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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per cheesprimono più proteine di fusione fluorescenti chimerico in piante per superare le difficoltà dei metodi convenzionali. Essa si avvale dell'utilizzo di un plasmide di espressione singola che contiene più proteine funzionalmente indipendente esprimendo cassette per ottenere co-espressione della proteina.

Abstract

Informazioni sulla localization(s) spatiotemporal subcellulare di una proteina sono fondamentale per capire le sue funzioni fisiologiche nelle cellule. Proteine fluorescenti e generazione delle proteine di fusione fluorescenti sono stati selvaggiamente utilizzati come strumento efficace per visualizzare direttamente la localizzazione della proteina e la dinamica in cellule. È particolarmente utile per confrontarli con gli indicatori ben noto organello dopo co-espressione con la proteina di interesse. Tuttavia, approcci classici per la co-espressione della proteina nelle piante solitamente coinvolgono più plasmidi di espressione indipendente e quindi hanno svantaggi che includono tempo alta efficienza bassa co-espressione e variazione del livello di espressione dispendio in genetica crossing e di screening. In questo studio, descriviamo un metodo robusto e romanzo per la co-espressione di più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. Presenta le limitazioni dei metodi convenzionali utilizzando un vettore di espressione singola che è composto di più cassette di espressione semi-indipendente. Ogni cassetta di espressione della proteina contiene i propri elementi di espressione funzionale della proteina, e pertanto può essere regolato in modo flessibile per soddisfare la domanda di espressione diversi. Inoltre, è facile e conveniente per eseguire l'assembly e manipolazione del DNA frammenti nel plasmide di espressione utilizzando una reazione ottimizzata One-Step senza ulteriore digestione e passi di legatura. Inoltre, è pienamente compatibile con le attuali tecnologie di bio-imaging fluorescente proteine derivate e applicazioni, ad esempio FRET e BiFC. Come una convalida del metodo, abbiamo impiegato questo nuovo sistema a co-express fluorescente fusa vacuolar ordinamento recettore e proteine di membrana del trasportatore secretiva. I risultati mostrano che la sua localizzazione subcellulare di prospettiva sono gli stessi come in precedenti studi di espressione transitoria sia trasformazione genetica nelle piante.

Introduzione

Proteine chimeriche fluorescenti fusione sono stati considerati come strumenti utili per studiare dinamiche intracellulare e della localizzazione subcellulare e comprendere ulteriormente le loro funzioni fisiologiche e lavoro meccanismi1,2, 3 , 4. è particolarmente utile per proteine di reporter ben noto organello co-express con la proteina in questione per illustrare meglio il suo spatiotemporal rationale, distribuzione e funzioni all'interno del sistema di endomembrane in cellule4 , 5 , 6 , 7 , 8.

Una proteina di fusione fluorescenti chimerico può essere espresso in piante tramite espressione transiente e stabile trasformazione genetica, che hanno i loro rispettivi vantaggi e limitazioni9,10,11. L'espressione transitoria di una proteina è un approccio conveniente che comprende Biobalistica bombardamento-, polietilenglicole (PEG)-, o elettroporazione-mediata DNA espressione transiente in protoplasti e Agrobacterium-mediata infiltrazione di foglia in cellule vegetali intatto, come mostrato in Figura 1A, B12,13,14,15,16. Tuttavia, la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusione multiple in una cella singola pianta richiede una miscela di diversi plasmidi di espressione indipendente. Così, gli svantaggi di impiegare più plasmidi per la co-espressione della proteina nelle piante sono più bassi livelli di co-espressione dovuto drasticamente riducono il rischio di diversi plasmidi entrano contemporaneamente le stesse cellule rispetto ad un plasmide singolo e la variazioni dei livelli di espressione della proteina causati dalla quantità incontrollabile casuale di ogni tipi di plasmide viene trasferito nella cella17,18. Inoltre, è tecnicamente impegnativo per introdurre diversi plasmidi di espressione indipendente in un singolo Agrobacterium per proteina co-espressione9,10,11. Di conseguenza, Agrobacterium-mediata della proteina espressione transitoria da infiltrazione del tabacco lascia solo è capace di esprimere un plasmide in un momento, come mostrato in Figura 1B. Al contrario, generazione di piante transgeniche che esprimono le proteine di fusione fluorescente viene solitamente ottenuta da Agrobacterium che trasporta un vettore di trasformazione binario. Tuttavia, il vettore binario che media il trasferimento genico e inserimento nei genomi delle piante è solo capace di esprimere una singola fusione fluorescenti della proteina (Figura 1B)9,10,12. La generazione di una pianta transgenica che esprime contemporaneamente diverse proteine chimeriche fluorescenti richiede più cicli di incrocio genetico e selezione, che può durare da mesi ad anni in base ai numeri dei geni di essere co-espressi.

L'occupazione di che un vettore di espressione singola per co-espressione delle proteine multiple in pianta è stato segnalato da alcuni precedenti studi19,20,21. Tuttavia, vari cicli di digestione enzimatica e legatura del DNA di molecole di DNA e vettori di spina dorsale sono solitamente richiesti per la generazione del plasmide finale per co-espressione della proteina o sovra-espressione. Qui, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e robusto per cheesprimono più proteine chimeriche fluorescenti nelle piante. È un metodo altamente efficiente e conveniente che raggiunge più co-espressione della proteina nelle piante per sia l'espressione transitoria e trasformazione stabile in maniera "classica". Impiega un singolo vettore che contiene più cassette di espressione di proteine funzionalmente indipendente per co-espressione della proteina e quindi sormonta gli svantaggi dei metodi convenzionali. Inoltre, è un sistema altamente versatile nel cui DNA manipolazioni e l'assemblaggio vengono raggiunti da una reazione di uno stadio semplice ottimizzato senza passaggi aggiuntivi di digestione del DNA e la legatura. Il principio di funzionamento è illustrato nella Figura 2. Inoltre, è pienamente compatibile con approcci attuali cellulari, biochimici e molecolari che sono basati su proteine chimeriche fluorescenti fusione.

Protocollo

1. primer Design strategia e amplificazione del DNA

  1. Progettare il primer per clonazione molecolare dei frammenti del DNA. I primer comprendono 20 sequenze di legame specifico gene bp e 20 a 25 bp 5'-fine sbalzo sequenze, che sono la sequenza complementare sovrapposta di molecole di DNA adiacenti (Vedi tabella 1 per esempio).
    Nota: Il successivo assemblaggio di ogni DNA frammenti, sollevatore di cassette di espressione di diverse proteine, e integrazione con il vettore di espressione finale tutti dipendono dal riconoscimento delle sequenze sovrapposte adiacente.
  2. Amplificare i frammenti di DNA, compreso il promotore, reporter fluorescente, gene bersaglio e terminator, che sono necessari per la costruzione di cassette espressione proteina semi-indipendente di reazioni di PCR standard con i loro corrispondenti primer e di alta polimerasi di fedeltà.
    Nota: I modelli utilizzati in questo studio per l'amplificazione del DNA sono derivati da precedenti studi15,22,23. La temperatura di annealing e l'estensione ora le reazioni di PCR sono primer e genica dipendente.

2. DNA frammento assemblaggio e costruzione di cassette di espressione della proteina

  1. Esaminare la qualità dei prodotti di PCR di primo turno tramite l'elettroforesi del DNA e quantificare mediante lo spettrofotometro. Verifica se degradazione del DNA e la contaminazione si sono verificati mediante elettroforesi su gel di agarosio 1%. Il OD260/OD280 dei prodotti di PCR dovrebbe essere tra 1.6 e 1.8.
  2. Mescolare diversi frammenti di DNA (0.05 - 0.1 pmol per ogni frammento) in una nuova provetta PCR ad un volume finale di 5 µ l.
    Nota: Molecole di DNA Mix progettato per la stessa cassetta di espressione della proteina insieme in una provetta PCR. Evitare di mescolare DNAs da cassetta di espressione diversi insieme, poiché ridurrà l'efficienza dell'Assemblea del DNA dovuto i numeri aumentanti di molecole di DNA che devono essere collegati.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  3. Preparare buffer stock x ISO 5: 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2; 1 mM deossinucleotidi (dNTP); 50 mM dithiothreitol; 25% di polietilenglicole (PEG) 8000; e 5mm nicotinamide adenina dinucleotide (NAD).
  4. Fare 1 mL 2 x master composto da 400 µ l 5 x buffer stock ISO, 7,5 unità di T5 esonucleasi, 62,5 unità di alta fedeltà della polimerasi del DNA, 5.000 unità di Taq polimerasi (Vedi Tabella materiali), e sterilizzato doppio distillato H2O.
    Nota: Questo è adattato da precedenti studi24,25,26; questi volumi dovrebbero essere ottimizzati.
  5. Aliquotare e 100 µ l di 2 x master miscela per tubo e conservare a-20 ° C.
    Attenzione: Frequenti di congelamento e scongelamento 2 miscela master x può causare bassa efficienza di assemblaggio di DNA.
  6. Aggiungere 15 µ l di 2 x master miscela al 5 µ l DNA composto e incubare a 50 ° C per 60 min.

3. costruzione del vettore per la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple nelle piante

  1. Amplificare la cassetta di espressione intera proteina semi-indipendente di un secondo turno PCR utilizzando il prodotto (0,5 - 1,0 µ l) dalla reazione isotermica Assemblea primo turno come il modello e i primer più esterno (ad es., 1-FP35S e 1-RNOS per espressione cassetta 1).
    1. Uso 1 unità della polimerasi di alta fedeltà in un volume di reazione di 50 µ l seguita da 30 cicli (94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 68 ° C per 2 min), seguito da un'estensione finale a 68 ° C per 5 min.
  2. Linearizzare la proteina finale espressione spina dorsale vettori pUC18 e pCAMBIA1300, che sono progettati per espressione transitoria della proteina e trasformazione genetica, rispettivamente, con l'aggiunta di 4 unità Sma ho in un volume di reazione finale di 10 µ l e incubare per 1 - 2 ore a 25 ° C. Inattivare l'enzima di restrizione incubando a 65 ° C per 20 min.
  3. Mix di molecole di DNA equimolare di cassette di espressione della proteina e vettore linearizzato finale in un volume di reazione finale di 5 µ l. Quindi, eseguire la ricombinazione del DNA secondo turno mescolando con 15 µ l 2 x master buffer e incubando a 50 ° C per 60 min.
  4. Utilizzare i prodotti finali della reazione isotermica ricombinazione secondo turno per trasformare competente Escherichia coli cellule (ad es., DH5α) secondo le procedure standard27. Doppio controllo colonie positive di sequenziamento del DNA e di PCR di Colonia. Estrarre i plasmidi positivi da e. coli utilizzando un kit di estrazione mini plasmide e conservare a-80 ° C.
    Attenzione: Per l'archiviazione a lungo termine, plasmidi disciolto in buffer di TE o doppio distillata H2O sono più stabili di tenerli in ceppi di Escherichia coli .

4. Biobalistica-bombardamento mediata transitoria co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple nelle piante

  1. Preparare il tabacco BY-2 cellule in sospensione e giovanile piante di Arabidopsis per il bombardamento.
    1. Cultura BY-2 cellule in medium di Murashige e Skoog (MS) con subcoltura due volte alla settimana a 25 ° C in un agitatore a 130 rpm. Filtrare le cellule BY-2 raccogliere 30 mL 3 d coltivate su un pezzo di carta da filtro in autoclave-70mm tramite una pompa di vuoto impostando la pressione di vuoto a 40 mbar.
    2. Al fine di impedire alle cellule di asciugarsi durante la procedura seguente, aggiungere qualche goccia di terreno cultura liquido di BY-2 delle cellule in una capsula Petri prima di mettere la carta da filtro (passo successivo).
    3. Trasferire la carta da filtro con le cellule BY-2 su di esso una nuova capsula Petri (85 mm x 15 mm).
    4. Superficie sterilizzare semi di Arabidopsis thaliana (Col-0) nel Vortex una miscela con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% Tween 20 per 10 min.
    5. Rotazione verso il basso i semi utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 2 s, eliminare il surnatante e lavare i semi con etanolo al 100% una volta per 30 s. pipetta fuori i semi su una nuova carta da filtro sterile in una cappa sterile. Quindi, asciugare i semi e spargerli su piastre di agar ½ MS.
    6. Conservare le piastre a 4 ° C per 48 ore prima del loro trasferimento in una camera di crescita della pianta con le seguenti impostazioni: 16 h chiaro scuro 8h baseaintensitàmoderata 120-150 µm m-2 s-1 , 22 ° C.
    7. Trasferire 7 - giorno vecchie piante di campione in un cerchio del diametro di 30 mm al centro di un nuovo piatto medio ½ MS per aumentare l'efficienza di bombardamento.
      Attenzione: Evitare di sovrapporre le piante durante il trasferimento e metterli sulla piastra di nuovo ½ MS.
    8. Aggiungere qualche goccia di ½ MS mezzo liquido sulla superficie delle piante o dei tessuti per preservare l'umidità ed evitare di seccare le piante fuori durante la procedura seguente.
  2. Cappotto di particelle d'oro con DNA plasmidico.
    1. Vortice microcarrier oro soluzione accuratamente, per un minimo di 3 preparare una nuova provetta da 1,5 mL.
    2. Aggiungere in sequenza le seguenti soluzioni nel tubo e vortice: 25 µ l (1,5 mg) oro particelle, vortice 10 s; 10 µ l di spermidina 25,46 mg/L, vortice 10 s; 5 µ l di DNA plasmidico di 1 µ g / µ l, vortex 3 min; 25 µ l di soluzione di CaCl2 277,5 mg/L, vortex 1 min.
      Attenzione: Tenere Vortex durante questo passaggio.
    3. Rotazione verso il basso il microcarriers oro utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 5 s e attentamente pipetta fuori il sopranatante senza disturbare il pellet. Lavare con 200 µ l di etanolo assoluto e risospendere il pellet Vortex per 5-10 s. Spin giù alla massima velocità per 5 s e Rimuovi l'etanolo.
    4. Risospendere le particelle d'oro in 18 µ l di etanolo assoluto e aliquota 6 sospensione di particelle di µ l in mezzo di tre macrocarriers. Lasciarli asciugare all'aria.
  3. Trasferimento del DNA nelle piante tramite bombardamento di particelle.
    1. Impostare il sistema di consegna di particelle come segue: 1100 psi, 28 mm Hg vuoto, 1 cm di distanza e distanza di volo delle particelle 9 cm.
    2. Bombardare le cellule/piante sulla piastra agar media per tre volte in tre posizioni diverse e quindi mantenere le cellule/piante buio immediatamente dopo il bombardamento.
      Attenzione: Indossare occhiali di sicurezza durante il funzionamento il sistema di consegna delle particelle a causa dell'associazione di gas ad alta pressione e particelle ad alta velocità con il sistema.
  4. Mantenere bombardate cellule/piante al buio nella camera di crescita di pianta per 6 a 72 ore prima dell'osservazione dei segnali fluorescenti. La camera di crescita di pianta impostata 24h scuro e 22 ° C.
    Attenzione: L'efficienza di espressione e l'intensità del segnale fluorescente sono promotore-, gene- e pianta/tessuto-dipendente.

5. generazione di Arabidopsis transgenico stabile cheesprimono più proteine chimeriche fluorescenti da Agrobacterium-mediata trasformazione.

  1. Scongelare le cellule competenti di Agrobacterium (PMP90) sul ghiaccio e aspettare 30 minuti, quindi aggiungere 2 µ l vettore binario (100-200 ng) (preparato in precedenza) nelle cellule competenti. Sedersi la miscela sul ghiaccio per 10 min.
  2. Trasferire il composto in una cuvetta di elettroporazione pre-refrigerati 0,1 cm. Inserire la provetta nel sistema di elettroporazione ed eseguire elettroporazione con le seguenti impostazioni: 1.6 kV, 600 ohm, 25 µF.
  3. Aggiungere 1 mL di terreno liquido SOC nella cuvetta immediatamente dopo l'elettroporazione, dispensare le cellule in una nuova provetta da 1,5 mL e incubare a 28 ° C in un agitatore orbitale orizzontale a 200 giri/min per 120 min.
  4. Centrifugare le cellule a 2.348 x g a temperatura ambiente per 5 min, scartare la maggior parte del surnatante, delicatamente risospendere le cellule pellettate con una pipetta, allarga le gambe su un piatto LB contenenti 50 mg/L igromicina B e incubare a 28 ° C per 2-3 giorni.
  5. Trasformare piante Col-0 Arabidopsis thaliana con l' agrobatterio, che contiene il vettore binario pCAMBIA1300 integrato con cassette più espressione di una proteina, mediante il metodo di28 floreale dip come descritto in precedenza per generare piante transgeniche stabile.
  6. Sterilizzare la superficie dei semi transgenici Arabidopsis mescolandole con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% Tween 20. Vortexare per 10 min. Spin giù i semi utilizzando una centrifuga superiore panchina a velocità max per 2 s, eliminare il surnatante e lavare i semi con etanolo al 100% una volta per 30 s.
  7. Pipettare i semi su una carta da filtro sterile in una cappa sterile. Da allora in poi, aria secca e spargerli sulle piastre di agar ½ MS contenente Hygromycin B per lo screening positivi progenie.
  8. Incubare le piastre a 4 ° C per 2 giorni. Poi, trasferirli nella camera di crescita della pianta e nella cultura per 7 giorni.
  9. 7 - giorno-vecchio sopravvivenza giovanile piante selezionate controllando per segnali fluorescenti sotto il microscopio a fluorescenza, quindi trasferire le piante nel terreno per ulteriori controlli di piante omozigoti.

6. trattamenti farmaceutici

  1. Per trattamenti farmaceutici, diluire ogni droga nel mezzo liquido di MS per le concentrazioni adeguate di lavoro prima dell'incubazione con le cellule o piante.
    1. Wortmannin trattamento: preparare 1 mM soluzioni di riserva di wortmannin sciogliendo wortmannin polvere in DMSO e conservare le scorte a-20 ° C. Trasferire cellule vegetali o piante giovanile nel liquido di coltura MS contenente 16,5 µM wortmammin ed incubare per 30-45 min prima di formazione immagine.
    2. Trattamento di brefeldina A (BFA): preparare 1 mM soluzioni di riserva di BFA sciogliendo polvere BFA in DMSO e conservare le scorte a-20 ° C. Trasferire cellule vegetali o piante giovanile nel liquido di coltura MS contenente 10 µ g/mL BFA per 30-45 min prima di formazione immagine.

7. analisi di co-localizzazione subcellulare microscopio confocale Imaging e proteina

  1. Trasferire le piante giovanile o cellule in sospensione su una lastra di vetro convenzionale e delicatamente messo una diapositiva di copertina in alto a sinistra per l'imaging da standard a scansione laser confocale. Utilizzare le seguenti impostazioni: 63 X acqua obiettivo (Nardi 1.4), sfondo 0, guadagno 700, dimensione pixel 0,168 mm e fotomoltiplicatore tubo rivelatore. Eccitare GFP-etichettato proteine a 485 nm e rilevare la fluorescenza a 525 nm. Per proteine RFP-etichettate, eccitare a 514 nm e rilevare a 575 nm.
  2. Calcolare il rapporto di co-localizzazione dei segnali fluorescenti utilizzando software Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) con il plug-in come descritto in precedenza8co-localizzazione Pearson-Spearman correlazione (PSC). Coefficienti di correlazione di Pearson o coefficienti di correlazione di Spearman rank sono mostrati nei risultati (Figura 4). I valori di r prodotte saranno da -1 a 1. 0 non dimostra nessun rilevabile correlazione di due segnali, mentre + 1 e -1 mostrano correlazione completa positiva e negativa, rispettivamente, di due segnali.

Risultati

Abbiamo sviluppato un metodo robusto e altamente efficiente per la co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti fusione multiple nelle piante. Attraversa le barriere del convenzionale approcci utilizzano più plasmidi separati per co-espressione della proteina, come mostrato in Figura 1A, B, via espressione transitoria o stabile trasformazione genetica. In questo nuovo metodo, generiamo un vettore di espressione singola che ...

Discussione

Qui abbiamo dimostrato un metodo novello per robustamente co-esprimono proteine chimeriche fluorescenti fusione nelle piante. Esso può essere utilizzato per l'espressione transitoria e la trasformazione genetica ed è compatibile con corrente fluorescenti su base proteica bio-imaging, molecolari e biochimici applicazioni e tecnologie9,10,13 . Inoltre, essa supera le difficoltà dei metodi convenzionali che utilizzano diversi pl...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo i membri del laboratorio Wang per utili discussioni e commenti. Questo lavoro è supportato dal National Foundation Natural Science of China (NSFC, grant No. 31570001) e Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong e città di Guangzhou (concedere 201707010024 e n. 2016A030313401) di H.W.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD-FX PolymeraseTOYOBOKFX-101
Sma INEBR0141L/S/V
Tris-HClBBIA600194-0500
MgCl2BBIA601336-0500
dNTPNEB#N0447V
DTTBBIC4H10O2S2
PEG 8000BBIA100159-0500
NADBBIA600641-0001
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseNEBM0530S
Taq DNA polymeraseNEBB9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)SigmaM5524
EthanolBBIA500737-0500
Tween 20BBIA600560-0500
AgarBBIA505255-0250
SpermidineBBIA614270-0001
Gold microcarrier particlesBio-Rad165-22631.0 µm
CaCl2BBICD0050-500
MacrocarriersBio-Rad165-2335
Rupture diskBio-Rad165-2329
Stopping screenBio-Rad165-2336
TryptoneOXOIDLP0042
Yeast ExtractOXOIDLP0021
NaClBBIA610476-0001
KClBBIA610440-0500
GlucoseBBIA600219-0001
Hygromycin BGenviewAH169-1G
WortmanninSigmaF9128
Brefeldin ASigmaSML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO)BBIA600163-0500
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
Growth chamberPanasonicMLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery systemBio-Rad165-2257
Gene PulserBio-Rad1652660
CuvetteBio-Rad1652083
Benchtop centrifugeEppendorf5427000097
Confocal microscopeZeissLSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND-2000
EPS-300 Power SupplyTanonEPS 300
Fluorescent microscopeMshotMF30
AgroseBBIA600234
AmpicillinBBIA100339
Ethylene Diamine Tetraacetie AcidBBIB300599

Riferimenti

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