Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l'isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.

Abstract

Nella mucosa dell'intestino, cellule immunitarie costituiscono un'entità unica immunologica, che promuove la tolleranza immunitaria mentre contemporaneamente conferimento difesa immunitaria contro gli agenti patogeni. È affermato che di Peyer (PPs) hanno un ruolo essenziale nella rete immune mucosa ospitando diversi T effettrici e sottoinsiemi delle cellule B. Una certa frazione di queste cellule effettrici, follicolare T helper (TFH) e cellule di B del centro germinativo (GC) sono professionalizzata nella regolazione dell'immunità umorale. Quindi, la caratterizzazione di questi sottoinsiemi di cellule all'interno di PPs in termini di loro programma di differenziazione e proprietà funzionali può fornire informazioni importanti sull'immunità mucosale. A tal fine, un metodo facilmente applicabile, efficace e riproducibile di isolamento dei linfociti da PPs sarebbe prezioso per i ricercatori. In questo studio, abbiamo mirato a generare un metodo efficace per isolare i linfociti da mouse PPs con resa elevata delle celle. Il nostro approccio ha rivelato che l'elaborazione come l'uso di reagenti digestivi e agitazione del tessuto, il tessuto iniziale così come colorazione condizioni e selezione dei pannelli di anticorpo delle cellule, hanno una grande influenza sulla qualità e identità dei linfociti isolati e il risultati sperimentali.

Qui, descriviamo un protocollo che consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente popolazioni linfocitarie da PPs permettendo la valutazione di base di citometria a flusso riproducibile dei sottoinsiemi di cellule T e B concentrandosi soprattutto su sottoinsiemi di cellule TFH e GC B.

Introduzione

L'intero tratto gastrointestinale dall'inizio alla fine è addobbato con una vasta rete di linfoide che contiene le cellule immunitarie più di qualsiasi altro organo in essere umano e del mouse1. Peyer di patch (PPs) costituiscono una componente importante del ramo intestinale di questa organizzazione immune cellulare, cosiddetto tessuto linfoide associato all'intestino (GALT)2,3. All'interno di PPs, migliaia di milioni di antigeni derivati da materiali dietetici, agenti patogeni e commensale microbiota sono campionati continuamente e quando necessarie e appropriato le risposte immunitarie verso di loro sono montato così mantenere immunitario intestinale omeostasi. In questo senso, PPs può essere denominata come "tonsille del piccolo intestino". PPs sono costituiti principali sub-compartimenti: cupola subepiteliale (SED), ampie zone di B-cellula del follicolo; l'epitelio sovrastante follicolo-collegata (FAE) e la regione interfollicular (IFR) dove le cellule T sono situati4. Questa compartimentazione unica di PPs sottoinsiemi di cellule effettrici diverse consente di cooperare, conferisce quindi, immunocompetenza nell'intestino.

PPs mancano vasi linfatici afferenti, e proprio per questo motivo, gli antigeni trasportati in PPs dal piccolo intestino non sono stati condotti attraverso i vasi linfatici in contrasto con la maggior parte degli altri organi linfoidi. Invece, le cellule epiteliali specializzate situate in FAE, cosiddette cellule M, sono responsabili per il trasferimento degli antigeni luminal in PPs5. Successivamente, gli antigeni trasportati sono stati prelevati dalle cellule dendritiche (DCs) e fagociti che si trovano nella regione subepiteliale cupola (SED) sotto la FAE6,7. Questo processo di cernita di antigene da DCs in PP è fondamentale per avviare la generazione successiva di IgA che secerne le cellule9e risposta immunitaria adattativa8 .

Dovuto il pesante fardello antigenico da flora commensale e materiale alimentare, PPs host in modo endogeno attivato T effettrici e sottoinsiemi di cellule B in grande abbondanza come TFH e IgA+ GC B cellule10, suggerendo che il PPs rappresentano un sito di attivo immune risposta di11. Rilevazione di fino a 20 – 25% cellule TFH all'interno totale CD4+ T cell vano e fino a 10 – 15% GC B cellule all'interno di cellule B totali è possibile in PPs raccolti da non immunizzati giovane di topi C57BL/612. A differenza di altri tipi di cellula dell'assistente di T (cioè., Th1, Th2, Th17 cellule), TFH cellule mostrano tropismo unico in follicoli di cellule B principalmente a causa di espressione CXCR5, che promuove l'homing delle cellule TFH lungo gradienti CXCL1313. Nelle zone delle cellule di B del follicolo di PPs, TFH cellule inducono IgA classe interruttore ricombinazione e ipermutazione somatica in cellule di B attivate da cui ad alta affinità IgA producendo cellule differenziano14. Successivamente, queste cellule di plasma disecrezione migrare verso la lamina propria (LP) e regolano l'omeostasi immune nell' intestino10.

Identificazione e caratterizzazione di popolazioni di cellule TFH e GC B all'interno di PPs potrebbe consentire ai ricercatori di studiare la dinamica della risposta immunitaria umorale sotto condizioni di stato stazionario senza la necessità di modelli di immunizzazione richiede molto tempo utilizzato tradizionalmente in TFH-GC B cella studi15,16,17,18. Analizzando le cellule TFH entro PPs non è così semplice come altri sottoinsiemi di cellule. Sfide tecniche includono identificare condizioni di tessuto ideale preparazione, combinazione di anticorpo-indicatore della superficie, così come la selezione di appropriati controlli positivi e negativi. Campi di ricerca sia TFH e PP presentano grande variabilità in termini di procedure sperimentali e sono tutt'altro che conferisce un consenso per stabilire protocolli standardizzati per diversi motivi. In primo luogo, ogni sottoinsieme delle cellule all'interno di PPs tende a risentire differenzialmente condizioni di preparazione dei tessuti che richiedono ulteriori modifiche nel modo di sottoinsieme specifico delle cellule. In secondo luogo, c'è una discrepanza significativa tra i metodi segnalati per quanto riguarda i dettagli della preparazione delle cellule da PPS. terzo, il numero di studi comparativi basati su protocollo studiando tecniche di preparazione del tessuto ideale e condizioni sperimentali per PP e TFH ricerca è piuttosto limitato.

Attuali studi basati su protocollo suggeriti per PP cella preparazione19,20,21,22 non erano TFH - o GC delle cellule di B-oriented. Inoltre, alcune condizioni di preparazione del tessuto consigliati per PPs19,20 come digestione basati su collagenosi sono stati trovati per influenzare negativamente il risultato dell'identificazione di TFH tramite flusso cytometry18. Su questa base, abbiamo ragionato che un protocollo ottimizzato, standardizzato e riproducibile che può essere utilizzato per studiare la dinamica cellulare TFH e GC B all'interno di PPs sarebbe prezioso per gli investigatori lavorando su questo argomento. Questa necessità ci ha dato l'impulso per generare un protocollo migliorato e aggiornato per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti PP finemente ottimizzato per recupero cellulare, redditività ed efficienza per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle diverse T e B sottoinsiemi di cellule. Abbiamo anche mirato a escludere diversi passaggi di laboriosa preparazione suggeriti nei precedenti protocolli, quindi, riducendo le opportune manipolazioni e i tempi per la preparazione di tessuti e cellule da PPs.

Protocollo

Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state condotte sotto le linee guida secondo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. progettazione di set-up sperimentale e Mouse gruppi

  1. (Opzionale) Co-casa topi sperimentali per facilitare la trasmissione orizzontale del microbiota dell'intestino tra topi sperimentali e per ridurre la variabilità non specifici all'interno di linfociti PP. Inoltre, è possibile utilizzare controlli littermate dello stesso sesso per ridurre al minimo la variabilità.

2. escissione e passaggi di preparazione del tessuto:

  1. Rimozione chirurgica del piccolo intestino (SI)
    1. Eutanasia topi usando CO2 asfissia o ogni altro metodo equivalente approvato dal comitato di etica animale istituzionale.
    2. Trasferimento il mouse in un'area dedicata per l'asportazione chirurgica. Posizionare sul retro verso il basso e sanificare l'addome con etanolo al 70%. Eseguire una laparotomia tagliando la pelle addominale e il peritoneo lungo la linea mediana dal pube alla gabbia toracica aprendo così la cavità peritoneale.
      Nota: Eseguire la prima incisione su una zona relativamente piccola della pelle per evitare di penetrare nella cavità peritoneale e danneggiare il tessuto intestinale. Continuare l'asportazione fino al bordo anatomico desiderato.
    3. Identificare l'intestino cieco, che è un ideale punto di riferimento per la rilevazione dell'ileo terminale, che costituisce il segmento distale dell'intestino tenue.
      Nota: Caecum solitamente si trova sul lato inferiore sinistro dell'addome del mouse.
    4. Individuare la giunzione ileocaecal e fare un taglio a questo livello come distale come possibile separare l'intestino tenue dall'intestino cieco. Durante i prossimi passi, evitare il contatto fisico eccessivo con la parete intestinale perché fragile PPs comprimere facilmente al tatto.
    5. Rimuovere delicatamente l'intero piccolo intestino fino al sphincter pilorico tagliando il mesentery usando le forbici. Identificare la giunzione tra il piloro e il duodeno, e snip duodeno a questo livello, che porterà a completare il distacco del piccolo intestino dalla cavità addominale.
      Nota: (i) evitare l'iperestensione come ciò potrebbe causare la rottura della parete intestinale. (ii) volendo isolamento del linfocita LP oltre ai linfociti PP, la completa rimozione del grasso mesenterico è necessaria. Tuttavia, per l'isolamento del PP, restanti grasso mesenterico potrebbe fornire alcuni vantaggi durante la procedura di isolamento ulteriore; di conseguenza, dovrebbe essere preservata.
    6. Posto staccato piccoli intestini in una piastra a 6 pozzetti riempito con RPMI freddo + 10% siero bovino fetale (FBS) e agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti intestinali sono sommerso nei media freddi. Mantenere i tessuti sul ghiaccio durante i passaggi successivi.
    7. Dopo il numero desiderato di mouse piccoli intestini di dissezione, procedere all'asportazione di PP da raccolti piccoli intestini.
  2. Asportazione chirurgica del PPs e la preparazione della sospensione unicellulare:
    1. Delicatamente trasferimento piccolo intestino su un tovagliolo di carta nel grasso mesenterico utilizzando pinze di presa e posizionare il lato mesenterico rivolto verso il tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con freddo RPMI + 10% FBS per evitare la disidratazione del tessuto e la viscosità.
      Nota: Restanti grasso mesenterico può essere utile in questa fase perché segmenti di tessuto grasso sul sito mesenterico di SI attaccherà a mantenere il sito anti-mesenterico rivolto verso l'alto il tovagliolo di carta.
    2. Identificare il PPs, che appaiono come aggregati multi-lobulated bianchi a forma di "cavolfiore-come" sul lato anti-mesenterica della parete intestinale.
      Nota: Smascherare il contenuto luminale non è raccomandato fino a quando tutti i PPs sono asportate. Lo svuotamento del contenuto luminale potrebbe causare il crollo del PPs e impedirà il contrasto di colore tra PPs e la parete intestinale, che è molto utile per l'identificazione visiva di PPs.
    3. Dopo aver identificato i PPs sul lato anti-mesenterico, posizionare la forbice fine curvo chirurgica su PPs (curva dovrebbe affrontare) trattenente PP dal relativo bordo distale e prossimale.
      Opzionale: Spingere il PP dolcemente verso le lame della forbice utilizzando la punta di un dito. Questa manovra porterà all'esclusione meglio di PP non tessuto circostante. Asportare il PPs delicatamente, escludendo il circostante tessuto intestinale.
      Nota: (i) questo passaggio è fondamentale per ottenere il massimo rendimento delle celle PP, riducendo al minimo la contaminazione delle cellule dai vicini intestinale scomparti come LP e l'epitelio intestinale, che sono anche ricchi di cellule T. (ii) da un SI asportato dal topo C57BL/6, 5-10 PPs (dimensione media, multi-lobulated) possono essere raccolti. Puntando ancora più piccolo PPs (non multi-lobulated), raccolta di fino a 12-13 PPs per topo (C57BL/6) è possibile utilizzare questo protocollo.
    4. Trasferimento il PPs asportato ad una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti riempito con gelida RPMI + 10% FBS e mantenuto il ghiaccio con pinze o forbici chirurgiche curve.
      Nota: (i) immediatamente dopo l'asportazione del PPs, muco e contenuto intestinale sulla superficie PP possono essere puliti strofinando delicatamente il tessuto su un tovagliolo di carta. Questo passaggio vi aiuterà a migliorare la vitalità dei linfociti PP. (ii) invece di trasferire il PPs su un piatto, trasferimento di separati tubi può anche essere considerato a seconda del numero totale del campione.
    5. Opzionale: Quando l'asportazione PP e la disposizione successiva nella piastra ben sono stati completati, il numero e le dimensioni di PPs raccolti da gruppi sperimentali/mouse diverso può essere documentate scattando una foto della piastra di coltura del tessuto che contiene PPs.
    6. Preparare una serie di provette coniche da 50 mL riempita con 25 mL di RPMI + 10% FBS (preriscaldato a 37 ° C). Utilizzando un paio di forbici, tagliare il bordo di una punta di 1.000 µ l dalla distanza che permette l'aspirazione del PPs con pipetta da 1 mL. Aspirare il PPs con pipetta da 1 mL e trasferirli dalla piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti il provette coniche da 50 mL preparato.
      Nota: Utilizzare un nuovo puntale per ogni campione del mouse per evitare contaminazioni incrociate tra i campioni.
    7. Avvitare il coperchio e posizionare i tubi verticalmente in un agitatore orbitale a 37 ° C con agitazione continua a 125-150 rpm per 10 min. Nel frattempo, preparare una nuova serie di provette da 50 mL e posizionare un colino di cella di 40 µm sulla cima di ogni tubo, attraverso il quale verrà preparati sospensione unicellulare.
      Nota: (i) il passo di agitazione rimuoverà il restanti intestinali contenuto, muco e detriti cellulari, che diminuire la vitalità cellulare e recupero dei linfociti PP se non vengono rimossi. (ii) non applicare alcun tipo di enzimi digestivi sul tessuto PP perché il processo di digestione provoca una drammatica perdita di espressione di CXCR5 dalla superficie delle cellule.
    8. Dopo l'agitazione, trasferire il PPs al 40 µm cella filtro posizionato sulla parte superiore dei tubi appena preparato conica 50 mL. Utilizzo il lato arrotondato di un pistone della siringa da 10 mL, delicatamente perturbare il PPs attraverso il filtro delle cellule per generare sospensione unicellulare. Risciacquare il filtro con 15 – 20 mL di RPMI freddo + 10% FBS.
      Nota: (i) prima del filtraggio, agitare le provette contenenti il PPs orizzontalmente. Questo frullato di breve faciliterà il trasferimento di PPs in filtri a cella. (ii) utilizzando un colino di cella di 70 µm per l'isolamento di cellule immunitarie non linfoidi (ad es., monociti, macrofagi, DCs) è raccomandato.
    9. Centrifugare le sospensioni di singola cellula a 350-400 x g per 10 min a 4 ° C.
    10. Attentamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule ad una concentrazione di 10 x 106 cellule/mL. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
      Nota: (i) prima di conta cellulare, il numero totale di celle per ogni gruppo di mouse PP può essere approssimativamente stimato utilizzando la seguente formula: "0,5-1 x 106 celle x (numero di PPs) = conteggio totale delle cellule". Ulteriori diluizioni con trypan blu per il conteggio delle cellule potrebbero essere necessari. (ii) in alternativa al conteggio manuale, cella automatizzata contatori possono essere utilizzati.
    11. Trasferimento di 2-2,5 x 106 cellule nel volume appropriato (ad es., 200 µ l) in una piastra a 96 pozzetti fondo tondo.
      Nota: Per singolo colore e campioni di controllo negativo, 0,5-1 x 106 celle potrebbero essere sufficiente.
    12. Centrifugare la piastra a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
    13. Lavare le cellule in 200 µ l di tampone di macchiatura.

3. superficie dell'anticorpo che macchia

  1. Redditività di colorazione:
    1. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 100 μL di attuabilità risolvibile colorante diluito in PBS (1:1, 000). Incubare per 30 min in ghiaccio o a 4 ° C al buio.
      Nota: (i) intracellulare che macchia per la rilevazione della trascrizione fattori quali Foxp3 o Bcl-6 richiede la fissazione delle cellule. In tal caso, la vitalità non fissabile coloranti (ad es., 7-AAD, DAPI) non può essere utilizzato. (ii) per diluire la tintura di attuabilità risolvibile, non utilizzare qualsiasi colorazione buffer che contiene la proteina. I media utilizzati in questo passaggio deve essere privo di proteine. (iii) esclusione di cellule morte utilizzando vitalità colorazione è fondamentale perché le cellule morte possono causare gravi difficoltà tecniche nell'analisi di citometria a flusso attraverso l'emissione di autofluorescenza e legando gli anticorpi di superficie non specifico, che potrebbe condurre a false risultati positivi.
    2. Lavare le cellule due volte con tampone di colorazione. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
  2. Blocco di FC e superficie - strato I:
    1. Preparare la soluzione di Fc-blocco diluendo l'anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) in tampone di macchiatura.
    2. Risospendere le cellule in 20 μL di soluzione preparata di Fc-blocco. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio.
    3. Senza lavaggio, aggiungere 80 µ l di anticorpo di superficie di cocktail (Vedi tabella 1 per l'anticorpo Riepilogo) preparato alle appropriate diluizioni. Incubare in ghiaccio per almeno 30 min.
    4. Lavare due volte con l'aggiunta di buffer di colorazione eccessiva. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
  3. Superficie - livello II:
    1. Preparare soluzione colorante streptavidina diluendo streptavidina fluorocromo-coniugate nel buffer di colorazione.
    2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule con 100 μL di streptavidina pre-diluito (1: 100) soluzione di colorazione. Incubare per almeno 15 min su ghiaccio al buio.
    3. Lavare due volte con tampone di colorazione. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4° C. Scorri la piastra.
      Opzionale: Se colorazione intracellulare per il rilevamento di cellula T regolatrice follicolare non è desiderato, dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 200 μL di macchiatura buffer e trasferimento nelle provette appropriati per acquisire dati nel citometro a flusso. Quando i campioni non sono fissi, acquisizione di dati mediante citometria a flusso deve essere eseguita all'interno di 3 – 4 h per ottenere risultati accurati.

4. cellula fissazione

  1. Preparare la soluzione di lavoro di fissazione/permeabilizzazione (Fix/Perm) utilizzando i reagenti da Foxp3/trascrizione fattore di macchiatura Buffer impostato. Mescolare una parte di fissazione/permeabilizzazione concentrato con tre parti di fissazione/permeabilizzazione diluente al volume finale desiderato.
  2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 200 μL di soluzione di lavoro di correzione/Perm.
  3. Incubare la piastra in ghiaccio o a 4 ° C per 20 min. Non superare i 20 min per questo passaggio. Tempo di incubazione più lungo potrebbe diminuire notevolmente il recupero delle cellule.
  4. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra. (Opzionale) Dopo questo passaggio, si possono depositare celle fisse per diversi giorni a 4 ° C nella macchiatura tampone contenente albumina di siero bovino (BSA) o FBS fino alla successiva intracellulare macchiatura o flusso cytometry acquisizione.
  5. Risospendere le cellule in 200 μL di permeabilizzazione Buffer (x1) appena pre-diluito in acqua deionizzata purificata.
  6. Centrifugare a 350 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA).
  7. Lavare una volta con 200 μL di tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a TA.

5. intracellulare di colorazione

  1. Preparare la soluzione di Fc-blocco diluendo l'anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) nel buffer di permeabilizzazione.
    Nota: Dopo la fase di fissazione, le cellule devono essere mantenute nel buffer di permeabilizzazione fino alla fine del processo di colorazione intracellulare.
  2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 20 μL di soluzione di Fc-blocco. Incubare per 10 – 15 min a temperatura ambiente al buio.
  3. Senza lavaggio, aggiungere 80 µ l di anticorpo intracellulare cocktail (volume finale di 100 μL) pre-diluito in un tampone di permeabilizzazione. Incubare per 30 minuti a TA.
  4. Aggiungere 100 μL di tampone di Perm e centrifuga a 350 x g per 5 minuti a TA.
  5. Lavare una volta con 200 μL di tampone di permeabilizzazione, centrifugare a 350 x g per 5 minuti a TA.
  6. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione e trasferire le cellule nelle provette appropriati (volume finale di 400 μL nel buffer di colorazione) e acquisire dati tramite flusso cytometry. Campioni macchiati in piastra a 96 pozzetti possono essere eseguiti anche senza trasferire nelle provette se un citometro a flusso con opzione lettore piatto è disponibile. Questo passaggio minimizza la perdita di cellule durante il trasferimento delle cellule.
  7. Acquisire un minimo di 5 x 105 cellule totali sul citofluorimetro per essere in grado di eseguire analisi riproducibili di TFH, TFR, nonché GC B cellule.

Risultati

In contrasto con un precedente protocollo20, abbiamo osservato che PPs non sono distribuiti uniformemente in tutto il SI, ma sono localizzati più densamente verso l'estremità distale e prossimale del SI, come mostrato Figura 1A. L'analisi cytometric di flusso ha mostrato che, se seguite correttamente, il nostro protocollo dà una popolazione di linfociti PP che illustra la distribuzione di forward-s...

Discussione

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle cellule TFH e GC B. Uno dei vantaggi principali del nostro protocollo è che permette l'isolamento di fino a 10 cellule PP totale7 (media 4 – 5 x 106 cellule) da un singolo mouse (ceppo C57BL/6) senza alcun processo digestivo. Abbiamo osservato che la resa totale delle cellule è stata correlata positivamente con il numero di PPs e poteva essere stimata dalla seguente equazione semplice che è utile p...

Divulgazioni

Conflitti di interesse non dichiarati.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare Laura Strauss e Peter Sage per utili discussioni e supporto con analisi di citometria a flusso.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD4 antibodyeBioscience, Biolegend*17-0041-81 ,10054*For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibodyeBioscienceMA5-16536For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibodyeBioscience61-9985-82For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibodyeBioscience12-9942-82For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibodyBiolegend144610For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibodyBiolegend*, BD Bioscience145512*, 551960For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibodyBiolegend358512For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibodyeBioscience17-5773-82For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421BD Bioscience563259For detailed information see Table 1
FixableViability DyeeBioscienceL34957For detailed information see Table 1
7AADBiolegend420404For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32)BD Bioscience553141For detailed information see Table 1
Collagenase IIWorthingtonLS004176
Collagenase IVWorthingtonLS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
6-well,12-well & 96-well platesFalcon/Corning353046,353043/3596
50 ml conical tubesFalcon3520
40 µm cell strainerFalcon352340
10 ml syringe-plungerExel INT26265
RPMICorning15-040-CV
PBSCorning21-040-CM
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Orbital shakerVWRModel 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

Riferimenti

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Ricerca sul cancroproblema 141placche di Peyerfollicolare cellule T helpercentro germinale delle cellule di Bl isolamentopreparazione dei tessutisottopopolazioni linfocitarieorgani linfoidicollagenasi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati