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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Abstract

Espressione della proteina corretta al momento giusto e nelle giuste quantità è alla base della funzione normale delle cellule e la sopravvivenza in un ambiente veloce-cambiante. Per lungo tempo, gli studi di espressione genica sono stati dominati dalla ricerca al livello trascrizionale. Tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA non correlano bene con la produzione di proteine, e la traducibilità dei mRNAs varia notevolmente a seconda delle condizioni. In alcuni organismi, come il parassita Leishmania, l'espressione della proteina è regolata principalmente a livello traduzionale. Studi recenti hanno dimostrato che dysregulation di traduzione della proteina è associata con cancro, metabolico, neurodegenerative e altre malattie umane. Polisoma profiling è un metodo potente per studiare il regolamento della proteina di traduzione. Permette di misurare lo stato traduzionale di singoli mRNA o esaminare la traduzione su scala genomica. La base di questa tecnica è la separazione di polisomi, ribosomi, loro subunità e mRNAs gratuito durante la centrifugazione di un pattern citoplasmatico lisato attraverso un gradiente di saccarosio. Qui, presentiamo un protocollo profilatura polisoma universale utilizzato su tre diversi modelli - parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Leishmania cellule crescono liberamente in sospensione e cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare aderente, mentre testicolo di topo rappresenta un campione di tessuto animale. Così, la tecnica si adatta a tutte queste fonti. Il protocollo per l'analisi delle frazioni polisomici include rilevamento dei singoli livelli di mRNA di RT-qPCR, proteine mediante Western blot e analisi di RNA ribosomiale (rRNA) tramite l'elettroforesi. Il metodo può essere ulteriormente esteso da esame dell'associazione di mRNA con il ribosoma a livello del trascrittoma di profonda RNA-seq e analisi delle proteine associate ribosoma di spettroscopia di massa delle frazioni. Il metodo può essere facilmente regolato ad altri modelli biologici.

Introduzione

Regolazione dell'espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell'espressione genica durante la sintesi delle proteine fornisce un ulteriore livello di controllo necessario per una risposta rapida in condizioni di cambiamento di espressione. Profili, la separazione e la visualizzazione di tradurre attivamente ribosomi, polisoma (o "polyribosome") è un metodo efficace per studiare la regolazione della sintesi proteica. Anche se le prime applicazioni sperimentali è apparso in the 1960s3, polisoma profilatura è attualmente una delle tecniche più importanti nella proteina traduzione studi4. Singolo mRNA può essere tradotto da più di un ribosoma che portano alla formazione di un polisoma. Le trascrizioni possono essere bloccate sui ribosomi con cicloesimmide5 e mRNA contenente diversi numeri di polisomi possa essere separati nel processo di frazionamento polisoma da saccarosio ultracentrifugazione di pendenza6,7 , 8 , 9. analisi di RNA delle frazioni polisomici quindi permette la misura dei cambiamenti negli Stati traduzionali di singoli mRNA su scala genomica e durante diverse condizioni fisiologiche4,7, 10. il metodo è stato utilizzato anche per rivelare i ruoli di 5' UTR e 3' UTR sequenze nel controllo di mRNA traducibilità11, esaminare il ruolo dei miRNA nella repressione traduzionale12, difetti nella biogenesi dei ribosomi13 e comprendere il ruolo delle proteine associate ribosoma con malattie umane14,15. Durante l'ultimo decennio, un ruolo sempre più importante per la regolazione dell'espressione genica durante la traduzione è emerso che illustra la sua importanza nelle malattie umane. La prova per controllo traduzionale in cancro, metabolico e malattie neurodegenerative è schiacciante15,16,17,18. Ad esempio, disregolazione del controllo traduzionale eIF4E-dipendente contribuisce all'autismo relativi deficit15 e FMRP è coinvolto in stallo dei ribosomi su mRNA legati all'autismo14. Così, profili polisomici è uno strumento molto importante per studiare i difetti nella regolazione traduzionale in malattie umane multiple.

Analisi della proteina di polisomici frazioni in differenti condizioni fisiologiche analizza la funzione dei fattori connessi con i ribosomi durante la traduzione. La tecnica di profilatura polisoma è stata utilizzata in molte specie tra cui il lievito, le cellule di mammiferi, piante e protozoi10,19,20,21. Protozoi parassiti come Trypanosoma e Leishmania esibiscono limitato controllo trascrizionale dell'espressione genica. Loro genomi sono organizzati in cluster di geni coregolati polycistronic che la mancanza di trascrizione promotore-regolato22. Invece, espressione genica inerente allo sviluppo è controllato principalmente al livello della proteina traduzione e stabilità del mRNA in Trypanosomatidae specie23,24. Di conseguenza, la comprensione del controllo traduzionale in assenza di regolazione trascrizionale è particolarmente importante per questi organismi. Profilatura polisomici è un potente strumento per studiare la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in Leishmania25,26,27,28.

I recenti progressi nella rilevazione dei livelli di singoli mRNA dal real tempo quantitative PCR (RT-qPCR) e completo trascrittoma di sequenziamento di nuova generazione, nonché tecnologie di proteomica, offre una risoluzione e vantaggi di profilatura polisomici ad un nuovo livello. L'uso di questi metodi può essere ulteriormente esteso dall'analisi delle singole frazioni polisomici di sequenziamento di RNA profondo combinato con analisi proteomica per monitorare lo stato traduzionale delle cellule su una scala di genoma. Ciò permette l'individuazione di nuovi giocatori molecolari che regolano la traduzione sotto differenti condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo un polisoma universale protocollo utilizzato su tre diversi modelli di analisi: il parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Vi presentiamo consigli sulla preparazione dei lisati cellulari da organismi differenti, ottimizzazione delle condizioni di gradiente, scelta di inibitori della RNAsi e applicazione di RT-qPCR, Western blot ed elettroforesi del RNA per analizzare le frazioni polisoma in questo studio.

Protocollo

Tutti i trattamenti degli animali e la gestione dei tessuti ottenuti nello studio sono state eseguite secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Science Center secondo il National Institutes of e istituzionali Animal Care Salute benessere animale linee guida, numero di protocollo 96005. Si prega di sacrificare animali vertebrati e preparare tessuti secondo le linee guida del Comitato di uso e istituzionali Animal Care. Se in mancanza di tale comitato, consultare le linee guida sul benessere degli animali di National Institutes of Health. Adulto (> 60 giorni di età) sono stati utilizzati topi C57BL/6. Tutti gli animali e tessuti sono stati ottenuti secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Sciences Center in conformità degli orientamenti di benessere degli animali del National Institutes of Health e istituzionali Animal Care. Per l'eutanasia, un singolo mouse è stato disposto in un piccolo alloggiamento, e l'aria è stato spostato gradualmente con circa il 30% anidride carbonica per anestetizzare e ridurre il disagio dell'animale. A seguito di cessazione della respirazione, abbiamo usato la dislocazione cervicale per confermare la morte dell'animale prima della raccolta di tessuti.

Attenzione: Tutti i lavori con live Leishmania e cellule umane coltivate è stato fatto in BSL-2 certificato di laboratorio di biosicurezza.

1. preparazione dei Lysates citoplasmatica da Leishmania principali , cellule umane coltivate e tessuti di topo

Nota: Ci sono molte differenze nelle preparazioni lisate i materiali di origine diversa. Altri passi tra cui preparazione gradiente di saccarosio e frazionamento polisomici sono identici e non dipendono dalla sorgente campione.

  1. Preparazione del lysate citoplasmico maggiore di Leishmania
    1. Inoculare cellule maggiore di Leishmania (FV1 ceppo) in 30 mL di 1 x M199 media29 contenente miscela al 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina/streptomicina (100 unità e 100 μg/mL corrispondentemente)densità di 1 x 105 cellule/mL .
      Nota: Tutti i passaggi che coinvolgono le cellule maggiore di Leishmania devono essere condotta in una cappa di biosicurezza.
    2. Posizionare le cellule nell'incubatore e farle crescere a 27 ° C, fino alla fase logaritmica (metà registro corrisponde a 5 x 106 cellule/mL). Richiede solitamente circa due giorni per crescere.
    3. Aggiungere cicloesimmide maggiore di Leishmania cultura ad una concentrazione finale di 100 μg/mL di arrestare i ribosomi su mRNA tradotta. Cellule di posizione indietro nell'incubatrice per 10 min a 27 ° C.
    4. Una volta completato il trattamento del cicloesimmide, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL e li spin a 1.800 x g e a 4 ° C per 8 min. Discard surnatante.
    5. Lavare le cellule con 30 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Centrifugare a 1.800 x g e a 4 ° C per 8 min.
    6. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di DPBS.
    7. Prendere un'aliquota di cellule e mescolare con soluzione al 3,5% di formaldeide.
    8. Contare le celle di un emocitometro e determinare la loro concentrazione. Trasferire il numero desiderato di cellule in provetta microfuge. Lysate preparato da 0.5x108-2 x 108 cellule/mL è sufficiente per il caricamento di gradiente di uno saccarosio.
    9. Gira le cellule a 1.800 x g e 4 ° C per 8 min. eliminare il supernatante.
    10. Risospendere il pellet cellulare sul ghiaccio in 1 mL di tampone di lisi contenente inibitori di proteasi e RNasi inibitore (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10mm MgCl2, 2mm DTT, 1% NP-40, 1 x inibitore della proteasi cocktail (privo di EDTA), inibitore di RNAsi 200 unità/mL).
    11. Passare a lisato attraverso un ago di 23 gauge tre volte. Il lisato dovrebbe diventare trasparente dopo il passaggio attraverso l'ago.
    12. Centrifuga a 11.200 x g e a 4 ° C per 10 minuti chiarire lisato. Trasferire il chiarificato lisato di un nuovo tubo e tenerlo su ghiaccio fino al ultracentrifugazione di pendenza del saccarosio.
    13. Raccogliere 400-500 μL del lisato come input (per analisi successive), congelare subito in azoto liquido per analisi future della proteina o aggiungere Reagente di purificazione RNA prima del congelamento per l'analisi del RNA.
  2. Preparazione del lysate citoplasmatica da cellule HeLa umane coltivate
    1. Dividere le celle HeLa e semi in 20 mL di terreno DMEM contenente miscela al 10% FBS e penicillina/streptomicina (100 unità e 100 μg/mL corrispondentemente) con cella conteggio 2 x 105 cellule/mL in un piatto di 15 cm.
    2. Crescere le cellule HeLa a 37 ° C, 5% CO2 per la transfezione del DNA del plasmide di 20-24 h. eseguire secondo i protocolli del produttore.
    3. Propagare le cellule per 24 ore dopo la trasfezione a 37 ° C, 5% CO2.
    4. Aggiungere cicloesimmide coltivate cellule HeLa alla concentrazione finale di 100 μg/mL di arrestare i ribosomi su mRNA tradotta e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C, 5% CO2. Aspirare il medio. Lavare le cellule due volte con DPBS fredda su ghiaccio.
    5. Aggiungere 500 μL di tampone di lisi (20 mM HEPES-KOH a pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1mm DTT, 0,5% NP-40, inibitore della proteasi 1x cocktail (EDTA-free), 200 unità/mL di eparina di inibitore o 1 mg/mL di RNasi) alla piastra e raschiare le cellule sul ghiaccio.
    6. Trasferire le cellule lisate al tubo del microfuge. Regolare la concentrazione di NP-40 al 0,5% e MgCl2 a 5 mM secondo l'aumento del volume del campione.
    7. Passare a lisato attraverso un ago di 23 gauge 3 - 6 volte.
    8. Spin a 11.200 x g e a 4 ° C per 8 min a chiarire lisato. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Utilizzare uno spettrofotometro per valutare l'efficienza di lisi delle cellule e per determinare la quantità di campione per il caricamento sul gradiente. Aggiungere 10 μL di campione in 0,5 mL di 0,1% sodio dodecil solfato (SDS). In bianco contro 0,1% SDS. Misurare l'assorbanza a 260 nm. Valore di assorbanza previsto è di circa 15-20 unità/mL.
    9. Diluire tutti i campioni con tampone di lisi per lo stesso valore di assorbanza prima centrifugazione in gradiente di saccarosio. Mantenere i campioni su ghiaccio fino a centrifugazione in gradiente di saccarosio.
  3. Preparazione del lysate citoplasmico dal testicolo di topo
    1. Sezionare il testicolo di topo. Praticare una piccola incisione nella tunica albuginea e raccogliere i tubuli seminiferi dei testicoli e trasferirli in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di DPBS completati con 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
    2. Mescolare energicamente il tessuto capovolgendo più volte. Consentire il tessuto a stabilirsi a gravità unità sul ghiaccio per 5 min.
    3. Rimuovere e gettare il tampone nuvoloso contenente cellule connettivali e frammenti di tessuto. Ripetere la procedura 2-3 volte. La pallina bianca restante è arricchita per tubuli seminiferi e le cellule germinali.
    4. Trasferire il pellet di tubulo seminifero ad un tubo del microcentrifuge 2ml e spin a 500 x g per 1 min. scartare il surnatante.
    5. Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1mm DTT, 0,5% NP-40, inibitore della proteasi 1x cocktail (privo di EDTA), eparina di 1 mg/mL o 200 unità/mL di inibitore di RNasi) ai tubuli. Utilizzare una pipetta per triturare il tessuto.
    6. Trasferire la sospensione ad un piccolo (0,5-1,0 mL) lisata omogeneizzatore. Distruggere il tessuto con sette-otto colpi il pestello di vetro.
    7. Trasferire il lisato una microcentrifuga da 1,5 mL.
    8. Centrifugare il campione a 12.000 x g e a 4 ° C per 8 min cancellare il lisato. Trasferire il surnatante un nuovo tubo e conservare il ghiaccio fino al caricamento su gradiente di saccarosio.
    9. Raccogliere 50 μL del lisato come esempio di input, congelarlo subito a-80 ° C per l'analisi della proteina di futuro; o aggiungere il reagente di purificazione RNA prima del congelamento per l'analisi del RNA.

2. ultracentrifugazione e preparazione di gradiente di saccarosio

  1. Preparare due soluzioni gradiente di saccarosio (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10mm MgCl2, 1 millimetro DTT, inibitore di proteasi x 1 cocktail), contenente saccarosio di 10% o 50% di saccarosio. (Tris-HCl, pH 7.4, può essere utilizzato invece di HEPES). Aggiungere 200 unità/mL eparina inibitore o 1 mg/mL di RNAsi secondo il disegno sperimentale. Inserire un tubo ultracentrifuga per rotore SW 41 il blocco segnapunti e tracciare la linea lungo il livello superiore del blocco. Il tubo di trasferimento in un rack stabile.
  2. Prendere una siringa da 10 mL con dispositivo di stratificazione attaccato e riempire la siringa con la soluzione di 10% di saccarosio (preparata come sopra). Delicatamente di rilasciarlo nella parte inferiore del tubo ultracentrifuga finché raggiunge il marchio sul tubo.
  3. Riempire un'altra siringa con soluzione di saccarosio al 50% e inserire delicatamente il suo dispositivo di stratificazione attraverso lo strato di saccarosio di 10% per il fondo della provetta. Rilasciare con soluzione di saccarosio a partire dalla parte inferiore fino a raggiungere il marchio sul tubo. Sigillare il tubo con il tappo fornito.
  4. Per preparare il gradiente di saccarosio, ruotare il dispositivo di gradiente maker ON. La piastra usando l'alto o verso il basso i pulsanti di livello e premere DONE. Livellamento è importante per la linearità della sfumatura.
  5. Dopo il livellamento della piastra premere GRAD per aprire il menu sfumato. Vai all'elenco gradiente dal menu e selezionare il rotore SW 41 Ti. Scegli il gradiente di saccarosio desiderata dall'elenco del menu utilizzando i pulsanti su e giù . Premere USA.
  6. Impiattare il supporto tubo gradiente gradiente maker. Trasferire il tubo nel supporto. Fino a 6 gradienti possono essere preparati allo stesso tempo. Premere Esegui. Il creatore di sfumato consente di ruotare i tubi alla velocità programmata e angoli formando una sfumatura lineare. Ci vorranno solo pochi minuti per preparare la sfumatura.
  7. Quando il processo è completato, è possibile posizionare i tubi in un rack. Togliere i tappi. Rimuovere lo stesso volume come il volume del campione dalla parte superiore dei tubi ultracentrifuga.
  8. Accuratamente caricare 400-500 μL di lisato contenente 15-20 unità di260 di polisomi sulla parte superiore. Posizionare i tubi nei secchi rotore e loro equilibrio.
  9. Centrifuga a 260.000 x g e a 4 ° C per 2 h con rotore SW 41.

3. polisoma frazionamento e raccolta del campione

Nota: Mentre lisati preparazioni hanno alcune differenze a seconda dell'origine, i protocolli di frazionamento di preparazione e polisoma gradienti sono lo stesso per tutti i tipi di lisati.

  1. Dopo aver completato l'ultracentrifugazione, mettere i secchi di rotore con i tubi sul ghiaccio. Girare frazione collezionista e gradienti frazionatore ON. Fare clic su scansione dal menu frazionatore. Mettere un rack con 24 tubi di raccolta nella bacinella di raccolta di frazione.
  2. Riempire un serbatoio di risciacquo sul lato il frazionatore con acqua deionizzata. Premere il tasto di risciacquo per 10 s a sciacquare la pompa il frazionatore. Collegare un adattatore di risciacquo con la siringa riempita con acqua per il pistone per la taratura.
  3. Aprire il software frazionatore sul computer. Premere calibrare. Utilizzare le impostazioni di DEFAULT e premere OK. Essere pronti a iniettare acqua dalla siringa.
  4. Premere OK per eseguire la calibrazione. Iniziare immediatamente l'iniezione dell'acqua per il prossimo 5 s. Durante questo tempo, acqua fluirà attraverso la cella di flusso rivelatore UV e lo strumento sarà calibrato. ZERO calibrazione completata apparirà il segno. Lo strumento è pronto per il frazionamento.
  5. Rimuovere l'adattatore di risciacquo con la siringa. Fissare una punta al pistone del frazionatore.
  6. Aprire la chiave di aria in ottone aria valvola e premere per 10 s a tubo asciutto e cella di flusso. Chiudere la valvola dell'aria.
  7. Rimuovere il tubo gradiente dal secchio rotore delicatamente e inserirlo nel rack. Applicare il cappuccio del supporto tubo alla parte superiore del tubo e attentamente spostare il tubo nel supporto del tubo e bloccarlo in posizione.
  8. Collocare il supporto sotto il pistone del frazionatore. Spesso, bande polisomici possono essere visto ad occhio. Introdurre le impostazioni desiderate per numeri di frazione e volume (24 frazioni a 500 μL/frazione sono di solito sufficienti). Nome del file in modo appropriato. Premere OKe poi Andare al grafico . Nella finestra successiva, premere Avvia scansione. Appariranno le impostazioni, premere OK. Il collettore si sposterà dalla grondaia per la prima frazione e il pistone si sposterà nel tubo. Quando il pistone raggiunge l'inizio della sfumatura sarà lento per la velocità selezionata e le frazioni verranno raccolti. Una volta completato, il pistone si muove fuori dal tubo gradiente.
  9. Aprire la chiave di aria in ottone aria valvola e premere il frazionatore per recuperare l'ultima frazione.
  10. Spostare i tubi dal rack sul ghiaccio.
  11. Aggiungere 2 volumi di reagente di purificazione di RNA da ogni frazione e flash congelato in azoto liquido fino alla purificazione del RNA. In alternativa, se la proteina deve essere analizzato, è possibile aggiungere acido tricloroacetico alla concentrazione finale di 10% di loro concentrarsi per Western blotting (Vedi sezione 8).

4. preparazione di RNA sintetico In Vitro per la normalizzazione dei mRNAs livelli durante l'analisi dei dati RT-qPCR

Nota: L'e. coli OmpA mRNA viene utilizzato in questo protocollo per la normalizzazione. Eventuali altri RNA che non dispone di ampia identità con il mRNA dell'organismo studiato (mammiferi o Leishmania) può essere utilizzato.

  1. Preparare il frammento di DNA OmpA contenente la sequenza del promotore SP6 da una reazione di PCR standard da un plasmide contenente OmpA gene30.
  2. Preparare 100 µ l della miscela: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2mm spermidina, 10 mM DTT, 3mm ATP, CTP, di 3 mM 3 mM UTP, 3mm GTP, 0,5 U/μL RNasi inibitore, 1 μg di OmpA PCR del DNA, 3 μL SP6 RNA polimerasi , 0,005 U/μL pirofosfatasi.
  3. Incubare a 40 ° C per 2 h.
  4. Purificare il RNA di un kit di purificazione di RNA.
  5. Misurare la concentrazione di spettrofotometro ed esaminare mediante elettroforesi su gel di agarosio.

5. RNA isolamento da frazioni gradienti e preparazione del cDNA

Nota: Procedere direttamente con questo protocollo per la purificazione di RNA se un inibitore di RNAsi è stato usato come inibitore della ribonucleasi. Tuttavia, quando viene utilizzato come un inibitore della ribonucleasi, eparina inibiscono la trascrittasi inversa utilizzata nella preparazione di cDNA. Pertanto, sarà necessari ulteriori purificazione di RNA se l'eparina è stata utilizzata nel buffer di lisi e sfumatura. Vedere la sezione 6 per preparare il RNA per la sintesi di cDNA se l'eparina è stata usata.

  1. Scongelare i campioni contenenti il reagente di purificazione di RNA, aggiungere 20 ng di RNA sintetico come controllo interno per la normalizzazione di RT-qPCR risultati. Procedere con la preparazione di RNA secondo il protocollo del produttore tranne una modifica. Aggiungere 1 µ l di precipitazione di isopropanolo preventiva di RNA grado glicogeno (20 µ g). Sciogliere il pellet di RNA in 20-25 µ l di acqua RNAsi-libera.
    Nota: Glicogeno funge da un vettore e aiuta a evitare perdite e visualizzare la pallina del RNA durante la purificazione. OmpA mRNA viene utilizzato per ulteriore normalizzazione nelle reazioni di RT-qPCR.
  2. Misurare la concentrazione di RNA mediante spettrofotometro per garantire rendimento adeguato. Combinare volumi uguali di frazioni di RNA contenenti 40S, 60S e monosomi come prepolysomes. Le frazioni contenenti 2-4 ribosomi combinano come luce polisomi e frazioni con 5-8 ribosomi combinano come pesante polisomi.
  3. Utilizzare 5-10 µ l di RNA da frazioni combinate per preparare cDNA utilizzando un kit e seguendo le raccomandazioni del produttore.
  4. Aggiungere 80 µ l di acqua gratuita nucleasi a 20 µ l di cDNA. Congelare i campioni di cDNA a-20 ° C.

6. RNA purificazione dalla contaminazione di eparina

Nota: L'eparina inibisce l'elaborazione di enzimi come la trascrittasi inversa dell'acido nucleico. Pertanto, utilizzare questo protocollo di purificazione supplementare quando l'eparina è usata nel buffer di lisi e/o della sfumatura.

  1. Aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 1 M per i campioni di RNA purificati.
  2. Mescolare i campioni e incubare in ghiaccio per 1 h.
  3. Girare i campioni a 16.000 x g e a 4 ° C per 15 min.
  4. Eliminare il surnatante più completo possibile, utilizzando una pipetta.
  5. Asciugare il pellet per circa 5 min.
  6. Risospendere il pellet nel volume iniziale di acqua RNAsi-libera.
  7. Eseguire la misurazione spettrofotometrica a 260 nm per determinare la concentrazione del RNA. Di solito, la perdita del campione è minima.

7. RT-qPCR e analisi dei dati di distribuzione di mRNA

  1. Unire 10,2 μL di acqua, 20 μL di SYBR Green, 4,8 µ l di primer specifici del gene (set di 2,5 μM ogni), 5 μL di cDNA, mescolare bene e caricare 10 μL per pozzetto in triplici copie in piastra 384 pozzetti.
  2. Coprite il piatto con pellicola adesiva e centrifugare piastra a 1.800 x g per 5 min.
  3. Utilizzando uno strumento di Real-Time PCR impostare qPCR reazione alle condizioni indicati nella tabella 1.
  4. Utilizzando il ciclo soglia (CT) i valori e la comparativa CT (ΔΔCT) metodo31 calcolare la percentuale (%) di distribuzione di mRNA in prepolysomes, luce e polisomi pesante come descritto32 con una modifica. Utilizzare RNA sintetico (OmpA qui) per la normalizzazione dei dati nell'analisi dei dati RT-qPCR. il RNA sintetico fornisce un controllo di normalizzazione che consente di calcolare i livelli relativi di mRNA e confrontarle in diverse frazioni di una sfumatura.

8. analisi delle proteine in frazioni polisomici mediante Western Blotting

  1. Da uno stock di 100% (p/v), aggiungere acido tricloroacetico (TCA) le frazioni selezionate (500 μL) ad una concentrazione finale di 10%, tenere il ghiaccio per almeno 15 min, centrifuga in una microfuge per 5 min, eliminare il surnatante, lavare due volte con acetone ghiacciata e scioglierli in 25 μL di S Buffer di caricamento del campione di DS-pagina per elettroforesi.
  2. Caricare su SDS-PAGE e condurre l'elettroforesi standard con trasferimento seguente alla membrana di PVDF. Procedere alla Western blotting33.

Risultati

In questo studio, descriviamo l'applicazione della tecnica di profilatura polisomici a tre diverse fonti: parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e testicolo di topo. Leishmania cellule crescono liberamente in mezzi liquidi in sospensione, cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare del aderente su piastre e testicolo del mouse rappresenta un campione di tessuto. Il metodo può essere facilmente regolato a altri tipi di cellule liberame...

Discussione

Frazionamento di polisoma di gradiente di saccarosio combinato con RNA e proteina analisi delle frazioni è un metodo potente per analizzare stato traduzionale di singoli mRNA o l'intero translatome e anche ruoli di fattori proteici regolazione traduzionale macchinari durante il normale stato fisiologico o malattia. Profilatura polisomici è una tecnica particolarmente adatta per studiare la regolazione traduzionale in organismi come trypanosomatids tra cui Leishmania dove controllo trascrizionale è praticament...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Ching Lee per aiuto con la registrazione audio. La ricerca è stata sostenuta dai fondi di Start-up da Texas Tech University Health Sciences Center e per il centro di eccellenza per neuroscienze traslazionali e Therapeutics (CTNT) concede PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; in parte da grant di NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca erano studiosi CISER (centro per l'integrazione di staminali formazione & ricerca) e sono stati sostenuti dal programma.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Piston Gradient FractionatorBiocomp Instruments Inc.152
Fraction collectorGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Nikon inverted microscopeNikonECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal CyclerApplied Biosystems by Life Technologies4359659
CO2 incubatorPanasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM incubatorThermo Scientific51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2NuAire Inc.NU-543-400
Revco freezerRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrifugeEppendorf5810R
CentrifugeEppendorf5424
Ultracentrifuge Rotor SW41Beckman Coulter331362
Swing-bucket rotorEppendorfA-4-62
Fixed angle rotorEppendorfF-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automated cell counterBio-Rad145-0102
HemacytometerHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax software Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad145-0011
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA Scientific1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
Syringe, 5 mLBD309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch NeedleBD10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3 flasksThermo Scientific130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubesThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion by Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)SigmaD8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Potassium Chloride (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Heparin sodium saltSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitorsRoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CycloheximideSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Ethidium BromideFisher ScientificBP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Puromycin dihydrochlorideSigmaP8833-100MG
SucroseFisher ScientificS5-3KG
Trypsin-EDTA solutionSigmaT4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase KitApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma221473-500G
Anti-RPL11 antibodyAbcamab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibodySanta Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Lithium clorideSigmaL-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Gel Loading Buffer IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Trichloracetic acid (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrateThermo Scientific34580
FormaldehydeFisher ScientificBP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)SigmaL5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 RNA PolymeraseNEBM0207S
PyrophoshataseSigmaI1643-500UN
SpermidineSigmaS0266-1G

Riferimenti

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