Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.

Abstract

L'uso della microscopia confocale come un metodo per valutare i modelli di localizzazione del peptide all'interno batteri comunemente è inibita dai limiti della risoluzione dei microscopi ottici convenzionali. Come la risoluzione di un microscopio dato non può essere facilmente migliorata, vi presentiamo protocolli per trasformare la piccola a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) in forme sferiche più grandi, facilmente imaged chiamarono Sferoplasti o protoplasti. Questa trasformazione permette agli osservatori di rapidamente e chiaramente determinare se peptidi presentare se stessi nella membrana batterica (cioè, localizzazione di membrana) o attraversano la membrana per entrare nella cellula (cioè, dispostamento). Con questo approccio, inoltre presentiamo un metodo sistematico per caratterizzare i peptidi come membrana localizzazione o dispostamento. Mentre questo metodo può essere utilizzato per una varietà di peptidi attivi di membrana e ceppi batterici, dimostriamo l'utilità del presente protocollo osservando l'interazione di Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobico (AMP), con e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.

Introduzione

Peptidi antimicrobici (amp) hanno guadagnato l'attenzione a causa del loro potenziale utilizzo in alternativa agli antibiotici convenzionali^1,2,3,4,5. Amplificatori per uccidono i batteri sia dispostamento attraverso la membrana cellulare e interagendo con componenti intracellulari quali gli acidi nucleici o di permeabilizing la membrana provocando perdite di cella contenuto⁶. Oltre al loro uso come antibiotici, dispostamento amplificatori può essere adattato per le applicazioni di consegna di droga perché essi senza interruzioni possono attraversare la membrana cellulare impermeabile^7,8. Di conseguenza, cerchiamo di capire i meccanismi di azione di gettare le basi per il loro uso nel disegno della droga fondamentali-AMP.

Microscopia confocale offre un modo per valutare i modelli di localizzazione degli amplificatori fluorescente identificati nelle cellule batteriche fornendo intuizioni loro meccanismo di azione^{9,10,11,12, 13 , 14}. identificando la membrana dei batteri, si può determinare se un peptide fluorescente contrassegnato si localizza la membrana o spazio intracellulare di una cellula batterica. Tuttavia, questa tecnica è limitata dalla piccola dimensione e rod forma di batteri, che possono rendere impegnativa a causa di limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali e l'orientamento variabile dei batteri sulla diapositiva¹⁵di imaging.

L'obiettivo del metodo presentato è quello di attivare la visualizzazione avanzata dei modelli di localizzazione del peptide fluorescente identificati usando la microscopia confocal. Visualizzazione è migliorato girando la piccola, sottile, a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) batteri in forme sferiche, allargate indicato come Sferoplasti (per ceppi gram-negativi) e protoplasti (per ceppi gram-positivi)^{16,17,18,19,20,21}. Sferoplasti e protoplasti sono più facili da immagine a causa della loro maggiore dimensione sia loro forma simmetrica, che rende l'orientamento di un batterio su un vetrino irrilevante per la sua rappresentazione. Inoltre, vi presentiamo un approccio sistematico per analizzare quantitativamente dati di microscopia confocale per caratterizzare AMPs come entrambi membrana localizzazione o dispostamento. L'applicazione di questi metodi rende più facile distinguere fluorescente etichettati modelli di localizzazione del peptide. I protocolli presentati qui possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di una varietà di agenti di membrana-attivo diverso da AMPs, compresi peptidi cellula-penetrante.

Un vantaggio di questa tecnica è che esso fornisce il meccanismo di azione degli amplificatori: approfondimenti a livello di singola cellula, che può rivelare la cellula--cellula eterogeneità¹⁵, al contrario di altre analisi di fluorescenza comunemente utilizzato per identificare il meccanismi di azione degli amplificatori, che forniscono soltanto alla rinfusa stime^{9,22,23,24,25}. L'uso di Sferoplasti e protoplasti al fine di valutare la voce di cella AMP è utile particolare²⁶ perché sono più fisiologicamente rilevanti¹⁵ rispetto ad altri modelli utilizzati per la valutazione della voce di cella, ad esempio di vescicole lipidiche²⁴.

Protocollo

1. soluzione preparazione

Nota: Preparare soluzioni descritte nei passaggi 1.1-1.9 e 1.8 – 1.11 per produrre sferoplasti di e. coli e b. megaterium protoplasti, rispettivamente.

1. Preparare 1 M Tris-Cl, pH 7,8 sciogliendo 10,34 g Tris HCl e 4,17 g di Tris OH in 50 mL di dH₂O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
2. Preparare soluzione A (20 mM MgCl₂, 0,7 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) e 11,98 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH₂O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
3. Preparare soluzione B (10mm MgCl₂, 0,8 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,05 g MgCl₂ (95,2 g/mol) e 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH₂O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
4. Preparate 0,8 M saccarosio sciogliendo 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 50 mL dH₂O in un pallone da mL 125. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
5. Preparare desossiribonucleasi 5mg/mL ho (DNasi io) sciogliendo 0,015 g dnasi I a 3 mL di dH₂O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.
6. Preparare 0,125 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8.0 sciogliendo disodio EDTA 0,698 g disidratare (372.2 g/mol) in 15 mL dH₂O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
7. Preparare cephalexin µ g/mL 600 sciogliendo 0,03 g di idrato di cephalexin (365.404 g/mol) in 50 mL di dH₂O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in una provetta conica a 4 ° C.
8. Preparate il lisozima 5mg/mL sciogliendo lisozima 0,015 g in 3 mL di dH₂O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.
9. Preparate 3% p/v Trypticase Soy brodo (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH₂O in un pallone da 2 L. Aliquota della soluzione in beute contenenti 25 mL o 100 mL TSB per essere utilizzati nella preparazione di Escherichia coli Sferoplasti o protoplasti megaterium b. , , rispettivamente. Boccette di autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o 4 ° C.
10. Preparare soluzione C (1 M saccarosio, maleate di 0,04 M, 0.04 M MgCl₂, pH 6.5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342.3 g/mol), 0,46 g acido maleico (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl₂ (95.21 g/mol) in 100 mL di dH₂O in un pallone da 250 mL. Regolare il pH a 6.5. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.
11. Preparare 200 mL di terreno di protoplasti mescolando 100 mL 3% p/v TSB e 100 mL di soluzione C in un flacone di vetro 1 L. Autoclave per sterilizzare la soluzione e conservare a temperatura ambiente.

2. preparazione della cultura durante la notte

Nota: Eseguire sezioni 2-4 usando tecniche sterili appropriate. Se lo si desidera, un ceppo batterico può contenere un plasmide per la resistenza antibiotica per ridurre la potenziale contaminazione. Se utilizza un ceppo con resistenza agli Antibiotico, è possibile aggiungere gli antibiotici necessari nei passaggi 2.1, 3.1-3.2 e 4.1 – 4.4.

1. Preparare una coltura durante la notte con la scelta di una singola colonia di batteri utilizzando una pipetta sterile e inserirlo in un tubo di cultura 14 mL contenente 2 – 3 mL di 3% p/v TSB. Incubare a 37 ° C, mentre si stringono per h 16 – 21.

3. preparazione di Sferoplasti gram-negativi Escherichia coli

1. In un pallone da 250 mL, diluire il pernottamento cultura 1: 100 in 25 mL di volume di 3% w/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 2,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,5 – 0,8 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
2. In un pallone da 250 mL, diluire questa cultura 01:10 in 30 mL di 3% p/v TSB e incubare a 37 ° C, mentre si stringono per 2,5 h in presenza di cephalexin 60 µ g/mL (347.4 g/mol) per la produzione di filamenti di singola cellula di circa 50 – 150 µm di lunghezza , che sono osservabili sotto 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1B).
3. Raccogliere i filamenti mediante centrifugazione la soluzione batterica a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min. decantare e scartare il surnatante, riservando il pellet.
4. Lavare i filamenti delicatamente aggiungendo 1 mL di saccarosio di 0,8 M, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Incubare per 1 min e poi scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
5. Aggiungere 150 µ l di 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l di lisozima di 5 mg/mL, 30 µ l di 5 mg/mL dnasi I e 120 µ l di 0,125 M EDTA nei rispettivi ordina al pellet e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.
6. Aggiungere 1 mL di soluzione A gradualmente oltre 1 min per la soluzione preparata in 3.5 utilizzando una micropipetta mentre delicatamente agitando la soluzione a mano. Incubare la soluzione per 4 min a temperatura ambiente.
7. Mettere 7 mL di soluzione di 4 ° C B in due provette coniche da 15 mL. Aggiunge la stessa quantità di soluzione preparata in 3.6 a ciascuno di questi due tubi. Centrifugare la soluzione a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min.
8. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cautela tutti ma 1–2 mL di surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet pipettando delicatamente su e giù utilizzando una micropipetta P1000. Controllare visivamente formazione Sferoplasti osservando il campione a 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1).
9. Memorizzare gli Sferoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.

4. preparazione dei protoplasti di Gram-positivi megaterium b.

1. In un pallone da 250 mL, diluire il 1:1,000 durante la notte di cultura in 100 mL di 3% p/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 4,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,9–1.0 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
2. Versare la coltura liquida in due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.
3. Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante da entrambi i tubi conici. Ogni risospendere in 2,5 mL di terreno di protoplasti e combinare le soluzioni sedimento in un singolo tubo conico. Dispensare la soluzione combinata di sedimento in un matraccio da 125 mL.
4. Aggiungere 1 mL di lisozima di 5 mg/mL e incubare per 1h a 37 ° C, mentre si stringono.
5. Monitorare la crescita dei protoplasti sotto 1.000 x ingrandimento utilizzando un microscopio ottico, rilevando eventuali irregolarità, come i batteri che vengono visualizzati come barre gonfiati invece di sfere (Figura 2). Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.
6. Decantare il supernatante e risospendere il pellet in media di protoplasti di 5 mL. Memorizzare i protoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.

5. preparazione della soluzione Peptide e tintura di membrana per l'Imaging

1. Soluzione peptide
   1. In un tubo di microfuge avvolto in carta stagnola, sciogliere 2 mg di FITC etichettato BF2 P11A, dH 800 µ l₂O. uso un peptide contenente almeno un residuo di triptofano al fine di effettuare misure di concentrazione di proteina.
   2. Spettrofotometricamente, misurare l'assorbanza della soluzione del peptide a 280 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione di peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano (5.700/Mcm).
   3. Diluire la concentrazione di peptide in dH₂O a una concentrazione finale di 100 – 200 µM. Store in un tubo di microfuge a-20 ° C avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.
2. Tintura di membrana
   1. In un tubo di microfuge, preparare un brodo di 10 mM di-8-ANEPPS (592,9 g/mol) sciogliendo 5 mg di-8-ANEPPS in 843.3 µ l di DMSO. Conservare a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.
   2. In un tubo di microfuge, preparare 1 mL di 0,03 mM di-8-ANEPPS con l'aggiunta di 3 µ l di 10 mM di-8-ANEPPS a 997 µ l DMSO. Conservare in un tubo di microfuge a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.

6. visualizzazione di e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti mediante microscopia confocale

1. Pipettare 5 µ l di Sferoplasti o protoplasti su una lastra di vetro rivestito di poli-L-lisina. Aggiungere 2 µ l di FITC etichettato AMP (100-200 µM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce.
2. Aggiungere 1 µ l della membrana della tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce. Coprire con un vetrino coprioggetti e sigillare con lo smalto di chiodo.
3. Accendere il laser confocale di microscopio e argon. Regolare il laser di argon per potenza di 20% e 20% trasmissione.
4. Impostare gli intervalli di lunghezza d'onda emissione di 499 – 532 nanometro e 670 – 745 nm per il peptide FITC-labeled emissione canale e membrana di-8-ANEPPS-labeled tintura emissione, rispettivamente.
5. Protoplasti di immagine o Sferoplasti (Figura 1 e Figura 2) con un obiettivo X 63. Utilizzare software di imaging per ottenere 8-bit, 512 x 512 composito z-stack immagini composte di 0,5 µm fette della totalità del sferoplasto o del protoplasto.
   Nota: Prendere attenta considerazione per ridurre l'emissione trapasso mentre imaging Sferoplasti e protoplasti. Vedere la discussione per i dettagli.

7. caratterizzazione della localizzazione di AMP

1. Aprire l'immagine di z-pila composito in software di imaging. Individuare la fetta più in centro di sferoplasto/i protoplasti e posizionare una regione circolare di interesse (ROI) (0,3 µm di diametro) sulla membrana (ROI 1), uno al centro del sferoplasto o del protoplasto (ROI 2) e una distanza dello spheroplast o protoplasti su misura la fluorescenza di fondo (ROI 3) (Figura 5). Evitare l'inclusione di pixel saturi. L'intensità di fluorescenza in ogni ROI può essere calcolato dal software di imaging.
   Nota: In casi quando peptide non localizza all'interezza della membrana, disegno ROI 1 in un'area della membrana dove è localizzato il peptide.
2. Utilizzare la seguente equazione per determinare il rapporto di intensità di fluorescenza del peptide intracellulare di intensità di fluorescenza del peptide di membrana:
   
   Nota: L'intensità di fluorescenza in ROI 3 viene sottratto dall'intensità di fluorescenza in ROI 2 e ROI 1 per tenere conto di fluorescenza di fondo.

Risultati

Ingrandendo i batteri e rendendoli sferica, possiamo distinguere facilmente se peptidi si localizzano la membrana batterica o traslocano facilmente attraverso la membrana batterica. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali rendono difficile distinguere se peptide segnali derivano dalla membrana o spazio intracellulare in batteri normali perché segnali localizzati alla membrana apparirà a sovrapporsi con la spazio intracellulare (Figura 3A...

Discussione

I protocolli qui presentati rendono fattibile per i ricercatori per ottenere più rapidamente più grandi dimensioni del campione di immagini batteriche perché i batteri allargati, sferici sono molto più facili da individuare, orientare e dell'immagine. Questa maggiore capacità di raccogliere dati è utile sotto diversi aspetti. In primo luogo, consente un'analisi quantitativa più sistematica dei modelli di localizzazione del peptide. Mentre le tendenze qualitative possono essere dimostrate da più piccoli insiemi di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sucrose	Sigma	S7903
Lysozyme	Sigma	L6876
Deoxyribonuclease I	Sigma	D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	106361	Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate	Sigma	C4895
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
BBL Trypticase soy broth	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	Custom ordered
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
Laser scanning confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5 II	For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		For image processing