Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Resumo

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Resumo

A maioria dos inseticidas disponíveis atualmente alvo do sistema nervoso e mutações genéticas das proteínas neurais invertebradas muitas vezes produzem consequências deletérias, no entanto, os métodos atuais para gravar a atividade do sistema nervoso de um indivíduo animal é caro e trabalhoso. Esta sucção preparação do eléctrodo de terceiro ínstar larval sistema nervoso central de Drosophila melanogaster, é um sistema tractable para testar os efeitos fisiológicos dos agentes neuroativos, determinando o papel fisiológico de vário neural caminhos para a atividade do CNS, bem como a influência das mutações genéticas a função neural. Esta preparação ex vivo requer apenas moderada dissecando a habilidade e conhecimentos eletrofisiológicos gerar reprodutíveis gravações de atividade neuronal dos insetos. Uma grande variedade de moduladores químicos, incluindo peptídeos, então pode ser aplicada diretamente ao sistema nervoso em solução com o soro fisiológico para medir a influência sobre a atividade de CNS. Tecnologias novas, genéticas, tais como o sistema de GAL4/UAS, podem ser aplicadas isoladamente ou em conjunto com agentes farmacológicos para determinar o papel dos canais iônicos específicos, transportadores ou receptores de artrópodes função CNS. Neste contexto, os ensaios aqui descritos são de interesse significativo para toxicologistas inseticida, insetos fisiologistas e biólogos do desenvolvimento para o qual d. melanogaster é um organismo modelo estabelecido. O objetivo do presente protocolo é descrever um método eletrofisiológico para permitir a medição de electrogenesis do sistema nervoso central no inseto modelo, Drosophila melanogaster, que é útil para testar uma diversidade de científica hipóteses.

Introdução

O objetivo geral desta abordagem é permitir aos investigadores medir rapidamente a electrogenesis do sistema nervoso central (CNS) no inseto modelo, Drosophila melanogaster. Este método é confiável, rápido e eficiente para realizar experimentação fisiológica e toxicológica. O CNS é essencial para a vida e, portanto, as vias fisiológicas críticas para adequada função neural tem sido explorada extensivamente na tentativa de compreender ou modificar função neural. Caracterização das vias sinalização dentro do CNS artrópodes permitiu a descoberta de várias classes químicas de inseticidas que perturbam a função neural invertebrada para induzir a mortalidade enquanto limitação das consequências fora do alvo. Assim, a capacidade de medir a atividade neural de insetos é de interesse significativo para o campo da fisiologia e toxicologia de insetos, desde que o sistema nervoso é o tecido-alvo da maioria dos inseticidas implantado¹. Ainda, continuou o crescimento do conhecimento fundamental e aplicado sobre o sistema nervoso do inseto requer técnicas avançadas de neurofisiológicas que estão limitadas a viabilidade, uma vez que as técnicas atuais são de trabalho intensivo e exigem uma despesa elevada, inseto linhas de células neurais são limitadas, e/ou acesso limitado para as sinapses centrais da maioria dos artrópodes. Atualmente, a caracterização da maioria das proteínas neurais inseto requer o alvo a ser clonado e heterologously expressa para subsequentes fármacos e eletrofisiológicas gravações, como foi descrito para os canais de potássio de inseto retificador para dentro² , inseto ryanodine receptor³, mosquito K⁺ de voltagem-sensíveis canais⁴e outros. Para atenuar o requisito de expressão heteróloga e o potencial de baixa expressão funcional, Bloomquist e colegas vistos induzir um fenótipo neuronal em Spodoptera frugiperda (Sf21) células cultivadas como um novo método para insecticida descoberta^5,6. Esses métodos fornecem uma abordagem válida para o desenvolvimento da nova química, no entanto, muitas vezes criam um gargalo intransponível para a caracterização de agentes farmacológicos, identificar mecanismos de resistência ao inseticida e caracterização dos princípios fisiológicos fundamentais. Aqui, descrevemos um método ex vivo que permite a gravação da atividade elétrica de um inseto de modelo que tem genética maleável^7,8,9 e testes padrões da expressão conhecida de neural complexos de^10,11,12 para permitir a caracterização dos mecanismos de resistência a nível do nervo, o modo de ação de drogas recentemente desenvolvidas e outros estudos toxicológicos.

Mosca da fruta, d. melanogaster, é um organismo modelo comum para a definição de sistemas neurais insetos ou mecanismo de inseticida de ação e estabeleceu-se como um organismo modelo adequado para o estudo de toxicológicos¹³, farmacológico^{14 ,15}, neurofisiológica¹⁶e fisiopatológicos^17,18,19,20 processos de vertebrados. D.melanogaster é um inseto holometábolos que realiza a metamorfose completa, incluindo um estágio larval e pupal antes de atingir a fase adulta reprodutiva. Durante todo o processo do desenvolvimento, o sistema nervoso sofre remodelação significativa nas fases de vida diferentes, mas o CNS larval será o foco desta metodologia. O CNS larval totalmente desenvolvido é anatomicamente simples com segmentos torácicos e abdominais que são fundidos e formam o gânglio ventral, que representa uma matriz de neuromeric repetidas e quase idênticas unidades^21,22. Decrescente de nervos motores originam-se da extremidade caudal do gânglio subesophageal e descer para inervar os músculos da parede do corpo e órgãos viscerais das larvas. A Figura 1 descreve a anatomia do larval Drosophila CNS.

A Drosophila barreira hematoencefálica (BBB) se desenvolve no final da embriogênese e é formada por subperineurial células gliais (SPG)²¹. As células SPG formam numerosos processos filopodia, como que se espalham para estabelecer uma folha contígua, muito plana, endoteliais, como que cobre a inteira de Drosophila CNS²³. A Drosophila BBB tem semelhanças com o BBB vertebrado, que inclui a preservar a homeostase do microambiente neural, controlando a entrada de nutrientes e de xenobióticos no CNS²¹. Este é um pré-requisito para a transmissão neural confiável e função, ainda a proteção do SNC por BBB restringe a permeação de drogas sintéticas, a maioria dos peptídeos e outros xenobióticos^24,,²⁵, que apresenta potencial problemas quando caracterizar potências de moduladores da pequeno-molécula. O método usa uma transecção simples para romper essa barreira e fornecer acesso farmacológico pronto para as sinapses centrais.
A maior força da metodologia descrita é a simplicidade, reprodutibilidade e relativamente elevado-throughput capacidade inerente a este sistema. O protocolo é relativamente fácil de dominar, a instalação requer pouco espaço, e apenas uma entrada financeira inicial é necessário que é reduzido para reagentes e consumíveis. Além disso, o método descrito é completamente alteráveis para registrar a atividade de nervo central decrescente da mosca doméstica, Musca domestica²⁶.

Protocolo

1. equipamentos e materiais

1. Prepare os componentes necessários (listados na Tabela de materiais) do equipamento para realizar gravações de eletrodo de sucção da drosófila CNS eletrofisiologia.
   Nota: Antes da experimentação, é necessário construir câmaras para dissecação de CNS da drosófila e deve ser usado para banhar os gânglios em soro fisiológico durante as gravações. Um resumo passo a passo da construção da câmara é fornecido abaixo.
2. Prepare a câmara larval.
   1. Derreta a cera negra com uma chapa quente.
   2. Despeje uma câmara que tem um volume máximo de 2-2,5 mL, 2 mL de cera derretida.
   3. Deixe a cera esfriar e endurecer por aproximadamente 2 h.
   4. Use uma lâmina de barbear para cortar um buraco na cera endurecida que irá realizar um volume de 500 µ l, que tem uma superfície de aproximadamente 0,5 cm² e uma profundidade de aproximadamente 0,25 cm.

2. equipamento e configuração de Software

Nota: A configuração da gravação extracelular é brevemente descrita abaixo.

1. Prepare o equipamento para dissecção e gravação.
   1. Posicione a preparação do tecido, microscópio, eletrodo de sucção, Micromanipuladores, fonte de luz dentro da gaiola de Faraday para reduzir o ruído e eliminar campos elétricos externos (Figura 2).
   2. Conectar-se (de preferência solda) solo e fios positivos no blindado jacaré que será conectado ao titular do banho e microeletrodos, respectivamente.
      Nota: Fios expostos e soldados podem ser cobertos com papel de alumínio para reduzir o ruído.
   3. Conectar o chão e os fios positivos a entrada 1 do AC/DC amplificador diferencial.
   4. Conecte o sistema de aquisição de dados para o amplificador diferencial AC/DC, ligando um cabo de baioneta Neill-Concelman (BNC) de entrada 1 do sistema de aquisição de dados para a saída do canal 1 do amplificador.
      Nota: Recomenda-se incorporar um eliminador de ruído de 50/60 Hz entre o software de aquisição de dados e o amplificador. O uso de um conector T BNC é necessária.
   5. Se desejado, incluem um monitor de áudio para a instalação conectando 1 entrada do monitor áudio para 1 do software de aquisição de dados de entrada.
   6. Encha a seringa de 10 mL com solução salina e conectá-lo à porta do porta-eletrodo de pressão.
      Nota: Verifique se não há bolhas de ar entre a seringa, a pelota de Ag/AgCl e a abertura do eletrodo.
2. Prepare o software para dissecção e gravação.
   Nota: O contorno dos métodos para a configuração do software é baseado no software aquisição/análise constantes da Tabela de materiais que irá digitalizar a saída elétrica crua e converter os dados para frequência de spike. No entanto, outro software pode ser usado e várias conversões de gravação podem ser usadas.
   1. Abra o software de aquisição/análise.
   2. Clique em "configurar" na barra de ferramentas principal e selecione "configurações de canal", que irão abrir uma caixa de diálogo.
   3. Reduza o número de canais totais de três.
   4. Para o canal 1, selecione um intervalo de 100 mV.
   5. Para o canal 2, clique na guia "cálculo" que vai abrir um menu drop-down. Selecione "medições cíclicas", que serão aberta uma segunda caixa de diálogo.
   6. Selecione o canal 1 como a fonte. Na medição do menu suspenso, selecione ponto de unidade em eventos. Finalmente, na área configurações de detecção, o menu drop-down selecione limiar simples.
   7. Para converter a atividade elétrica em uma trama de taxa expressada em hertz, o canal 3^rd deve ser definido no modo aritmético: na janela de entrada, digite em "1000*smoothsec(ch2,2)". Em seguida, selecione como as unidades suspensa hertz do menu.
      Nota: Gravações bem sucedidas podem ser realizadas com várias configurações diferentes de gravação, mas "Unidade spike em eventos e limiar simples" é provavelmente o mais fácil, uma vez que permite o ajuste do limiar acima a atividade de fundo para cada indivíduo gravação. Gravações sob a configuração de "Custom-fonte entrada" aumentam a reprodutibilidade dos dados assumindo que a atividade de fundo não é diferente entre as gravações.
   8. Feche as caixas de diálogo para retornar à tela principal. O eixo y deve ser expresso em Hz e o eixo x no tempo.

3. dissecar e preparar o Larval Drosophila CNS

Nota: Métodos para dissecação de CNS larval são claramente ilustrados no Hafer e Schedl²⁷, mas esses métodos publicados anteriormente reduzem o comprimento dos neurônios descendentes que são importantes para medir a frequência de pico. Aqui, um método adicional é delineado para excisar o CNS larval que mantém há muito tempo, neurônios decrescentes intactos.

1. Preparação da solução salina.
   1. Preparar a dissecção e a solução salina de gravação o seguinte no mM²⁸: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic ácido (HEPES); titula-se pH de 7.25.
2. Disse o larval Drosophila CNS.
   1. Identificar e extrair um errante de terceiro ínstar Drosophila melanogaster do frasco de cultura e lugar em 200 µ l de soro fisiológico (Figura 3A).
   2. Segure os ganchos de boca com uma pinça fina e agarrar o abdómen dos vermes com um segundo par de pinças (Figura 3B).
      Nota: Não aplique demasiada pressão no abdômen pois isto pode resultar em rasgar da fina camada cuticular o verme.
   3. Puxe gentilmente os ganchos de boca e o abdômen em diferentes direções para separar a extremidade caudal do verme da região de cabeça e expor as vísceras da larva (Figura 3).
      Nota: O CNS vai ser entrelaçada com a traqueia e aparelho digestivo. Não corte o CNS, longe de qualquer tecido, para evitar cortar os nervos periféricos decrescentes.
   4. Provoca o CNS fora do trato digestivo e traqueia com pinça (Figura 3D).
   5. Se necessário, rompa a barreira hemato-encefálica por manualmente cruza o CNS posterior dos lóbulos cerebrais com Vannas para primavera.
      Nota: Isto deve ser feito com base nas propriedades físico-químicas do produto químico a ser utilizado. A linha vermelha na Figura 4A é o ponto de transecção sugerido e o CNS necrosante com intactos troncos nervosos periféricos descendentes mostrado na Figura 4B. O CNS necrosante é pronto para experimentação após a conclusão da etapa 3.2.5.

4. extracelular gravação de Drosophila CNS.

1. Prepare-o CNS para gravação.
   1. Puxe um eletrodo de pipeta de vidro dos capilares de vidro de borosilicato para uma resistência de 5-15 mΩ.
   2. Insira o CNS necrosante na câmara de cera que contém 200 µ l de solução salina. Prenda um pino de inseto não revestido com o grampo de jacaré soldado ao fio terra e insira o pino no soro fisiológico para completar o circuito.
   3. Usando os Micromanipuladores, Oriente o eletrodo à extremidade caudal do SNC necrosante. Elimine a gravação do ruído de fundo, ajustando o nível do limiar do software de aquisição/análise antes de contatar a troncos nervosos periféricos.
   4. Atrair qualquer convenientes nervos periféricos para o eletrodo de sucção, aplicando leve pressão negativa na seringa.
      Nota: A linha de base, frequência de disparo é correlacionada com o número de neurônios atraídos para o eletrodo onde mais neurônios muitas vezes resultam em aumento da resistência do eléctrodo.
2. Começa a gravação extracelular de CNS decrescente a atividade do nervo.
   1. Iniciar a gravação do software de aquisição de dados e monitorar a linha de base disparando com frequência. Permitir que a taxa de queima equilibrar por 5 min antes da coleta de base de dados de taxa de queima.
   2. Descarte a preparação e a gravação se o padrão de disparo do tratamento controle não é um padrão de ruptura semelhante ao mostrado na Figura 5A.
      Nota: Padrão alterado de fuzilamento sugere atividade anormal ou instável do gerador de padrão central, que pode alterar a função neural.
   3. Depois de 5 min, acrescentar 200 µ l de soro fisiológico + veículo para trazer o volume total da câmara a 400 µ l para começar a disparar taxas de controle de gravação.
   4. Depois de linha de base foi estabelecido (3-5 min), retirar a 200 µ l de solução salina e adicionar 200 µ l do agente experimental solubilizado em solução salina.
      Nota: Dimetilsulfóxido (DMSO) é o solvente recomendado para compostos lipofílicos e não deve exceder 0,1% v/v.
   5. Aplicam-se as concentrações de drogas de forma serial (baixa para alta concentração) e gravar cada concentração por um período de seleção de tempo (determinado pelo investigador baseado nas propriedades químicas de drogas²⁹). Etiqueta neste ponto do tempo de aplicação da droga do software de aquisição e análise, incluindo um comentário que inclui a droga e a concentração final.
      Nota: Após 30-50 min após a dissecação, disparando a atividade do SNC diminuirá em cerca de 10-20%, portanto, devem efectuar-se controlos adequados e tratamentos com drogas não devem ultrapassar este período de tempo.
3. Analise os dados.
   Nota: Múltiplas análises podem ser executadas sobre os dados coletados, tais como mudanças no potencial de ação rajadas²⁹, amplitude de forma de onda do pico e curso do tempo e determinar as frequências de pico média após drogas tratamento^{26,30 , 31 , 32}. o mais comum é determinar a influência de uma droga tem para as frequências de pico média durante um período especificado de tempo, que é descrito abaixo.
   1. Tabulate frequências de pico média selecionando toda a região de interesse (ou seja, o período de tempo de tratamento da Toxicodependência) e determinar as frequências de pico médio automaticamente através do "Datapad" localizado na barra de ferramentas principal da aquisição/análise software.
   2. Determine a frequência de pico média do SNC após tratamento medicamentoso para a frequência de média pico do controle do veículo (linha de base). Calcular a variação percentual de disparar taxa após tratamento medicamentoso pela fórmula: (frequência de frequência/linha de base tratada) × 100.
   3. Use o disparo de frequências ou por cento de média pico de controle para cada concentração para construir uma curva de resposta de concentração com o padrão de software de gráficos.
   4. Realizar análise estatística (por exemplo, unpaired t-teste) para determinar o significado entre pontos de tempo, as concentrações ou tratamentos com drogas.
      Nota: Existem dois métodos principais para gerar e analisar curvas concentração-resposta. O primeiro método é uma concentração por preparação individual. Aqui, a taxa de aumento da concentração única é normalizada a taxa de aumento da linha de base para cada preparação. Os benefícios são reduzidos corrida para baixo da preparação devido ao reduzido tempo de gravação, enquanto as armadilhas são aumentadas dissecação tempo porque esse método será composto de 5-7 preparações individuais de CNS por concentração, e barras de erro maior sobre os dados em média conjunto. O segundo método é várias concentrações por preparação individual. Aqui, a taxa de pico para cada uma das 3-5 concentrações são normalizados para a mesma taxa de pico de linha de base. Os benefícios são menos tempo de dissecação e menor variabilidade entre Replica para concentrações de droga, enquanto as armadilhas são a exigência de um impacto de drogas e desconhecido de ação rápida de tratamentos anteriores concentração de droga em tratamentos químicos subsequentes.

Resultados

Atividade espontânea dos nervos periféricos decrescentes decorrentes do sistema nervoso central de Drosophila pode ser gravada utilizando eletrodos de sucção extracelulares com reprodutibilidade consistente. Atividade espontânea do excisado e necrosante Drosophila CNS produz um padrão cíclico de rebentar com 1-2 s do disparo com aproximadamente 1 s de perto a actividade quiescente. Por exemplo, o CNS é perto quiescente (1-2 Hz) para 0,5-1 s, seguido de uma explos...

Discussão

Os detalhes fornecidos no vídeo associado e texto forneceram etapas-chave a fim de registrar a atividade e o pico de descarga frequência de Drosophila CNS ex vivo. A eficácia de dissecação é o aspecto mais importante do método porque curto ou alguns neurônios descendentes irão reduzir a linha de base disparando a taxa que irá resultar em grandes desvios entre repetições. No entanto, uma vez que tem sido dominada a técnica de dissecação, os dados recolhidos com este ensaio são altamente r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
Vibration isolation table	Kinetic Systems	9200 series
Faraday Cage	Kinetic Systems	N/A
Dissecting Microscope on a Boom	Nikon	SMZ800N	Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier	ADInstruments	AM3000H	The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor	ADInstruments	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	A-M Systems	726300
Data Acquisition System (PowerLab)	ADInstruments	PL3504	Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
Fiber Optic Lights	Edmund Optics	89-740	Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator	World Precision Instruments	M325
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH715	Different models are acceptable
BNC cables	World Precision Instruments	multiple based on size
Glass Capillaries	World Precision Instruments	PG52151-4
Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-1000	Also can use Narashige PC-100
Black Wax	Carolina Biological Supply	974228
Non-coated insect pins, size #2	Bioquip	1208S2
Fince Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03