ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

Summary

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן

Abstract

אלקליין פוספטאז (ALP) הוא אנזים נפוצות הביע בתאים prokaryotic והן האיקריוטים. זה ה מזרז הידרוליזה של פוספט monoesters של מולקולות רבות ב- pH בסיסי והוא ממלא תפקיד חיוני בחילוף החומרים פוספט. בבני אדם, ALP האיקריוטים הוא אחד האותות אנזימטי שנמצאות בשימוש תכוף ביותר באבחון מחלות שונות, כגון לחסימת מרה תוך כבדית, רככת. ב- S. aureus, ALP מזוהה באופן בלעדי על קרום התא; זה מתבטא גם כטופס הפרשה גם כן. ובכל זאת, מעט מאוד ידוע על תפקודו של ביופילמים.

מטרתו של כתב יד זה היא לפתח וזמינותו מהיר ואמין למדידת פעילות ALP biofilm S. aureus שאינה דורשת בידוד חלבון. באמצעות פוספט p-nitrophenyl (pNPP) כמו מצע, מדדנו פעילות ALP biofilm S. aureus שהוקמה בשנת 96-ובכן תרביות רקמה צלחות. הפעילות מבוססת על היווצרות של המוצר מסיסים התגובה נמדד על ידי ספיגת 405 ננומטר. מהות השיטה צלחת 96 תרביות רקמה טוב תפוקה גבוהה מספק שיטה לשחזור והרגיש ALP פעילות מבחני. ניתן להאריך אותו הדבר הניסיונית להגדיר גם למדוד סמנים מולקולריים חוץ-תאית אחרים הקשורים ביופילמים.

Introduction

אלקליין פוספטאז (ALP) מתבטא ubiquitously בשני תאי האיקריוטים prokaryotic ו-¹. זה יכול לעודד את הידרוליזה של monophosphate של מולקולות שונות כגון נוקלאוטידים, חלבונים, אלקלואידים, אסטרים פוספט ו- anhydrides של חומצה זרחתית. בבני אדם, ALP האיקריוטים קיים ברקמות רבות, כולל הכבד, עצם, המעי ו השליה². זה משחק תפקידים חשובים זירחון חלבונים, צמיחת תאים, אפופטוזיס, תהליכים בתאי גזע, כמו גם מינרליזציה השלד נורמלי. ALP האיקריוטים הוא גם מחוון מפתח נסיוב לנוכחות של מחלות עצם, כבד, ובאיברים אחרים רקמות/כאשר מוגבה^3,4.

Prokaryotic ALP זוהתה במגוון של תאים חיידקיים, כולל e. coli⁵,^6, S. aureus⁷ וכמה חיידקים שכיחים של כרס מעלי גרה קרקעות⁸. פעילות ALP חיידקי שימשה ביוסנסור זיהוי חומרי הדברה, מתכות כבדות⁹ ו זיהום בקטריאלי¹⁰. הביטוי המכונן של ALP שימש כדי לזהות Staphylococci¹¹ וכדי להבדיל בסרישיה Enterobacter¹². בהמשך הוא הציע כי ייצור ALP המכונן הוא מתואם עם פתוגניות staphylococci¹³. למרות ALP נחקרה הגדרות שונות^3,4, עדיין מעט הוא דיווח על הפעילות שלה פונקציה בתרבויות biofilms.

ממבנה biofilm תועד חיים חיידקי מתפקדת באופן שונה לעומת שלו עמיתו של תא החיידק אל-אווירני עצמאי¹⁴. ב- S. aureus, היווצרות biofilm זוהתה במגוון תנאים קליניים וחשבונות עמידות לאנטיביוטיקה, דלקת כרונית^15,16. דווח כי הרבה מולקולות להימצא במטריצה biofilm כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, אך המנגנון של ביופילמים אינו מובן במלואו¹⁴. כדי להבין את התפקיד של ALP ב ביופילמים, אנו תרבותי S. aureus biofilms ב 96 תרביות רקמה טוב צלחות, מדדו את הפעילות ALP באמצעות פארא-nitrophenylphosphate (pNPP).

כבר בשימוש נרחב כדי למדוד ALP פעילות^6,17,18, והיא מצע מוכן לשימוש עבור ALP pNPP המולקולה. זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים המבוסס על ההמרה של פוספט פארא-nitrophenyl (pNPP) כדי פארא-nitrophenol וכתוצאה מכך מוצר צבעוניים-405 ננומטר. לעומת אחרים assay ALP קונבנציונליים, כגון agarose ג'ל אלקטרופורזה¹⁹, משקעים agglutinin (WGA) נבט חיטה, WGA-HPLC²⁰, וזמינותו הזה הוא מאוד ספציפי, רגיש, קל, והם הכי חשוב, מאפשר גבוהה תפוקה.

Protocol

1. הכנה בינונית

1. להכנת 1 ליטר של ציר סויה Tryptic (TSB): לתוך 1 L של מים מזוקקים, להוסיף 15 גרם של הלבלב תקציר של קזאין, 5 גר' papaic תקציר של ארוחה סויה, דור 3 של נתרן כלורי, 2.5 גר' דקסטרוז ו- 2.5 גר' dipotassium פוספט. לעקר לפני השימוש.
2. עבור Tryptic סויה אגר (TSA), להוסיף 15 גרם של אגר 1 ליטר של TSB, החיטוי. אז תן לזה להתקרר עד לטמפרטורת החדר. בשלב הבא, יוצקים ביחס של 20 מ"ל לכל צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ).
3. Biofilm תרבות בינוני: להוסיף 10 גרם של גלוקוז 1 ליטר של TSB בלוק. לחטא על-ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 µm.

2. S. aureus ביופילמים בצלחת תרביות רקמה טוב 96

הערה: Biofilm S. aureus הוא תרבותי כפי שתואר לעיל^6,21.

1. לחסן המושבה בודדים אחד של S. aureus מ TSA 10 מ"ל של TSB ולגדול בן לילה ב 37 º C.
2. לדלל את התרבות לילה לתוך 10 מ"ל של TSB/גלוקוז (10 גרם/ליטר) ביחס של 1: 100 (v/v). מערבולת בעדינות כדי לערבב על ריכוז עקבית.
3. להעביר 200 מ של תרבות מדולל לתוך סך של 18 וולס (יותר לקבוצות ניסיוני, כאלה שאינם biofilm פקד להציע יחסים ALP פעילות⁶) מ 96 אחד טוב בצלחת. להשתמש שלישיות עבור כל נקודה בזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות. ראה שלב 3.2.
4. דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה biofilm היווצרות^6,21.
5. Decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
6. לשטוף כל טוב עם 1 x פתרון פוספט buffered (PBS, pH 7.4), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 15,000 x g ו decant את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.

3. מדידה של ALP פעילות ב- S. aureus Biofilm

הערה: פעילות ALP נמדדה כפי שמתואר^6,18.

1. להוסיף 75 מ של מצע ALP במאגר המורכב pNPP זמינים מסחרית כדי מכל קידוח מהשלב 2.6 ולהתחיל את הזמן הקלטה. לתעד כל נקודת זמן דולר.
2. לאחר דגירה לזמן מגוונת: 0 min (בקרה), 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות, ו- 75 דקות בהתאמה, להוסיף µL 75 של NaOH M 5 כדי לעצור את התגובה.
3. Centrifuge את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 15,000 x g.
4. העברת µL 100 של תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה טוב 96 למדידה ערכי צבע מוחלטים.
5. למדוד את ספיגת מכל טוב-405 ננומטר באמצעות 96 ובכן צלחת הקורא. לנצל את הזמן 0 דקות הצבע בארות כדי לשלוט על רעש רקע של 405 ננומטר.
6. חזור על הניסוי כולו בשלושה לוחות טוב 96 בודדים.

תוצאות

איור 1 מציג תוצאה נציג של ALP פעילות מתרבויות biofilm של S. aureus 96 צלחות טוב תרביות רקמה. 75 μL של פתרון זמין מסחרית pNPP נוספה כל טוב, מודגרות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה לזמנים שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות, בהתאמה) μL 75 של 5 M NaOH נוספה כדי לעצור ...

Discussion

ב- assay שלנו, השתמשנו pNPP כמו המצע אלפ. זהו הפתרון עובד המיועד אליסה, דילול לא נדרש. לאחר הידרוליזה על ידי ALP, מוצר צהוב מפתחת, ניתן למדוד-405 ננומטר. בסוף התגובה אנזימטיות, אנו בקצרה centrifuged את הצלחת היטב 96, להעביר את תגובת שיקוע צלחת טריים טוב 96 כדי למדוד את ספיגת באמצעות קורא צלחת. מצאנו כי צנטריפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................  2.50 Dipotassium phosphate..................2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom