ° C.

4. RFLP dei prodotti di PCR

1. Preparare 22,5 µ l di soluzione di mix master per ogni campione, in modo che l'enzima di restrizione selezionato digerisce i prodotti di PCR, come mostrato nella tabella 3.
2. Trasferire 2,5 µ l di prodotto di PCR ad un nuovo tubo PCR per ogni campione, utilizzando una pipetta e puntali con filtro.
3. Aggiungere 22,5 µ l di soluzione di master mix di digestione per le provette contenenti il prodotto di PCR di ogni campione, utilizzando una pipetta e puntali con filtro.
4. Incubare la miscela di reazione (master-mix soluzione e il prodotto PCR) a 37 ° C per 4 h.

5. gel elettroforesi analisi di PCR-RFLP campioni

1. Macchia del gel dell'agarosi aggiungendo etidio bromuro (EtBr) a 0,5 µ g/mL per il gel per un minimo di 10 EtBr si lega al DNA, che può essere visualizzato sotto luce ultravioletta (UV).
   Attenzione: È importante utilizzare altri dispositivi di protezione e guanti durante la manipolazione, stoccaggio e smaltimento di EtBr, perché è un agente mutageno con potenziale cancerogenicità.
2. Versare il gel di agarosio preparato in un vassoio di gel con il pettine bene in luogo e attendere che si è solidificato.
3. Inserire il gel di agarosio solidificato la vaschetta del gel (unità di elettroforesi).
4. Riempire la vaschetta del gel con 1 x TBE fino a quando il gel è coperto.
5. Con una pipetta e puntali con filtro, è necessario caricare 6 µ l del digest amplificati del DNA (in particolare, carico 5 µ l di ogni campione e 1 µ l di tintura di caricamento del gel) nei pozzetti del gel dell'agarosi. Aggiungere un marcatore di DNA in un separato bene e in parallelo con i campioni.
6. Esegua il gel per 20 – 30 min a 100 V.
7. Con un transilluminatore UV, visualizzare i frammenti di DNA spaccati o i prodotti di PCR non digeriti, confrontando i frammenti con l'indicatore di dimensione del DNA e registrare i risultati di fotografia seguendo le istruzioni del produttore.
   Attenzione: Utilizzare dispositivi di protezione (occhiali di sicurezza o una maschera) intorno a sorgenti di luce UV.

Risultati

L'obiettivo di questo metodo è quello di valutare il genotipo del recettore del trombossano A2 per quanto riguarda il polimorfismo di C924T. Il gene umano di TBXA2R si trova su 19p 13.3, si estende su 15 kbp e costituito da tre esoni separati da due introni. I C924T di polimorfismi del gene di TBXA2R (di 539 bp) è stato amplificato utilizzando i primer PCR illustrati nella Figura 1, che erano ben progettati per amplificare una regione specifica del DNA ma non un orthologous o paraloghi regione non specifici. Inoltre, un'analisi RFLP usando un enzima di restrizione RsaI (Figura 1) per i prodotti PCR è stata eseguita e i risultati sono stati visualizzati su un gel di agarosio, al fine di caratterizzare il SNP studiati specifici.

Basato sulla presenza di lunghezze differenti frammenti dopo la digestione del DNA, è possibile discriminare il genotipo del paziente per il polimorfismo di C924T. Infatti, come mostrato in Figura 2, l'omozigosi dell'allele principale (CC) Visualizza due bande (395 e 144 bp), perché l'enzima di restrizione taglia proprio la parte del gene di TBXA2R presso il sito del polimorfismo di C924T. L'omozigosi dell'allele minore (TT) è dimostrata da una banda singola (539 bp), perché il taglio degli enzimi di limitazione non si verifica. L'allele eterozigote (CT) Mostra tre bande (539, 395 e 144 bp). Come illustrato nella Figura 2, il polimorfismo di C924T, definito da RsaI digestione il prodotto di PCR, è stato confermato dall'analisi di sequenza.

Componente	Volume (µ l)	Concentrazione finale
10X tampone PCR Tween-20 (15 M MgCl2)	0.25	1.5 MgCl2 mmol/L
miscela del dNTP (10 mM)	1	200 ΜM
Primer (avanti) (10 pmol/µM)	1	0,4 ΜM/Μ l
Primer (inversa) (10 pmol/µM)	1	0,4 ΜM/Μ l
Taq polimerasi (5 U / µ l)	0.2	1 U/Μ l
Campione di DNA (42 ng / µ l)	1	42 ng / µ l
Dnasi-free-acqua	20,55
Totale	25

Tabella 1: Installazione di amplificazione di PCR. Una miscela di reazione di mix master 25 µ l istituita in una provetta PCR da 0,2 mL per amplificare un singolo campione di DNA.

Standard di PCR
Passo d'attivazione iniziale	5 min		95 ° C
3-passo in bicicletta
Denaturazione	30 s		94 ° C
Ricottura	60 s		55 ° C
Estensione	60 s		72 ° C
Numero di cicli		30 cicli
Estensione finale	8 min		72 ° C

Tabella 2: Programma di amplificazione di PCR. Impostare un cycler termico automatizzato per eseguire PCR e amplificare il DNA della mascherina. Reazioni di PCR vengono fermate da refrigerazione a 4 ° C.

Componente	Volume (µ l) (n = 1)	Volume (µ l) (n = 10) *
10X tampone enzimatico	2.5	27.5
Enzima di restrizione (5 U / µ l)	0,5	5.5
Dnasi-free-acqua	19,5	214,5
Totale	22,5	247,5

Tabella 3: Digestione degli enzimi di limitazione dei prodotti di PCR. Una soluzione di mix master è preparata in modo che l'enzima di restrizione selezionato digerisce i prodotti PCR. *: Per impostare una soluzione di mix master per 10 campioni, aggiungere 10% in più, che infine compongono 11 campioni.

Figura 1: PCR primer e degli enzimi di limitazione RsaI. I primer forward e reverse progettati per amplificare la porzione del gene di TBXA2R di 539 bp contenente il polimorfismo di C924T. RsaI è l'enzima di restrizione selezionata per riconoscere i siti GTAC. ˅: sito di taglio dell'enzima RsaI. C(/T): C924T polimorfismo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: analisi di sequenza del DNA e tracciato elettroforetico. (A) la C924T genotipo viene riconosciuto dal RFLP modello dopo digestione con l'enzima RsaI specifico. Analisi di sequenza del DNA (B): I risultati ottenuti da RFLP dopo digestione con l'enzima di restrizione RsaI sono stati confermati mediante analisi di sequenza mostrando il polimorfismo di C924T. Questa figura è stata modificata da De Iuliis et al., prostaglandine e altri mediatori lipidici⁶. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Nello studio presente, abbiamo descritto una metodologia che permette di genotipizzazione paziente al fine di indagare il ruolo post-trascrizionale del polimorfismo di C924T (rs4523) situato presso la regione 3' del gene TBXA2R. In primo luogo, questo metodo si basa sull'estrazione del DNA da sangue intero. In particolare, questo primo processo consiste di una purificazione di DNA umano totale, genomica e mitocondriale, da campioni di sangue intero freschi o congelati, trattati con EDTA (citrato o eparina). Per lo stoccaggio a breve termine di campioni di sangue intero, conservare a 2-8 ° C fino a 10 giorni. Per deposito oltre 10 giorni, conservare i campioni a-70 ° C. Il processo di purificazione automatizzata comprende 4 fasi: lyse, associare, lavare ed eluire. In secondo luogo, il metodo si basa sull'amplificazione di PCR della parte di gene TBXA2R contenente la mutazione C924T. Infine, l'identificazione di tipo selvaggio e/o genotipo mutante usando un'analisi dell'enzima di limitazione (RFLP) su gel di agarosio viene eseguita.

Fasi critiche nel protocollo sono i seguenti: (i) nel caso in cui una parte del gel dell'agarosi conservata a RT è usato, l'agarosio solidificato può essere ri-disciolto sopra una vasca di acqua bollente (a 60 ° C per circa 15-20 min) o in un forno a microonde (3-5 min) prima del versamento. Nota: allentare il tappo quando rifondendo agarosio in una bottiglia. (ii), inoltre, quando ri-riscaldamento dell'agarosi, evaporazione causerà un aumento della sua concentrazione. Per questo motivo, potrebbe essere utile compensare aggiungendo un piccolo volume di acqua. (iii) frammenti di DNA di meno di 1.000 bp sono stati differenziati da gel di agarosio e tampone TBE è consigliato per ottenere la migliore separazione possibile. (iv) preferiamo usare un gel dell'agarosi, piuttosto che un gel di poliacrilammide, perché la preparazione di quest'ultimo è più difficile e richiede molto più tempo per impostare. (v) la scelta del tempo di esercizio del gel elettroforesi si basa sulla dimensione prevista dei prodotti di amplificazione. Basata su questo protocollo, è sufficiente effettuare un'elettroforesi per 20-30 min a 100 V in gel di agarosio al 2%, poiché la dimensione della PCR frammenti varia da 100-500 BP. (vi) è obbligatorio per ottenere 10 a 50 ng di un modello di buona qualità il DNA estratto dai campioni umani . Per questo motivo, preferiamo usare una purificazione del DNA automatizzata, piuttosto che una semi-automatica o manuale. (vii) preparare la master-mix reazione per l'amplificazione di PCR e la soluzione di master-mix per la digestione di prodotti PCR, l'aggiunta di 10% in più (per tenere conto di perdite di liquido durante il pipettaggio) al volume calcolato moltiplicato per il numero di campioni per il volume richiesto per un campione di DNA.

L'insidia più frequente del metodo è la presenza dei prodotti di amplificazione supplementare a causa di un programma errato termociclatore, una preparazione della master-mix di amplificazione non corretto o una contaminazione di modello di DNA. Inoltre, l'assenza dei prodotti di PCR può essere dovuto inattivato Taq polimerasi o un cycler termico non corretto eseguire. Inoltre, la presenza di frammenti imprevisti può essere dovuta a contaminazione del prodotto PCR o a una digestione incompleta da un enzima inattivato, troppo poca quantità di volume di enzima di restrizione o da un tempo di incubazione troppo breve.

Negli ultimi anni, sono state utilizzate le seguenti metodologie per l'analisi SNP utilizzando la tecnica della PCR: ibridazione di breve oligonucleotides di allele-specific¹¹, allele-specifico PCR¹², estensione dell'iniettore sui microarrays del DNA¹³ , legatura del oligonucleotide dosaggio¹⁴, sequenziamento del DNA per l'identificazione di polimorfismi a singolo nucleotide posizione specifica¹⁵Taqman metodo¹⁶, estrazione Assisted Laser Desorption/Ionization diretto Tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria totale¹⁷e GeneChip¹⁸. Questi metodi non sono l'ideali perché non sono semplici da utilizzare e/o richiedono attrezzature costose. Al contrario, il metodo di PCR-RFLP descritto in questo studio è poco costoso, semplice da usare, conveniente, ha un'alta efficienza e permette la rapida identificazione del polimorfismo C924T. Una limitazione per il presente metodo è che può essere utilizzato solo per un piccolo numero di SNPs e per alcuni esempi in una sessione di lavoro.

Per future applicazioni, questo metodo può essere utilizzato per studi predittivi riguardanti la formazione di placca e progressione di aterosclerosi analizzando i genotipi pazienti per il polimorfismo di TBXA2R C924T. Inoltre, questo metodo poteva identificare i soggetti più suscettibili ai processi aterotrombotici, in particolare, i pazienti ad alto rischio trattati con aspirina. Infine, questo metodo potrebbe essere applicato per studiare altri polimorfismi coinvolti nella medicina personalizzata per farmaci specifici (ad esempio, gli anticoagulanti e anticonvulsivanti) al fine di comprendere il dosaggio del farmaco appropriato e l'individuo farmacologico e risposta clinica per ogni paziente prima di iniziare la terapia e per evitare gli effetti negativi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAsymphony SP	QIAGEN	937055
Spectrophotometer	EPPENDORF	6131-02222
UV-transilluminator	UVP	732-110
PCR tubes	EPPENDORF	H0030121589
PCR thermal cycler	EPPENDORF	5331-03721
Pipettors and filter tips	EPPENDORF	H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus	DIATECH PHORESIS 10	RI002-10
Dry block heater	TWIN INCUBATOR	DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit	QIAGEN	931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase)	DIATECH AND TAKARA	T0100 AND R0001DM
Taq polymerase	TAKARA	R0001DM
dNTP mixture	DIATECH  pharmacogenetics	NM001	dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers	DIATECH  pharmacogenetics	\\
Restriction enzyme RsaI	New England biolabs	R0167L
Restriction enzyme 10x buffer	New England biolabs	R0167L
Agarose	Sigma	A9539	DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base	Sigma	T6066
Boric acid	Sigma	B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0	Sigma	E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate	Sigma	E3678	prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL)	Sigma	E8751
Bromophenol blue	Sigma	B0126
Xylene cyanol FF	Sigma	X4126
Glycerol	Sigma	G5516
DNA size marker	DIATECH  pharmacogenetics	R1002-10	Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved)	DIATECH  pharmacogenetics	\\