Impianto degli innesti vascolari elettrofilate con struttura ottimizzata in un modello del ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo di elettrofilatura modificate per fabbricare gli innesti vascolari PCL con fibre spesse ed i grandi pori e descrivere un protocollo per valutare l'efficacia in vivo in un modello del ratto di sostituzione dell'aorta addominale.

Abstract

Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare macroporosa innesto vascolare di PCL e descrivere un protocollo di valutazione utilizzando un modello del ratto di sostituzione dell'aorta addominale. Gli innesti vascolari elettrofilate possiedono spesso relativamente piccoli pori, che limitare l'infiltrazione delle cellule in innesti e ostacolano la rigenerazione e rimodellamento delle neo-arterie. In questo studio, gli innesti vascolari PCL con fibre più spesse (5-6 µm) e più grandi pori (~ 30 µm) sono stati realizzati utilizzando una tecnica di lavorazione modificate. Le prestazioni a lungo termine dell'innesto è stata valutata tramite impianto in un modello di ratto dell'aorta addominale. Analisi di ultrasuono hanno mostrato che gli innesti rimasero brevetti senza aneurisma o stenosi che si verificano anche dopo 12 mesi dall'impianto. Struttura macroporosa migliorato il ingrowth delle cellule e così promosso tessuto rigenerato a 3 mesi. Ancora più importante, non c'era nessun segno di rimodellamento negativi, come la calcificazione all'interno della parete dell'innesto dopo 12 mesi. Pertanto, con modificate macroporosa elaborazione gli innesti vascolari elettrofilate PCL tenere potenziali per essere un sostituto dell'arteria per l'impianto a lungo termine.

Introduzione

Gli innesti vascolari fatti da polimeri sintetici sono ampiamente utilizzati in clinica per la terapia delle malattie cardiovascolari (CPV). Purtroppo, nel caso di innesti vascolari di piccolo diametro (D < 6 mm) non sono presenti prodotti di successo disponibile dovuto la pervietà bassa innescata dalla velocità del flusso sanguigno ridotto, che spesso porta a trombosi, iperplasia intimale e altri le complicazioni¹.

Ingegneria tissutale fornisce una strategia alternativa per realizzare evidenza a lungo termine e l'omeostasi basato su una rigenerazione vascolare impalcatura-guidata e ricostruzione. In dettaglio, l'innesto vascolare, come un modello tridimensionale, potrebbe fornire supporto meccanico e strutturale durante la rigenerazione del tessuto vascolare e influenza funzioni cellulari, tra cui l'adesione delle cellule, la migrazione, la proliferazione, e secrezione di matrice extracellulare². Fino ad ora, sono stati valutati vari polimeri sintetici per applicazioni in ingegneria del tessuto vascolare. Tra questi polimeri, poly(ε-caprolactone) (PCL) è stato intensamente studiato a causa delle cellule di buona compatibilità e lento degrado che vanno da parecchi mesi a due anni³. Nel ratto dell'aorta modello^4,5,6, innesti vascolari PCL elaborati da elettrofilatura espone eccellente integrità strutturale e la pervietà, l'invasione delle cellule come pure continuamente aumentato e neovascolarizzazione nella parete dell'innesto per fino a 6 mesi. Tuttavia, rimodellamento tissutale negativi, tra cui la regressione delle cellule e vasi capillari e calcificazione, inoltre sono stati osservati timepoints più a lungo, fino a 18 mesi.

Cellularization dell'innesto vascolare è un fattore chiave per determinare la rigenerazione tissutale e rimodellamento⁷. Elettrofilatura, come una tecnica versatile, è stato ampiamente impiegato per la preparazione di innesti vascolari con struttura fibrosa nano⁸. Purtroppo, la struttura di poro relativamente piccolo conduce spesso ad infiltrazione cellulare insufficiente nell'innesto vascolare elettrofilate, che limita la rigenerazione successiva del tessuto. Per risolvere questo problema, diverse tecniche sono state tentate per aumentare la dimensione dei pori e la porosità totale, tra cui il sale/polimero lisciviazione^9,10, modificazione dell'apparato collettore, post-trattamento di radiazione laser¹¹ , ecc. Infatti, la struttura degli innesti elettrofilate (tra cui il diametro della fibra, la dimensione dei pori e porosità) è collegato strettamente al trattamento condizioni^12,13. Durante elettrofilatura, il diametro della fibra può essere facilmente controllato modificando i parametri, quali la concentrazione della soluzione polimerica, portata, tensione, ecc. ^{14 , 15}, e di conseguenza, la dimensione dei pori e la porosità sono stati migliorati di conseguenza.

Recentemente abbiamo segnalato un innesto di elettrofilate PCL modificato con struttura macroporosa (fibre con diametro di 5-7 µm e pori di 30-40 µm). L'impianto in vivo mediante la sostituzione dell'aorta addominale del ratto ha mostrato alto tasso di pervietà, come pure buona rigenerazione endotelizzazione e muscolo liscio a 3 mesi post-intervento chirurgico¹⁶. Ancora più importante, nessun rimodellamento del tessuto negativo compreso regressione calcificazione e cella potrebbe essere osservato anche dopo un anno di impianto.

Protocollo

L'uso di animali da esperimento è stato approvato dal animale esperimenti etico Comitato di Nankai University e svolte in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. fabbricazione di innesti elettrofilate PCL

Nota: Nel presente documento, una tecnica di elettrofilatura è stata utilizzata per fabbricare gli innesti vascolari.

1. Preparare soluzioni PCL di 25 wt % e 10% in peso, sciogliendo PCL in una miscela di metanolo e cloroformio, rispettivamente, (rapporto volume 1:5), a temperatura ambiente (TA) per 12 h.
2. Caricare la soluzione PCL in una siringa di vetro da 10 mL.
3. Posizionare la siringa con un ago 21G.
4. Posizionare il mandrino in acciaio inox (2 mm di diametro, 25 cm di lunghezza) lo strumento di raccolta.
5. Per gli innesti più spessa-fibra, utilizzare la soluzione PCL del 25% in peso, la distanza di lavoro di 17 cm dalla punta dell'ago al collezionista, portata di 8 mL/h e la tensione di 11 kV come i parametri di elettrofilatura. Per gli innesti di diluente-fibra, utilizzare la soluzione PCL di 10% in peso, distanza di lavoro di 20 cm dalla punta dell'ago al collezionista, una portata di 2 mL/h e la tensione di 18 kV come i parametri di elettrofilatura.
6. Assicurare che gli innesti ottenuti siano immessi nel vuoto durante la notte per rimuovere il solvente residuo. Sterilizzare tutti gli strumenti prima della procedura e mantenere asettiche.
7. Prima dell'impianto, è necessario disinfettare gli innesti di immergendole in 10 mL di etanolo al 75% per 30 min e poi esporli ai raggi UV durante la notte.
8. Misure di dimensione del poro e fibra: calcolare il diametro medio della fibra utilizzando software ImageJ basato sulla scansione immagini di microscopia elettronica (SEM).
9. Prove meccaniche dei ponteggi:
   1. Tagliare i ponteggi tubolari in sezioni di 3 mm di lunghezza con una lama di rasoio. Misurare lo spessore degli scaffold utilizzando un micrometro.
   2. Posizionare i ponteggi tubolari su una macchina con una capacità di carico di 100 N. prove di trazione
   3. Fissare i ponteggi con un 1 mm di distanza inter-morsetto e tirare longitudinalmente ad un tasso di 10 mm/min fino alla rottura. Misurare la resistenza alla trazione e allungamento a rottura. Calcolare il modulo di Young della regione lineare iniziale (fino al 5% di deformazione) della curva sforzo-deformazione.

2. ratto Aorta addominale l'impianto modello

Nota: Tutti i materiali e gli strumenti utilizzati nella chirurgia sono sterili. Durante l'intervento, assicurarsi che l'operatore indossa una maschera di garze e guanti sterili per evitare le infezioni. Garantire che la temperatura ambiente è mantenuta in 27-30 ° C per mantenere la temperatura del corpo animale. Seguire le linee guida locali IACUC per quanto riguarda l'analgesia.

1. Utilizzare i ratti maschii di Sprague Dawley pesano 240-270 g come destinatari dell'innesto vascolare. Garantire che il ratto ha digiunato 24 h prima dell'intervento chirurgico. Lo scopo del digiuno ratti per 24 h è a vuoto le feci nel tratto intestinale, sufficientemente, quindi allargare orizzonte dell'operatore.
2. Sul retro del collo del ratto di afferrare e tenere la testa verso il basso, inserire l'ago di springe nella cavità addominale dell'addome più basso. Indurre il ratto per anestesia con cloralio idrato (330 mg/kg) tramite un'iniezione intraperitoneale.
3. Confermare amputate adeguata facendo in modo che il ratto ha rilassato i muscoli e la respirazione costante. Posto il ratto sotto il microscopio operatorio in posizione supina.
4. Applicare unguento oftalmico IFP petrolato sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Amministrare l'anticoagulazione (100 UI/kg) con soluzione fisiologica eparinizzata (50 UI/mL) di iniezione della vena della coda prima della chirurgia.
5. Radersi la pelliccia nella parete addominale anteriore con una lama di rasoio e pulire la pelle con soluzione di iodio e alcool medico soluzione.
6. Eseguire un'incisione laparotomia del midline con forbici chirurgiche e garantire che l'incisione è circa 4-5 cm di lunghezza e quindi esporre la cavità addominale.
7. Ritrarre e avvolgere l'intestino con una garza inumidita con soluzione fisiologica preferenzialmente.
8. La dissezione dell'aorta addominale con attenzione.
9. Identificare e legare tutti i piccoli rami utilizzando suture in nylon monofilamento di 9-0.
10. Morsetto della sezione isolata (fino a 1 cm di lunghezza) dell'aorta utilizzando due pinze vascolari. L'aorta può rimanere bloccato per 20-30 min.
11. Transetto dell'aorta addominale tra due morsetti utilizzando micro-forbici per creare luoghi anastomotic.
12. Lavare le due estremità dell'aorta con soluzione fisiologica eparinata (50 UI/mL) per rimuovere i residui di sangue.
13. Staccare il adventitia utilizzando micro-forbici.
14. Anastomotizzare l'innesto con diametro interno di 2 mm e 1 cm di lunghezza per aorta addominale del ratto con un modello di figura di otto sutura con punti di sutura di 9-0 monofilamento in nylon.
15. In primo luogo, costruire quattro anastomosi secondo la sequenza di 9, 3, 12 e 6 posizioni sul lato prossimale, quindi anastomotizzare i bordi tagliati in 4 punti di sutura tra due punti di sutura. Dopo aver terminato la sutura prossimale, suturare il lato distale con lo stesso metodo.
    Nota: Ogni punto è necessario affinché che il lato nativo è leggermente incorporato nell'innesto.
16. Rimuovere il morsetto distale per permettere al sangue di fluire nell'innesto, quindi rimuovere il morsetto prossimale.
17. Premere le estremità della sutura per fermare l'emorragia utilizzando un batuffolo di cotone sterile o una piccola garza-spugna. Premere per circa 3 minuti, finché l'emostasi.
18. Restituire l'intestino nella cavità addominale.
19. Sciacquare la cavità addominale utilizzando soluzione fisiologica tiepida con gentamicina (320 U/mL).
20. Cucire la parete addominale utilizzando una sutura in Nylon 3-0 nello strato del muscolo e la pelle, rispettivamente.
21. Luogo il ratto in una gabbia pulita ed asciutta e mettere un rilievo di riscaldamento sotto la gabbia per mantenere la temperatura corporea degli animali; quindi attendere che il topo a recuperare dall'anestesia. Partecipare all'animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
22. Dopo esso riprende conoscenza, mettere il ratto in una gabbia singola con cibo e acqua. Applicare iodio sulla ferita per prevenire l'infezione dopo l'intervento chirurgico. Tornare il ratto la compagnia di altri animali fino a quando non viene completamente ripristinata.
23. Eutanasia ratti secondo le linee guida istituzionali a intervalli di tempo predeterminati.

Risultati

Gli innesti PCL explanted a 3 mesi e 12 mesi postoperatorio e analizzati mediante tecniche istologiche standard per ematossilina ed eosina (H & E), Masson tricromica, Verhoeff-van Gieson (LCA), Von Kossa e immunofluorescenza che macchia per α-SMA, MYH, sindrome di Raynaud e l'elastina. Le immagini istologiche sono state prese utilizzando un microscopio dritto, e le immagini di immunofluorescenza sono state prese utilizzando un microscopio fluorescenti.

Discussione

L'infiltrazione delle cellule è fondamentale per la rigenerazione e rimodellamento dell'innesto vascolare in vivo¹⁶. L'infiltrazione delle cellule limitato è spesso legato ai pori relativamente piccoli dell'innesto che ostacolano la migrazione delle cellule nella parete dell'innesto. Per risolvere questa difficoltà, abbiamo sviluppato un metodo modificato per preparare con grande poro struttura gli innesti vascolari elettrofilate PCL. In dettaglio, il formato del poro aumentato con l'a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley rats	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normal saline	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloral hydrate	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparin sodium Injection	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamycin Sulfate Injection	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Mouse anti-α-SMA primary antibody	Abcam	ab7817
Mouse anti-smooth MYH primary antibody	Abcam	ab683
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody	Abcam	ab23748
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody	Abcam	ab6994
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normal goat serum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxylin and eosin (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901