フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

要約

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。

要約

提示された方法またはわずかに変更されたバージョンは、臨床腫瘍学で使用される様々な抗癌治療の特定の治療応答および副作用を研究するために考案された。放射線療法や多数の抗がん剤によって引き起こされる、遺伝子毒性ストレス後のDNA損傷応答の定量的および縦方向の分析を可能にします。この方法は、DNA損傷応答のすべての段階をカバーし、DNA二本鎖切断(DSB)の誘導および修復、修復障害の場合のアポトーシスによる細胞周期停止および細胞死のエンドポイントを提供する。これらの測定値を組み合わせることで、細胞周期依存的な治療効果に関する情報が提供され、細胞増殖とDNA損傷に対する対処メカニズムの相互作用を詳細に研究することができます。化学療法剤や電位化放射線を含む多くのがん治療薬の効果は、特定の細胞周期相に応じて制限されるか、または強く変化するので、相関分析は、治療効果を評価するために堅牢で実行可能な方法に依存しています。細胞周期特異的な方法でDNAに。これは、シングルエンドポイントアッセイと提示された方法の重要な利点では不可能です。この方法は、任意の特定の細胞株に限定されず、腫瘍および正常組織細胞株の多数で徹底的にテストされている。環境リスク因子評価、薬物スクリーニング、腫瘍細胞における遺伝的不安定性の評価など、放射線腫瘍学以外の多くの分野で包括的な遺伝毒性アッセイとして広く応用できます。

概要

腫瘍学の目標は、正常な細胞に害を与えることなく、癌細胞を殺すか、または不活性化することです。多くの治療法は、がん細胞に遺伝子毒性ストレスを直接的または間接的に誘導するが、正常な細胞にも広がる治療法もある。化学療法または標的薬物は、照射された腫瘍1、2、3、4、5の放射線感受性を増強するために放射線療法と組み合わされることが多く、これは、正常な組織の損傷を最小にするために放射線量。

電化放射線および他の無毒剤は、塩基修飾、鎖架面および単一または二本鎖の破断を含む異なる種類のDNA損傷を誘発する。DNA二本鎖切断(DSB)は最も重篤なDNA病変であり、その誘導は放射線化学療法における電光放射線および様々な細胞静止薬の細胞殺傷効果の鍵である。DSBはゲノムの完全性を損なうだけでなく、突然変異6、7の形成を促進する。そのため、異なるDSB修復経路、およびアポトーシスのような回復不能な損傷を受けた細胞を排除するメカニズムが進化中に開発された。DNA損傷応答全体(DDR)は、DNA損傷認識および細胞周期停止から到達するシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって調節され、DNA修復を可能にし、^{修復障害の}場合にプログラムされた細胞死または不活性化に8。

提示されたフローサイトメトリック法は、DSB誘導および修復、ならびに修理失敗の結果をカバーする1つの包括的なアッセイで、ジェノト毒性ストレス後のDDRを調査するために開発されました。広く適用されたDSBマーカーγH2AXの測定と、古典的なsubG1分析とカスパーゼ-3活性化のより具体的な評価を用いて、細胞周期およびアポトーシスの誘導の分析を組み合わせた。

これらのエンドポイントを1つのアッセイで組み合わせることで、時間、労力、コストコストを削減できるだけでなく、DSB誘導および修復の細胞周期特異的測定、ならびにカスパーゼ-3活性化を可能にします。このような分析は、独立して行われるアッセイでは不可能ですが、毒性ストレス後のDNA損傷応答を包括的に理解するために非常に関連性が高い。細胞増殖性化合物などの多くの抗癌剤は、細胞分裂に対して向けられており、その効率は細胞周期段階に強く依存する。異なるDSB修復プロセスの可用性は、修復精度のために重要である細胞周期段階および経路選択にも依存し、順番にセル9、10、11の運命を決定する。 ¹².さらに、DSBレベルは、ジェノキシック化合物または放射線の線量だけでなく、細胞のDNA含有量にも依存するため、DSBレベルの細胞周期特異的測定はプール分析よりも正確です。

この方法は、神経膠芽^腫13の抵抗機構を克服し、骨肉腫14、15における電離放射線と標的薬物との相互作用を解剖するために、異なる放射線療法の有効性を比較するために使用されてきた。および非定型奇形性ラブドイド癌¹⁶.さらに、記載された方法は、間葉系幹細胞17、18、19、20、21に対する無線および化学療法の副作用を分析するために広く使用されている。 ^22,23,24, 治療誘発正常組織損傷の修復に不可欠であり、再生医療に潜在的な応用を有する.

プロトコル

1. 準備

1. 任意のタイプの培養容器に≥1 x 10^5セル/サンプルを開始材料として調用します。
   1. 例えば、U87神経膠芽腫細胞を電分放射線に曝露した後の時間経過実験を行う:T25フラスコのサブコンフルエントU87細胞を各時間点に照射する。DSB修復(γH2AXレベル)と遅い時間ポイント(24時間から96時間まで)の動態に従って、残留DSBレベル、細胞周期効果およびアポトーシスを評価するために、早期のタイムポイント(照射後15分から8時間まで)を選択します。
      注:プロトコルは、照射実験または任意の特定の細胞株に限定されない。それは異なった種およびさまざまな処置条件から、あらゆるタイプの多数の細胞株とテストされた。
2. 10%の余分な容積を含む次の解決策を準備する。
   1. リン酸緩衝生理食液(PBS)中の4.5%パラホルムアルデヒド(PFA)からなる固定溶液の試料1サンプルあたり2mLを調製する。溶液を新鮮に準備します。煙フードの下でゆっくりと撹拌しながら80°Cに加熱することにより、PBSでPFAを希釈します。熱損失を防ぐために、フラスコをアルミホイルで覆います。溶液を室温まで冷やし、最終音量を調整します。折りたたまれたセルロースフィルター、グレード3hw(材料の表を参照)を通して溶液を渡します。
      注意:PFAの煙は有毒です。ヒュームフードの下でこの手順を実行し、PFA廃棄物を適切に処分します。
   2. -20°Cで氷冷H2 O.ストアで70%エタノールからなる透過性溶液の試料1サンプルあたり3mLを調製する。
   3. PBSで0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)からなる洗浄液の試料1サンプル当たり7mLを調出す。
   4. 抗体希釈剤としてPBSで3%BSAの試料当たり100μLを調出す。
   5. PBSで1 μg/mL 4'、6-ジアミジン-2-フェニリンドル(DAPI)からなるDNA染色溶液の試料100~250μLを調製します。
3. 遠心分離機を 15 mL チューブ 200 x gおよび 7 °C で 5 分に設定します。遠心分離機を冷却し、すべての遠心分離ステップにこれらの設定を使用してみましょう。

2. サンプルコレクション

1. 付着細胞を処理する場合(例えば、T25フラスコで増殖したU87神経膠芽腫細胞は、37°Cおよび5%の二酸化炭素雰囲気で10%の胎児ウシ血清を補充した5mLのDulbeccoの改変イーグル培地で、ステップ2.1.1を続ける。および 2.1.2.懸濁セルの場合は、ステップ 2.1.2 に直接進みます。
   1. 遠心管で培地を回収します。トリプシン、エチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)または他の細胞剥離剤の使用を含みよいルーチン細胞培養法を使用して細胞を剥離する。
      1. U87細胞の場合、プレウォームPBSおよびトリプシン/EDTA(材料表参照)を37°Cに、1mLのPBSで細胞層を洗浄し、1mLのトリプシン/EDTAで細胞をインキュベートし、フラスコをタップして細胞剥離をサポートします。すべての洗浄液とチューブ内の細胞懸濁液を培地で回収します。
   2. 細胞を遠心分離し、培地を廃棄し、PBSの1mLで細胞を再懸濁する。
2. 細胞を上下に数回ピペ状にして、単一の細胞懸濁液を確保し、2 mLの固定溶液(4.5%PFA/PBS、3%最終濃度)を有するチューブに細胞懸濁液を移します。
   注意:PFAの煙は有毒です。ヒュームフードの下でこの手順を実行し、PFA廃棄物を適切に処分します。
3. 細胞を室温で10分間インキュベートします。
4. 細胞を遠心分離し、デカンテーションによって上清を廃棄する。
5. チューブをタップして細胞ペレットを緩め、70%エタノールの3 mLで細胞を再中断します。次のステップに直接進むか、サンプルを4°Cで数週間保存します。

3. 洗浄・染色

1. 細胞を遠心分離し、デカンテーションによって上清を廃棄する。
2. チューブをタップしてセルペレットを緩めます。洗浄液(0.5%BSA/PBS)の3mLで細胞を再懸濁し、遠心分離機を廃棄し、上清を廃棄する。
3. 3 mL で洗浄工程 1x を繰り返し、1 mL 洗浄液で 1x を繰り返します。最後のステップでは、ピペッティングによって慎重に上清を廃棄します。ペレットを吸引しないように注意してください。
4. 抗体希釈剤(3%BSA/PBS)を用いて100μL/試料でγH2AX、ホスホヒストンH3(Ser10)およびカスパーゼ-3(材料表参照)に対する抗体を希釈する。
5. チューブをタップして細胞ペレットを緩め、ステップ3.4で調製した抗体溶液の100μLで細胞を再中断する。このステップ以降は、サンプルを暗闇の中に保管してください。
6. サンプルを室温で1時間インキュベートします。
7. 細胞を遠心分離し、ピペッティングによって慎重に上清を廃棄します。ペレットを吸引しないように注意してください。
8. チューブをタップして細胞ペレットを緩め、DNA染色溶液(1μg/mL DAPI/PBS)の100~250μLで細胞を再定置します。
   1. 1-2 x10⁵セルが存在する場合は 100 μL を使用し、セル数が大きくなります (≥1 x 10⁶セルの場合は 250 μL)。次のステップに直接進むか、最大2週間4°Cで暗闇の中でサンプルを保存します。
      注:一部の細胞型では、DAPI濃度を最適化し、細胞周期相の分離を改善するのに役立ちます。
9. 35 μmのメッシュ細孔サイズのサンプルチューブのセルストレーナーキャップを通してサンプルをピペットします。

4. 測定

1. サンプルを氷の上に置き、表1に従って光学セットアップで設定されたフローサイトメーター(材料の表を参照)を開始し、プライムボタンを押します。必要に応じて、紫外線レーザー(355nm波長)を別々に切り替え、適切なソフトウェアを使用して電力を10mWに設定します。
2. 取得ソフトウェアを開き(「材料の表」を参照)、ログインして、ブラウザツールバーの[新しい実験]ボタンをクリックして新しい実験を作成します。
3. [インスペクタ]ウィンドウを使用して実験の名前をカスタマイズし、プロット表示に [5 ログ数十年] を選択します。
4. ブラウザツールバーの[新しい標本]ボタンをクリックし、左側の「+」記号をクリックして新しいエントリを展開し、最初のチューブを表示します。それぞれのアイコンとタイプを選択して、標本(セルタイプなど)とチューブ(サンプル識別子)の名前を変更します。最初のチューブ(左の矢印のような記号)のチューブポインタをクリックして、緑色(アクティブ)に変えます。
5. [サイトメーター]ウィンドウで[パラメータ]タブを開き、表 1に従ってパラメータを選択します。不要なパラメータをすべて削除します。
   注:パラメータ名はカスタムプリセット(例:Alexa555の代わりにCy3など)によって異なる場合があります。表 1の光学フィルタと検出器の選択が一致していることを確認します。すべての蛍光体の光経路は、このセットアップでは完全に独立しており、スペクトルオーバーラップの補償は必要ありません。ただし、別の光式セットアップを使用する場合は、必要になる場合があります。
6. [ワークシート]ウィンドウを開き、図 1に従ってプロットを作成します。対応するツールバーボタンを使用して2つのドットプロットと4つのヒストグラムを描画し、軸ラベルをクリックして適切なパラメータ(フロントスキャッタ(FSC-A)対サイドスキャッタ(SSC-A)、DAPI-W対DAPI-A、DAPI-Aおよび各抗体結合のヒストグラムを選択します。蛍煙管。
7. コントロールサンプルをサイトメーターに取り付け、計測器の[実行]ボタンを押します。ソフトウェアのブラウザウィンドウで最初のチューブを選択し、取得ダッシュボードの[データ取得]ボタンをクリックします。ローボタン、ミッドボタン、ハイボタン、計測器の微調整ホイールを使用して、サンプル射出音量を調整します。[低]設定で作業するのが好ましいが、少なくとも 100 のイベント/秒を取得してみてください (取得ダッシュボードを参照)。
8. 図 1のドット プロットをガイドラインとして使用して、インスペクタウィンドウの[パラメータ]タブで FSC、SSC、および DAPI の検出器電圧を調整します。セル母集団が線形スケールで分散しすぎるように見える場合は、FSC パラメータと SSC パラメータの対数スケールに切り替えます。
9. サイトメーターのスタンバイボタンを押し、ソフトウェアのワークシートのセットアップを続行します。
   1. ポリゴン ゲートツールを使用して、FSC-A プロットと SSC-A プロットのセル母集団と長方形ゲートツールを定義して、DAPI-W プロットと DAPI-A プロットのシングルセル母集団を定義します。Ctrl キー + Gキーを押して母集団階層を表示し、既定のゲート名をクリックして名前を変更します。
   2. その後、すべてのヒストグラムを右クリックし、[人口を表示] を選択します|コンテキスト メニューのシングルセル。
10. 抗体結合蛍光体の検出器電圧を最適化し、その後制御および処理されたサンプルを取得して完全なダイナミックレンジをカバーします。信号対雑音比を最大化し、検出器の飽和を回避します。シングルセルの作成のAlexa488ピークが、コントロールでも処理されたサンプルでも切り捨てられていないことを確認します。
11. サイトメーターのスタンバイボタンを押し、必要に応じてソフトウェアのワークシートウィンドウで手順4.11.1-4.11.3を実行して、サンプル取得時の治療効果の概算を取得します。
    1. 母集団階層で単一セルを選択し、長方形ゲートツールを使用して、DAPI-W プロットと DAPI-A プロットの G1 母集団を定義します。Alexa488ヒストグラムで右クリックし、[人口を表示] を選択します|コンテキストメニューからG1。
    2. Alexa488ヒストグラムを右クリックし、コンテキストメニューから「統計ビューの作成」を選択します。統計ビューで右クリックし、[統計ビューの編集] を選択します。[統計]タブに移動し、G1 母集団の Alexa488 信号の中央値のチェックボックスを有効にします (他のすべてのオプションを無効にします)。
    3. 母集団階層内のシングルセルを選択し、インターバルゲートツールを使用して、DAPI-A、Alexa555-A(図1のCy3-A)でサブG1、M、Casp3+母集団を定義し、 Alexa647-Aヒストグラム。
12. サイトメーターの[実行]ボタンを押し、ソフトウェアの取得ダッシュボードを使用してサンプルを測定します。停止ゲートをすべてのイベントまたはセルゲート (多数の小さなパーティクルが存在する場合) に設定し、記録するイベントの数を 10,000 に設定します。
13. [次のチューブ]をクリックして新しいサンプルを作成し、ブラウザウィンドウで名前を変更し、[データの取得]をクリックして取得を開始し、データを記録して記録を開始します。
14. ファイルの選択|エクスポート |メニュー バーからテストを行い、ダイアログ ボックスで[ディレクトリエクスポート]を選択して、データを '.fcs' ファイルとして保存します。必要に応じて、後で実験を再インポートできるようにする場合は、実験を追加のzip ファイルとして保存します。
    注:既存の実験の設定は、編集で簡単に再利用できる|データなしで重複します。

5. データ評価

1. フローサイトメトリック解析ソフトウェアのサンプルブラウザに '.fcs' ファイルをドラッグ アンド ドロップします (「材料の表」を参照)。図 2に示すゲーティング戦略を適用します。次の娘のゲートに進む前に、ゲートがすべてのサンプルの対応する母集団に収まることを確認してください。
   1. すべてのサンプルに変更を適用するには、サンプルブラウザで変更されたゲートを選択し、Ctrl + Cキーを押してコピーし、親ゲートを選択し、Ctrl + Shiftキーを押してすべてのサンプルで同等のノードを選択し、Ctrl + Vキーを押して貼り付けまたは上書きします。門グループ ゲートは使用しないでください。
   2. ブラウザの最初のサンプルをダブルクリックして、SSC-A プロットと FSC-A プロットを開きます。ツールバーの[ポリゴン]ツールを使用して、解析からデブリを除外するセルの母集団 (図 2、プロット 1) を定義します。ゲートが治療関連のシフトに対応するために右上隅に向かって十分に広いことを確認しますが、セルを確実に除外するために、プロットの左下隅に向かう境界線を制限します。
   3. セルゲートをダブルクリックして新しいプロットウィンドウを開き、軸ラベルをクリックして軸をDAPI-W(垂直)とDAPI-A(水平)に変更します。長方形ツールを使用して、シングルセルの母集団(図2、プロット2)を定義し、分析からセルの二重または束を除外します(G1細胞の二重はG2およびM細胞と同じDAPI-A強度を持ちますが、かなり高いDAPI-Wです)。値)。
      注:異なるサンプルの細胞数が異なると、DNAへのDAPIの平衡結合による全体的なDAPI-A信号強度のシフトが生じます。これはセルサイクル解析には影響しませんが、これらのシフトを考慮するためにサンプルごとに単一セルゲートサンプルの右の境界線を調整する必要がある場合があります。
   4. SingleCellsゲートをダブルクリックして新しいプロット ウィンドウを開き、軸を変更して DAPI-A ヒストグラムを表示します。バイセクタツールを使用して、正常なDNA含有量(CellCycle集団)を持つ単一の細胞と、分解されたDNA(subG1集団)を有するアポトーシス細胞を区別します。 その後、ブラウザで新しいゲートを選択し、Ctrl + Rキーを押して名前を変更します (図2、プロット 3)。
   5. ブラウザでCellCycleゲートを選択し、[ツール] を選択します|生物学 |細胞周期...メニューバーからセルサイクルモデリングツールを開きます。G1、S、G2/M相の細胞の周波数を推定するには、モデルセクションでディーンジェットフォックス25、26を選択します(図2、プロット4)。コンストレイントは、モデリングのパフォーマンスが低下した場合にのみ使用します(モデルとデータの間のルート平均平方偏差を最小限に抑えます)。
   6. セルサイクル母集団のDAPI-W対DAPI-Aプロットで、G1(楕円ツール)、S(ポリゴンツール)、G2 +M(楕円ツール)フェーズのゲートを作成し、細胞周期特異的γHAX測定を可能にします( 図2、プロット5)。これは不正確な場合がありますので、DAPI-A ヒストグラムに基づく自動セル サイクル ゲーティングにはモデリング ツールを使用しないでください。
      注:全体的なDAPI信号強度の前述のシフトを考慮するために、サンプルによってDAPI-A軸サンプルに沿ってゲートを移動する必要があるかもしれません。3 つのゲートをグループとして移動するだけで、バイアスを避けるために個々のゲートの形状を変更しないでください。
   7. Bisectorツールを使用して、CellCycle 母集団の Alexa555-A ヒストグラム内のホスホヒストン H3 陽性 (M) と -陰性 (M-) 細胞を区別します (図2,プロット 6)。Ctrl を押したまま、ゲート G2 + MとM-を選択します。Ctrl キーを押しながら Shift キーを押しながら A を押して、G2 (G2+M & M-) ゲートを作成します。
   8. Bisectorツールを使用して、単一セル母集団の Alexa647-A ヒストグラム内のカスパーゼ-3 陽性 (Casp3+ ) と -否定 (Casp3-) セルを区別します (図 2、プロット 7)。未処理のコントロールにおけるCasp3+母集団の平均が ~0.8% に達するようにしきい値を設定し、高い感度を保証し、アッセイとアッセイの変動を最小限に抑えます。
   9. Ctrl キーを押しながら T キーを押してテーブル エディタを開き、図 3に従って設定します。サンプル ブラウザからテーブル エディタに異なる母集団をドラッグ アンド ドロップし、行をダブルクリックして統計、パラメータ、および名前の設定を変更します。行を選択して Del キーを押すと、セル サイクル モデリング アイコンのドラッグ アンド ドロップ後に自動的に追加される不要な行を削除します。
   10. メニューリボンの[出力]セクションのフォーマットと宛先を選択し、[テーブルの作成] をクリックしてデータを '.xlsx' ファイルとしてエクスポートします。
2. 補足ファイル 1 (FACS_Analysis_Template_(1)xlsx に従ってさらにデータ分析を行うには、テーブル計算ソフトウェア (材料の表を参照) を使用します。
   1. 数式 X' = X * 100 / Σ (すべてのセル サイクルフェーズ) を適用して合計が 100% に相当するように、異なるセル サイクルフェーズ内のセルの頻度を修正します。
      注:100%の合計からの偏差は、細胞周期モデリングの不正確さのために生じるが、通常は小さい(<5%)。
   2. 中央値のγH2AX強度を異なる細胞周期相のDNA含有量に正規化し、S相の値を1.5、G2とM相を2.0で割ります。
   3. 細胞母集団全体で結合された正規化されたγH2AXレベルを計算するには、式I_A = I_G1 * G1 +_S * S + I_G2 * G2 + I_M * M、I A、I_G1、IG2、I_G2、IMを使用します。全ての重文γH2AX強度を正規化し、G1、S、G2、M細胞はそれぞれG1、S、G2、Mの各細胞周期相における細胞の周波数を補正する。
   4. 正規化されたγH2AXレベルとsubG1およびカスパーゼ-3陽性細胞の頻度については、各サンプルから未処理コントロールの平均値を差し引きます。
   5. すべてのレプリケートサンプルから各パラメータの平均と標準偏差を計算し、結果をダイアグラムにプロットします。

結果

ヒトU87またはLN229神経膠芽腫細胞を4Gyのフォトンまたは炭素イオン放射で照射した。細胞周期特異的γH2AXレベルおよびアポトーシスは、ここに示す流れサイトメトリック法を用いて照射後48時間までの異なる時点で測定した(図3)。いずれの細胞株でも、炭素イオンは、同じ物理線量での光子放射と比較して、より低速に低下し、24~48時間で有意に上昇したγH2AXピークレベ?...

ディスカッション

注目の方法は使いやすく、二本鎖の破壊(DSB)誘導および修理、細胞周期の効果およびアポトーシス細胞死を含むDNA損傷応答の速く、正確で、再生可能な測定を提供する。これらのエンドポイントの組み合わせは、個々のアッセイよりも相互関係のより完全な画像を提供します。この方法は、放射線生物学、治療および保護の分野における包括的な遺伝毒性アッセイとして広く適用することが?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL filter tips	Nerbe plus	07-693-8300
100-1,000 µL pipette	Eppendorf	3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size	BD Falcon	352235
15 mL tubes	BD Falcon	352096
200 µL filter tips	Nerbe plus	07-662-8300
20-200 µL pipette	Eppendorf	3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011	BioLegend	613406	Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414	BD Pharmingen	560626	Dilute 1:20
BD FACSClean solution	BD Biosciences	340345	For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution	BD Biosciences	340346	For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biochrom	L 182	Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin	Biochrom	FG 0415	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Excel software	Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum)	Biochrom	S 0615	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software	LLC	online order
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw	NeoLab	11416
LSRII or LSRFortessa cytometer	BD Biosciences
MG132	Calbiochem	474787	optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+	Heraeus
Paraformaldehyde	AppliChem	A3813	Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639	Cell Signaling Technology	#3475	Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2	Integra Biosciences	155 016
Serological pipettes, 10 mL	Corning	4488
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Corning	4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)	Biomol	AG-40T-0002-C020	optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks	Greiner bio-one	690160	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA	PAN Biotech	P10-025500	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells	ATCC	ATCC-HTB-14	Example cell line used in the protocol