Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

Resumen

El protocolo actual describe métodos para establecer modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras de cáncer gástrico quirúrgico. Los métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Resumen

El uso de modelos preclínicos para avanzar en nuestra comprensión de la biología tumoral e investigar la eficacia de los agentes terapéuticos es clave para la investigación del cáncer. Aunque hay muchas líneas celulares de cáncer gástrica establecidas y muchos modelos de ratón transgénicos convencionales para la investigación preclínica, las desventajas de estos modelos in vitro e in vivo limitan sus aplicaciones. Debido a que las características de estos modelos han cambiado en la cultura, ya no modelan la heterogeneidad tumoral, y sus respuestas no han sido capaces de predecir respuestas en humanos. Por lo tanto, se están desarrollando modelos alternativos que representan mejor la heterogeneidad tumoral. Los modelos de xenoinjerto sorinjertos derivados del paciente (PDX) preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, conservan la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral. Sin embargo, por lo general toma 4-8 meses para desarrollar un modelo de PDX, que es más largo que la supervivencia esperada de muchos pacientes gástricos. Por esta razón, establecer líneas celulares primarias de cáncer puede ser un método complementario eficaz para los estudios de respuesta a fármacos. El protocolo actual describe los métodos para establecer modelos PDX y líneas celulares primarias de cáncer a partir de muestras quirúrgicas de cáncer gástrico. Estos métodos proporcionan una herramienta útil para el desarrollo de fármacos y la investigación de la biología del cáncer.

Introducción

El cáncer gástrico es el quinto cáncer más común en todo el mundo y la tercera causa de muerte por cáncer. En 2018, más de 1.000.000 nuevos casos de cáncer gástrico fueron diagnosticados en todo el mundo, y se estima que 783.000 personas murieron por esta enfermedad¹. La incidencia y mortalidad del cáncer gástrico sigue siendo muy alta en los países del noreste de Asia^2,3. A pesar de los progresos significativos en el campo de las terapias oncológicas, el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico avanzado sigue siendo deficiente, con una tasa de supervivencia de cinco años de aproximadamente 25%^{4,5,6, 7,}. Por lo tanto, es urgente el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer gástrico

El tratamiento del cáncer gástrico es desafiante debido a su alta heterogeneidad^8,9. Por lo tanto, la cuestión de cómo abordar los desafíos de la heterogeneidad tumoral para realizar la medicina de precisión es fundamental para la investigación del cáncer. Los modelos in vitro e in vivo desempeñan un papel crucial para dilucidar los mecanismos heterogéneos y la biología del cáncer gástrico. Sin embargo, aunque hay numerosas líneas celulares de cáncer gástrico y muchos modelos de ratón transgénicos convencionales para la investigación preclínica, las desventajas de estos modelos limitan sus aplicaciones¹⁰. Debido a que las características de estos modelos han cambiado en el cultivo, ya no modelan la heterogeneidad tumoral, y sus respuestas no han sido capaces de predecir respuestas en humanos¹¹. Estos problemas limitan severamente la posibilidad de identificar subgrupos de pacientes con cáncer que responderán a los medicamentos dirigidos. El cultivo a corto plazo de tumores primarios proporciona una manera relativamente rápida y personalizada de investigar las propiedades farmacológicas anticancerígenas, que probablemente será el sello distintivo del tratamiento personalizado contra el cáncer.

Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) se prefieren como modelo preclínico alternativo para la elaboración de perfiles de respuesta a fármacos^12. Además, los modelos PDX ofrecen una poderosa herramienta para estudiar la iniciación y progresión del cáncer^13,14. Los modelos PDX preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, conservan la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral^15,16. Sin embargo, la limitación de los modelos PDX ampliamente utilizados es la baja tasa de éxito para establecer y propagar tumores sólidos humanos en serie. En este estudio, se describen métodos decentemente exitosos para establecer modelos PDX y líneas celulares primarias.

Protocolo

Este estudio humano fue aprobado por la Junta de Revisión de la Etica Institucional del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen (SYSUCC, Guangzhou, China). El estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Sun Yat-sen. Nota: todos los experimentos se realizaron de conformidad con las leyes y directrices institucionales pertinentes, incluida la Orientación para la protección de la exposición ocupacional contra patógenos transmitidos por la sangre.

1. Preparación de la muestra

1. Obtener los tejidos del cáncer gástrico (paso 0 de P0) directamente de la operación. La muestra tumoral debe ser mayor de 0,5 cm³.
2. Preparar 3-4 ml de solución en stock: por ejemplo, RPMI-1640 medio (1x) complementado con suero bovino fetal 10% (FBS), 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina.
3. Poner la muestra de tumor fresco en la solución de stock a 4 oC durante no más de 4 horas.

2. Establecimiento del modelo PDX (Figura 1)

1. Para asegurar un área quirúrgica estéril, desinfecte todos los materiales con luz ultravioleta durante más de 30 minutos antes de transferirlos al laboratorio animal.
   Nota: la sala de operaciones debe ser desinfectada con luz ultravioleta durante 30 minutos, antes de limpiar el escritorio con desinfectante de suppositoria de ácido isocyanúrico dicloro. A continuación, se utiliza povidona-yodo para desinfectar la piel.
2. Usando fórceps y tijeras, disecciona cuidadosamente los tejidos tumorales y recorta en varios trozos pequeños (aproximadamente 1 mm³ cubos) en condiciones estériles.
3. Anestetizar hembras de 5 a 7 semanas de edad NOD-SCID-IL2rg (NSG) ratones por exposición a 1-1.5% isoflurano con una máquina de anestesia.
   1. Anestetiza el ratón hasta que deje de luchar pero mantiene la respiración uniforme.
      NOTA: El tubo de 50 ml es un equipo simple que funciona de forma similar a una máquina de anestesia. El uso de pomada veterinaria para evitar la sequedad es innecesario debido al corto tiempo de funcionamiento.
4. Haga una incisión de 1 cm en ambos flancos dorsales usando tijeras estériles e implante una pieza tumoral en cada flanco del ratón.
   1. Para asegurarse de que la pieza tumoral no se deslice, utilice fórceps estériles para interrumpir el tejido subcutáneo. Luego, corta un pedazo del tejido tumoral y colócalo en el sitio profundo.
5. Cierre el área del implante por sutura subcutánea con agujas de sutura quirúrgicas y marque las orejas del ratón con etiquetas de oído etiquetadas
6. Esterilice la herida con yodo.
7. Coloque suavemente los ratones en una jaula vacía después de la cirugía mientras mantiene la recumbencia esternal. Prestar mucha atención a la condición de los ratones; se despiertan y comienzan a caminar aproximadamente 3-4 minutos más tarde. Coloque ratones que se sometieron a cirugía en otra jaula nueva separada de aquellos que no fueron sometidos a cirugía.
8. Evaluar el tamaño del tumor por palpación del sitio de implantación. Mida los tumores con una pinza Vernier dos veces por semana.
9. Una vez que el tumor alcanza los 10 mm de diámetro, la condición animal empeora, o el tumor ulcera, eutanasia el ratón con un método aprobado por la IRB. Reimplant extraje fragmentos de tumores frescos en 2 nuevos ratones para el paso, o almacenó temporalmente los especímenes en PBS en hielo para el aislamiento de las líneas celulares primarias.

3. Criopreservación de tejidos

NOTA: Esta parte hace referencia principalmente a los métodos para el kit Cryo de Live Tissue Kit. Los principales kits y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Eutanasia a los ratones con un método aprobado por el IRB cuando el tumor sea superior a 10 mm de diámetro.
2. Usando fórceps y tijeras estériles, aísle lentamente el tumor de los ratones.
3. Lave los tejidos tumorales con DPBS en un plato de 10 cm. Diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos de sangre y tejido conectivo con fórceps y tijeras.
4. Cortar los tejidos tumorales a un espesor máximo de 1 mm con un molde.
5. Lave las rodajas con DPBS en un plato de 10 cm.
   NOTA: El proceso de vitrificación implica el uso de tubos etiquetados V1/V2/V3 en los pasos 3.6-3.8. Los ingredientes principales son DMSO y sacarosa.
6. Transfiera las rodajas en el tubo V1 con fórceps, e incubar el tubo a 4 oC durante 4 minutos.
7. Vierta la solución V1 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas en el tubo V2 con fórceps, e incubar el tubo V2 a 4 oC durante 4 minutos. Rodar e invertir el tubo brevemente, y colóquelo a 4 oC durante otros 4 minutos.
8. Vierta la solución V2 y las rodajas en un plato de 10 cm. Transfiera las rodajas en el tubo V3 con fórceps, e incubar el tubo a 4 oC durante 5 minutos. Rodar e invertir el tubo brevemente, y colocarlo a 4 oC durante al menos 5 minutos. Asegúrese de que las rodajas se hundan en la parte inferior del tubo.
   1. Si varias rodajas permanecen flotantes, rodar e invertir el tubo brevemente, y colocar el tubo a 4 oC de nuevo hasta que todas las rodajas se hundan por completo; si es necesario, deseche las rebanadas flotantes.
9. Vierta la solución V3 y las rodajas en un plato de 10 cm.
10. Corte los soportes de tejido a la longitud adecuada y colóquelos en una gasa estéril. Transfiera las rodajas a los soportes. Envuelva los soportes con la gasa, y colóquelos en nitrógeno líquido usando fórceps, seguido de incubación durante 5 min.
11. Etiquete los viales criogénicos con la información del tejido.
12. Transfiera los soportes con rodajas de tejido en viales criogénicos, que se almacenan en nitrógeno líquido.

4. Aislamiento de celdas primarias (Figura 2)

1. Esterilice fórceps y tijeras con vapor de alta presión a 121 oC durante 30 min.
2. Reseque las muestras de cáncer gástrico de especímenes resecados o tejidos PDX cosechados. Coloque los tejidos sobre hielo y, a continuación, transfiera los tejidos a un plato de cultivo estéril de 10 cm.
3. Diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos de sangre y tejido conectivo con fórceps y tijeras.
4. Lave los tejidos tumorales una vez con DPBS que contenga 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina en un plato de 10 cm.
5. Cortar el tejido tumoral en 1 mm³ trozos en la tapa del plato; el espesor máximo de cada pieza debe ser de 1 mm.
6. Transfiera los tejidos a un tubo centrífugo de 50 ml con aproximadamente 7 ml de colágeno tipo 1 y solución de tripasina (1:14). Vórtice brevemente la mezcla.
7. Incubar el tubo en un baño de agua a 37 oC durante 30-40 min. Vórtice la mezcla cada 5 min.
8. Añadir un volumen igual de medio RPMI-1640 (1x) complementado con 10% FBS al tubo. Vórtice bien la mezcla.
9. Transfiera la mezcla a un nuevo tubo centrífugo de 50 ml mediante una filtración lenta a través de un filtro de 40 m.
   NOTA: Utilice filtros de 40 m para garantizar una mayor proporción de células cancerosas. Si es necesario, se pueden utilizar filtros de 100 m para preservar más tipos de células, como las células inmunológicas.
10. Centrifugar los filtrados a 113-163 x g durante 5-7 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
11. Lave el pellet con 5 ml de PBS y retire cuidadosamente el sobrenadante.
12. Si el pellet es rojo, contiene muchos eritrocitos. Resuspenda suavemente el gránulo con 500 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Después de una incubación de 5 minutos, agregue 5 ml de PBS y retire cuidadosamente el sobrenadante.
13. Resuspenda el pellet con medio de cultivo, y transfiera la mezcla a un plato estéril de 10 cm.
14. Sustituya el medio por un medio que contenga suero cada 2-3 días.
15. Pasar las células primarias usando trippsina/EDTA cuando alcancen el 50% de confluencia.

Resultados

Aquí, los tejidos tumorales de una operación se conservaron en solución en stock hasta el siguiente paso. En 4 horas, los tejidos tumorales fueron cortados en trozos pequeños e implantados en los flancos dorsales de ratones NSG que habían sido anestesiados usando algodón empapado de isoflurano. Los tumores de más de 1 cm³ podrían ser resecadas para su implantación en nuevos ratones (Figura1)o cortadas cuidadosamente y conservadas en nitrógeno líquido siguiendo el protoc...

Discusión

El cáncer gástrico es una enfermedad agresiva con opciones terapéuticas limitadas; así, los modelos de cáncer gástrico se han convertido enun recurso crítico para permitir estudios de investigación funcional con traducción directa a la clínica 4,^8,17. Aquí, hemos descrito los métodos y protocolos para establecer modelos de PDX de cáncer gástrico y líneas celulares primarias. Es importante destacar que las caracter...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017