Bir fare MPTP kaynaklı Parkinson hastalığı modelinde kendiliğinden hareket davranış değerlendirme

Özet

Biz bir fare modeli için Parkinson hastaligi MPTP ve davranışsal değerlendirme motor işlevleri ölçmek için silindir ve açık alan testleri kullanarak kullanarak kurulması tanımlamak. O zaman bir örnek olarak PD ilaçların çalışmada bu modeli uygulamak nasıl göstermek için L-DOPA kullanın.

Özet

Parkinson hastalığı (PD) sallayarak, sertlik, hareket ve demans yavaşlık olgusu neden sık görülen nörodejeneratif bozukluğu hastalığı var. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) bazı Parkinson benzeri semptomlar beynin gözlemliyorum nigra dopaminerjik nöronlarda yok ederek yol açabilir. Böylece çeşitli hayvan çalışmalarda PD modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. Burada, fareler MPTP enjeksiyonları almak (20 mg/kg/gün) yedi gün ve davranış testleri için sekizinci gününde yapılmaktadır. Bu model PD çalışmada verimli bir şekilde uyarlanmıştır. Davranış testleri silindir test ve açık alan testi içerir. Silindir deney ne zaman farklı bir ortam koymak açık onların paws kaldırmak için hayvanların yeteneği tespit etmek için kullanılır. PD model fare göstermek arching — fare sırtını arches — pençe liftings azalma sayısı. Bu test çalıştırmak kolaydır. Açık alan testinin koşma, yürüme ve hareketsiz kalan fareler harcama miktarını tespit etmek için kullanılır. Biz yazılım kullanarak açık alanı hayvanların hareketleri analiz ve verileri elde etmek. Son olarak, biz L-DOPA kullanımı, en yaygın olarak kullanılan PD ilaç, PD uyuşturucu çalışma için bu modeli uygulamak nasıl göstermek için bir örnek olarak. Bizim sonuçları MPTP nörotoksisite L-DOPA tarafından azaltılabilir motor açığı indükler gösterir.

Giriş

Parkinson hastalığı (PD), büyük bireyler arasında en yaygın hastalıklardan biri uzun vadeli nörodejeneratif bozukluğu¹_. olur Hastalar her zaman sallayarak, sertlik, hareket ve zaman²daha da kötüye demans yavaşlık olgusu göster. Duyusal gibi diğer belirtiler uyku ve duygusal sorunlar da yaygın²gözlenir. PD hala belirsiz nedeni, ama genel olarak gözlemliyorum nigra³dopaminerjik nöronlarda kaybı ve geliştirme Lewy organları ve Lewy neurites'ın çeşitli bölgelerinde neden genetik ve çevresel faktörler içeren inanılıyor beyin⁴_.

PD çalışmaları arasında 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)⁵ yaygın deneysel modellerinde bazı PD belirtiler eğlence içinde uyarlanmıştır. 1984 yılında MPTP enjeksiyonu Sincap maymunlar içinde parkinsonizm⁶' sonuçlandı Langston vd. önce buldum. MPTP kemirgen modeli PD biyomarker olduğunu, Lewy organları, varlığını göstermez rağmen MPTP beyin⁷gözlemliyorum nigra dopaminerjik nöronlarda yok ederek Parkinson benzeri belirtilere neden olmaktadır. Diğer uyuşturucu model olanlar 6-hydroxydopamine (6-OHDA)⁸ ve 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +)⁹tarafından indüklenen gibi PD için karşılaştırıldığında, MPTP enjeksiyon yürütmek kolay ve MPTP modeli daha kısa sürer. Fareler alma MPTP enjeksiyon (20-30 mg/kg/gün) için yedi gün ve davranış testleri sekizinci gün¹⁰üzerinde gerçekleştirilir.

Açık alan test¹¹ ilk Calvin S. Hall, bir Amerikan¹²tarafından geliştirilmiştir. Çeşitli çalışmalarda davranışları farklı türde test edilir. Araştırmada, Parkinson hastalıkları üzerinde odaklanan davranışları gezisidir faaliyetleri gibi ve hareket hızını hayvanın hareket etme yeteneği etkilenir görmek için test edilmiştir. PD hayvanlar kurulması sınamak için kullanılan diğer yöntemlere göre açık alan testinin gerekli ekipman basit ve prototip oluşturma ve veri analiz yazılımı (Örneğin, MATLAB, Excel) kolayca toplar ve grafiğini çizer için kullanılabilir çünkü yapmak kolaydır veri. Varyasyon katsayısı olan açık alan test sonucu güvenilir anlamına gelir nispeten küçük¹³, da. Diğer yöntemler üzerinde başka bir avantajı bu deneyde dahil davranışları ayırt etmek kolay olmasıdır; fare-ebilmek var olmak koşma, yürüme ya da hala ayakta. Araştırmacı ilgilinin hareketlilik değerlendirmek gerektiğinde genellikle açık alan testinin kemirgenler üzerinde kullanılabilir.

Silindir test forelimbs asimetrik kullanım testi olarak da adlandırılır. Bu testi önce tasarlarken, sıçan ön ayakları¹⁴asimetrik kullanımı test etmek için kullanılmıştır. Burada, hayvanın yat ve yeni çevreyi keşfetmek için kullanma her ikisi onun forelimbs yeteneği analiz etmek için bu test kullanırız. Zaman gözlemliyorum nigra ve corpus striatum MPTP beyin tarafından zarar hayvan sırtını kemer eğilimindedir ve daha az yat ve bilinmeyen çevre keşfetmek olasılığı olur. Bu test için kolaydır yürütmek ve ön bir sonuç verebilir. Bu genellikle ile birlikte diğer davranış deneyler bu nedenle kullanılan ancak, bu test yüksek iç değişkenliği, vardır.

L-DOPA, olarak da bilinen levodopa veya L-3,4-dihydroxyphenylalanine olan, sürüyor bir PD dopamin içinde azalma nedeni bu yana Parkinson hastalığı tedavi etmek için ortak bir yol. L-DOPA dopamin habercisi. Ama dopamin farklı olarak, beyin bölgede dopamin konsantrasyonu artan daha verimli olacağı anlamına gelir kan - beyin bariyerini geçemez. Bu kan - beyin bariyerini geçer sonra L-DOPA dopamin L-amino asit dekarboksilaz¹⁵tarafından dönüştürülür.

Burada ölçüm ve analiz bir silindir testi¹⁴ ve değiştirilmiş açık alan testi kullanarak MPTP indüklenen PD modeli farelerde motor işlevleri açıklanmaktadır. L-DOPA PD ilaçların çalışmada bu modeli uygulamak nasıl göstermek için bir örnek olarak yönetmek. Bizim sonuçları MPTP L-DOPA tarafından azaltılabilir motor açığı indükler gösterir.

Protokol

Bu çalışmada hayvan deneyleri dikkate alınarak Uluslararası, ulusal ve kurumsal kurallarına göre gerçekleştirildi. Çalışma protokolü Nankai Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. MPTP ve L-DOPA yönetim

Not: On-hafta-yaşlı kadın BALB/c fare Enstitüsü zooloji tarafından Çin Bilimler Akademisi temin edilmiştir. Fareler vardı barındırılıyor altı başına 12 h açık/koyu döngüsü (ışıkları saat 08:00-20:00), altında 21-22 ° c sabit sıcaklık ve bağıl nem % 55 ± % 5'lik kafes. Autoclaved standart fare chow aynı formülasyonu ve su ad libitum , tüm hayvanlar için verildi.

1. İklimlendirme, bir hafta sonra hayvanlar altı fareler üç gruba ayırın.
2. Grup 1 ' e (bkz. Adım 1.5) 250 µL/fare/gün tuz mayi enjeksiyonlari günden itibaren 1 gün 7 yönetmek ve intragastric yönetim gerçekleştirin (bkz. Adım 1.6) 250 µL/fare salin günde 8.
3. Grup 2' ye, 20 mg/kg mayi enjeksiyonlari yönetmek/MPTP her gün gün 1 gün 7 gün ve günde 8 250 µL/fare serum intragastric yönetim gerçekleştirin.
4. Grup 3, 20 mg/kg mayi enjeksiyonlari yönetmek/gün MPTP, 1 günden güne 7 ve 8 günde 5 mg/kg nın intragastric yönetim gerçekleştirin.
5. Mayi enjeksiyon aşağıdaki gibi yapın.
   1. İlaç 26 G iğne ile steril 1 mL şırınga yükleyin. Soluduğumuz hava--dan belgili tanımlık tenkıye ortadan kaldırmak.
   2. Scruff fare yukarı dönük olacak şekilde karnı ile. Baş, boyun ve gövde fare düz bir çizgi halinde de sabit kafa ile tutmak.
   3. Karın zarını nüfuz iğneyi açı. Küçük direniş kadar uygun bir mesafe için iğne itin ve uyuşturucu enjekte. İğne sorunsuz çekin.
6. İntragastric yönetimi aşağıdaki gibi gerçekleştirin.
   1. Steril 1 mL şırınga ilaç oral gavaj iğne ile hazırlayın. Soluduğumuz hava--dan belgili tanımlık tenkıye ortadan kaldırmak.
   2. Fare karnı yukarı bakacak şekilde tutun. Baş, boyun ve gövde fare sabit kafa ile düz bir çizgide tutmak.
   3. İğne fare vücuda paralel tutun ve fareyi'nın ağız, dil tuşuna basıp karşı üst çene içe iterek köşesinden ekleyin.
   4. Küçük dirençle hangi iğne gösterir özofagus sorunsuz giriyor, iğne uygun bir mesafede dikkatle itin. İğne ucu göğüs alt kısmı ulaşmadan önce ilaç enjekte et.
   5. İğne sorunsuz çekin.

2. silindir testi

Not: Gün 8 davranış testleri yapıldı. L-DOPA fareler 40dakika davranış testleri önce üçüncü gruba enjekte ettiler. Davranışsal test nerede hayvanlar yerleştirilmiştir aynı odada yapılmazsa, hayvanlar için 30-60 dk önce test yeni odasına iklime alıştırılacağı gerek.

1. Test 24 h MPTP son doz sonra gerçekleştirin.
2. Şeffaf cam silindir yerleştirin (yükseklik = 19,5 cm, çapı 15 cm, ağırlığı ≥1 kg =) bir tablo ortasına. Silindir çevre aydınlatma etkisini azaltmak için siyah karton ile üç taraftan kuşatır. Kamera video kaydı için karşı karşıya silindirin bir yana bırakın.
   Not: Karton ve silindir arasındaki mesafe yaklaşık 4-8 cm olmalıdır.
3. Bir kamera takmak (> 1 milyon piksel çözünürlük) ~ 40-60 cm uzakta tam silindir görünür olmasını sağlamak için silindir.
   Not: Bu ne çok yakın, ne de çok ileri hareketini video kaydederken fareyi rahatsız böylece olduğunu.
4. Bir fare teker teker silindir içine yerleştirin ve bir kez filme başlamak. 3 dakika sonra filme durdurmak.
   Not: Bu işlem sırasında sesini önlemek ya da fare davranışı etkileyen sırasındaki ışık değişiklikleri önlemek.
5. Fareyi test ettikten sonra geri ev kafesin içine yerleştirin.
6. Silindir su ile temiz ve daha sonra bu sterilize ve fare kokuları çıkarmak için iç duvarın üzerinden % 70 v/v etanol sprey. Başka bir fare içine yerleştirilmeden önce silindir kuru silin.
7. X normal hızı 0.5 oranında video oynatmak ve pençe asansörleri Her fare duvara saymak.
   Not: pençe fareyi onun hindlimbs rears asansörleri oluşur her iki ön ayakları omuz seviyesi ve toprakları yukarıda yükseltir. Bir forelimb Asansör sayılır değildir. Genellikle, bir fare silindir duvarları dokunmak onun forelimbs yükseltir. Fareyi onun forelimbs omuz seviyesinden birkaç kez sürekli iniş olmadan harekete geçiren, yalnızca bir kez sayılması.

3. açık alan testi

1. 24 saat açık alan testi MPTP dozaj sonra gerçekleştirin.
   Not: Bu silindir test aynı anda yürütülen olabilir.
2. Şeffaf açık alan tepki kutusunu hazırlamak (45 cm L 45 cm W x 25 cm H x) siyah bir bez tarafından altındaki ahşap plaka kapaklı. Bir fotoğraf makinesi tamir (> 1 milyon piksel çözünürlük) 1 m yükseklikte alanın üzerinde.
   Not: Açık alan kutusu alt rengini renk karşıtlığını videodaki emin olmak için test edilmiş fare renginden farklı olmalıdır.
3. Açık alan tepki kutusu tam video ortasında olduğundan emin olmak için fotoğraf makinesinin değiştirin.
4. Bir test fare koymak belgili tanımlık kutu ve kendisini çevre için yaklaşık 1 dakika inceleyin: fare izin.
5. Kayıt bir 5 dk video kamera kullanarak bilgisayara bağlı.
6. Hareket izleme şekil, statik dağılımı almak için yazılım araçları (Örneğin, MATLAB) kullanarak video analiz (hız < 1 cm/s), yürüme (hız 1-20 cm/s) ve çalışan (hız > 20 cm/s) zaman, seyahat toplam mesafe ve ortalama sınanan her fare hızı.
   Not: video analiz ederken, biz tüm vücut fare takip ediyoruz. Bir vücut ortalama hızı, sürenin bölünmüş yolun toplam uzunluğu kaplı anlamına gelir. Bu nedenle, Eğer bir fare hareket etmiyor, onun anlık hız sıfır olarak düşünülebilir.
7. Açık alan tepki kutusunda herhangi bir dışkı temizleme. % 70 etanol üstünde belgili tanımlık kutu sprey ve onu silin.

Sonuçlar

Silindir testinde farelerde (Grup 2) farelerde (Grup 3) MP ile tedavi rears bir artış gözlenmiştir iken MPTP ile günden itibaren 1 gün 7 ve günde 8 ile karşılaştırıldığında salin tedavi fareler (Grup 1), serum fizyolojik tedavi rears duvara azalma gözlenmiştir TP günden 1'e 7 gün ve günde 8 fareler (Grup 2) ile karşılaştırıldığında L-DOPA MPTP ile günden itibaren 1 gün 8 (Şekil 1) gün 7 ve serum fizyolojik tedavi.

Tartışmalar

Beyin gözlemliyorum nigra dopaminerjik nöronlarda imha nedeniyle MPTP fareler⁷' Parkinson benzeri belirtilere neden olmaktadır. PD, hastalarda motor anormallikler akinezi ve sertlik¹⁵de dahil olmak üzere etkili bastırılması ile normal günlük aktiviteler korumada yardımcı olur çünkü L-DOPA PD için en çok tercih edilen ilaç hiç klinik kullanımı beri bu olan. Fareler silindir test ve MPTP modeli eğitim için kullanılan olabilir açık alan test gibi davra...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Ruiboxing Company	RBX-64175
Camera	BASLER	acA645-100gm
Cylinder test	Made in-house at Nankai University	N/A
Excel	Microsoft	N/A
Levodopa	Sigma-Aldrich	72816
Matalb 2017a	Mathworks	N/A
Mice	Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences	Balb/c	Adult female mice(10 weeks)
MPTP	Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai	S31504-500mg
Open field test	Made in-house at Nankai University	N/A
Syringe	Solelybio	S-xsgwz-w	Irrigation
Syringe	Jiangxi Fenglin Medical Application Co.	hc3824	Intraperitoneal injection