Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

Резюме

Проволока myograph техника используется для изучения функций сосудистой гладкой мускулатуры и экран новых лекарств. Мы доклад подробный протокол для измерения Изометрические сократительную способность мыши верхней брыжеечной артерии и скрининга новых миорелаксанты гладких мышц сосудов.

Аннотация

Проволока myograph техника используется для оценки сократимости сосудистой гладкой мускулатуры в ответ на depolarization, GPCR агонисты/ингибиторы и наркотики. Он широко используется во многих исследованиях на физиологические функции сосудистой гладкой мускулатуры, патогенеза сосудистых заболеваний, как гипертония и разработки лекарств релаксант гладких мышц. Мышь является широко используется модель животных с большим бассейном модели заболеванием и генетически модифицированных штаммов. Мы ввели этот метод измерения изометрического сокращения мыши верхней брыжеечной артерии в деталях. 1.4-мм сегмент мыши сопротивление верхней брыжеечной артерии был изолирован и установлен на камеру myograph, передав две стальные провода через ее просвета. После уравновешивания и нормализации шаги судно сегмент был потенцированные high-K⁺ раствором дважды перед сужением assay. В качестве примера применения этого метода в разработке лекарств мы измерили релаксант эффект Роман природное вещество, neoliensinine, изолированных от китайских трав, эмбрионы семян Лотос (Nelumbo nucifera (Gaertn.) на мыши брыжеечных артерии. Сегменты судна, установлен в myograph камере были стимулировали раствором high-K⁺ . Когда силы натяжения этап стабильного поступательного, накопленных доз neoliensinine были добавлены к камере. Мы обнаружили, что neoliensinine был эффект миорелаксантов дозозависимый на гладких мышц, таким образом, о том, что он несет потенциальной деятельности против гипертонии. Кроме того как судно сегмент может выжить по крайней мере 4 часа после монтажа и поддерживать сократимости, вызванных high-K⁺ решения для много раз, мы предполагаем, что провода myograph система может использоваться для трудоемкий процесс скрининга наркотиков.

Введение

Система myograph небольшой сосуд, используемый здесь был для измерения Изометрические сужением сосудов малого сопротивления с внутренним диаметром от 100 до 400 мкм. изолированных малых судов (около 2 мм длиной) были вставлены два провода диаметром 40 мкм и затем были монтируется на челюсти микрометр стороне датчика и последовательно. Этот метод myograph был впервые предложил в 1972¹ и затем разработан прежде всего Mulvany и его коллеги^2,3,4,5,6. Это теперь зрелый техника стабильной оборудованием, легко производительности и стандартный нормализации процедуры^7,8,9. Мы использовали этот метод с некоторыми изменениями для измерений в мыши верхней брыжеечной артерии.

Гладких мышц сосудистой линии стены почти всех кровеносных сосудов. Их основная функция заключается в создании сил посредством сокращения в ответ на различные стимулы. Нормальный сократимости гладких мышц сосудов имеет важное значение для регулирования кровяного давления и дополнение питания¹⁰. Ненормальной регуляции артериального давления приводит к различных заболеваний, в том числе гипертонии, сердечной недостаточности и ишемия. Некоторые исследования показали, что ненормальное давление всегда связан с неблагополучной гладких мышц сосудистой сократимости^7,11,12,13. Метод myograph позволяет расследования Изометрические сократимости мыши сосудов вызванных различные стимулы, включая сосудосуживающие средства, ингибиторы и наркотиков. Успешные измерения сжатия поможет нам понять механизмы поддержания давления крови и патогенезе сосудистых заболеваний, связанных с гладких мышц и исследовать новые терапевтические подходы.

Многие китайские травы широко использовались для клинического лечения сосудистых заболеваний; Однако их эффективные ингредиенты обычно остаются неизвестными. Таким образом изоляции и выявление эффективных компонентов является очень важным для разработки новых лекарств. Технология myograph Многопроволочная предлагает простой подход для отбора активных компонентов в лекарственных растениях. Мы сообщили ряд исследований с использованием системы myograph небольшой сосуд расследовать мыши верхней брыжеечной артерии сужением и определили природных соединений с борьбе с гипертонией активность^12,,1314. Здесь, мы описываем подробный протокол для метода myograph и оценить эффект миорелаксантов neoliensinine, изолированных от эмбрионов семян Лотос (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴.

протокол

Животных манипуляции были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) модель животных исследовательский центр Нанкин университета.

1. решение подготовка

1. Приготовляют раствор HEPES-Tyrode (H-T), используя 137.0 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 1.8 мм CaCl₂, 1 мм MgCl₂∙6H₂O, 5,6 мм D-глюкозы и 10 мм HEPES, рН 7,3-7,4.
2. Приготовляют раствор HEPES-Tyrode без кальция (Ca^{2 +}-свободной H-T) с помощью 140.6 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 1 мм MgCl₂∙6H₂O, 5,6 мм D-глюкозы и 10 мм HEPES, рН 7,3-7,4.
3. Приготовляют раствор HEPES-Tyrode, с помощью 124 мм KCl (высокая K⁺) с помощью 15.7 mM NaCl, 124.0 мм KCl, 1.8 мм CaCl₂, 1 мм MgCl₂∙6H₂O, 5,6 мм D-глюкоза и 10 мм HEPES, pH 7,3-7.4.

2. эксперимент подготовка

1. Разогрейте H-T и High-K⁺ решения с использованием ванну воды 37 ° C.
2. Включите myograph системы, данных приобретение оборудования и компьютера.
3. Внимательно заполните все myograph камеры с 5 мл раствора H-T.
4. Заполнить две чашки Петри с 20 мл 4 ° C H-T и Ca^{2 +}-свободные решения H-T, соответственно и хранить на льду.
5. Заполнить с покрытием Петри 10 см с 20 мл раствора H-T и поддерживать его при комнатной температуре.

3. мыши верхней брыжеечной артерии рассечение

1. Усыпить 8-12-недельных C57BL/6J женского или мужского пола мыши на шейки матки дислокации. Прикрепить мышь с его живота вверх.
2. Смочите живота с 70% этиловом спирте. Затем вырезать кожу с ножницами вдоль вентральной midline от паха и сделать надрезы с самого начала первый разрез вниз на опорах с обеих сторон. Потяните кожу обратно с обеих сторон; Сделайте аналогичные разрезы для открытия брюшины.
3. Использование ножницами, вырезать пищевода, толстой кишки и других соединительных тканей полностью изолировать желудочно-кишечного тракта с подачей сосудистую от тела.
4. Пинцетом переместите изолированного сегмента в блюдо, содержащие холодной H-T в шаге 2.4 подготовлен и осторожно промыть ткань в растворе H-T несколько раз смывать кровь.
5. Переноса изолированного сегмента в покрытые Петри блюдо, приготовленное в шаге 2.5 и выполнения диссекции верхней брыжеечной артерии при комнатной температуре.
6. Сгладить желудка, тощей кишки, подвздошной кишки и caecum в направлении по часовой стрелке, и ПИН-код желудка и caecum на левой и правой стороне, соответственно.
7. Растянуть брыжеечных сосудистую кровати и исправить intestine с булавками подвергать расчлененных верхней брыжеечной артерии.
   Примечание: В этих условиях, артерии находятся на вершине вен.
8. Включите источник света передачи стереоскопического микроскопа и вскрыть артерии под микроскопом. Убедитесь, что весь ткань погружается в решении.
9. Зажим в жировой ткани вокруг артерий с щипцами и изолировать артерии, отрезав все соединительной ткани с Рассечение ножницами. Избегайте, ранив артерии.

4. артериальная монтажа

1. Передача и погрузиться в верхней брыжеечной артерии дерево холодной Ca^{2 +}-бесплатное решение H-T (подготовленных на шаге 2.4) путем зажима избыток артерий с щипцами.
2. Отрезать часть 1.4-мм артерии проксимальнее кишечной стенки верхней брыжеечной аркады и использовать два щипцами осторожно открыть обе стороны этого сегмента артерии.
3. Подготовка двух сегментов из нержавеющей стальной проволоки 2,5 см в длину и поместите их в том же блюдо.
4. Осторожно зажать один конец артерии, с помощью щипцов и осторожно вставьте два провода в просвет артерии по одному с помощью другой щипцов. Убедитесь, что провода хранятся прямо и не прикасайтесь эндотелия.
5. С помощью двух щипцы, зажим два стальных проводов вне резьбовые судна одновременно и тщательно переводить судно от Петри в myograph камеру, ранее заполнены раствором H-T (шаг 2.3).
6. Винт кулачки друг от друга сделать пространство для монтажа. Зажать обе стороны одной из двух вставленной провода, с использованием двух щипцами и судно в челюсть разрыв (рис. 1A).
7. Оберните обе стороны из зажимается проволоку вокруг винта челюсти, подключенных к микрометра (рис. 1B).
8. Прикрепите левый винт, поворачивая по часовой стрелке. Выпрямите проволоки с помощью правой щипцами, а затем исправить правый винт, поворачивая по часовой стрелке (рис. 1 c). Убедитесь, что судно всегда находится внутри челюсти разрыв, но не прикасайтесь челюсти, чтобы избежать повреждения.
9. Закрываете две челюсти с помощью микрометра (рис. 1 d). Убедитесь, что две челюсти находятся достаточно близко, но что они не касаться друг друга и что незакрепленные провода на вершине фиксированной проволоки.
10. С помощью правой щипцы, тщательно сложите отвинтил провод на углу челюсти, подключенных к силу датчика и оберните его по часовой стрелке вокруг правой стороны винт (рис. 1E). Затем исправьте винт. Повторите этот шаг на левой стороне провода и исправить левый винт (рис. 1F).
11. Переместите челюсти слегка расставьте, осторожно поворачивая микрометра (рис. 1 g). Избегайте растяжения судна. Используйте щипцы для перемещения провода на стороне микрометра к горизонтальной плоскости провода на стороне датчика. Тщательно поверните микрометра, так, что разрыв между двумя челюсти могут разместиться только два провода.
12. Повторите шаги 4.2 – 4.11 смонтировать артерий на других камер. Подключите все камеры к оборудованию, охватывают камер, приложите 100% кислородом и датчик температуры и начать нагрева до 37 ° C. Открыть графики программного обеспечения и нажмите кнопку Пуск в окне Диаграммы , чтобы начать запись.
13. Сбалансировать для около 20 мин.

5. Нормализация

Примечание: Чтобы стандартизировать экспериментальных условий и получения надежных физиологические реакции сосудов, нормализации процедуры является необходимым¹⁵. Согласно отношения между активной силы и внутренней окружности судна система myograph провода имеет стандартный нормализации программу для оценки внутренней окружности (IC) монтируется сосуд^{5,8, 9}. Кратко для вычисления IC (мкм), читать микрометра и входное значение как значение X и датчика выход силой, то есть, отдыхая стены натяжение (МН/мм), как значения Y. Программа будет возвращать гладкой кривой (X, Y) и рассчитать IC, соответствующий Трансмуральное давление 100 мм рт.ст. (₁₀₀IC). Судно имеет значение для нормализованных внутренней окружности (IC₁) когда активный отклик максимальна.

1. Равным нулю для всех каналов силы на устройстве и сбалансировать для еще 1-2 мин.
2. Выберите Параметры нормализации от «DMT менюи Настройка параметров следующим образом:
   Окуляр калибровка (мм/div): 0.36; Целевая давление (кПа): 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0.9; Онлайн в среднем время (в секундах): 2; Время (в секундах) задержки: 60. Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно Настройки нормализации DMT .
3. Выберите канал интерес DMT меню , чтобы открыть окно нормализации DMT для соответствующего канала. Введите значения констант в окно следующим: ткани конечными точками a1: 0.1; Ткани конечными точками a2: 4; Диаметр проволоки (мкм): 40. Окно отображает длину вычисляемого судна как 1,40 мм.
4. Читайте микрометра палаты соответствующие ткани. Введите значение в поле микрометра чтение и нажмите кнопку Добавить точку . Это значение является начальное значение X (X0). После 60 s время задержки окно отображает силу и эффективного давления (ERTP), соответствующее этому значению микрометра. Одновременно микрометра чтение поле становится активным.
5. Растяните судна, нормированный, повернув микрометра в направлении против часовой стрелки. Введите значение микрометра в поле микрометра чтение и нажмите кнопку Добавить точку . Ждать время задержки 60 s снова.
6. Повторите шаг 5.5, продолжать растянуть судна и добавить микрометра значения до тех пор, пока окно отображает значение «микрометр X₁», которое является значением вычисляемых микрометра, требуется растянуть судна, его IC₁.
7. Установите микрометра с X значение₁ .
   Примечание: Нормализованное напряжение обычно составляет 1-2 млн.

6. артерии сужением запись

Примечание: Все решения, включая H-T и High-K⁺ решения, используемые в этом разделе, были подготовлены в шаге 2.1.

1. После нормализации сбалансировать судно в камере для 15-20 мин.
   Примечание: Это не нужно изменить решение в этом шаге.
2. Вызов в сосуд с раствором High-K⁺ дважды.
   1. Бросить вызов корабля, замените решение H-T с 5 мл раствора High-K⁺ побудить сжатия 10 мин, после стирки с 5 мл раствора H-T 3 - 4 раза.
      Примечание: Типичный спад имеет максимальное усилие над 3 mN и постоянный устойчивый силой около 2,5 млн¹². Если вторая задача создает гораздо меньше силы впервые дозы, чем первая задача создает максимальное усилие ниже 2,5 млн или постоянной силы уменьшается со временем, судно отбрасывается и не будет использоваться для дальнейшего расследования.
3. Бросьте вызов корабля с 5 мл раствора High-K⁺ побудить сжатия. После 5 минут добавьте 0,5 мкл neoliensinine раствор (10 мм в ДМСО)¹⁴ в камеру для отдыха судна в конечной концентрации 1 мкм neoliensinine.
4. Когда силы является стабильным (это обычно занимает несколько минут), добавьте еще 0,5 мкл neoliensinine раствор в камеру для увеличения концентрации до 2 мкм. Добавить 1 мкл Стоковый раствор каждый раз увеличить концентрацию для 4, 6, 8 и 10 мкм для генерации t Он доза ответ кривой.
   Примечание: Фондовых и рабочие концентрации варьироваться среди наркотиков.

Результаты

Мы измеряется Изометрические сократимости верхней брыжеечной артерии мыши с помощью многопроволочной myograph системы и оценку релаксант эффект neoliensinine, очищенного от эмбрионов семян Лотос (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴. мыши сопротивление верхней брыжеечной артери...

Обсуждение

Гипертония является задачей широкого общественного здравоохранения из-за тяжелых осложнений, в том числе сердечно-сосудистых и почечных заболеваний¹⁶. Понимания патогенеза гипертензии и изучения более антигипертензивные препараты стало насущной задачей в этой области. ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650